МУК 4.2.2234-07. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации клеток плесневого гриба Penicillium canescens PlPh33 — продуцента пектинлиазы и фитазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 06.08.2007)

6 августа 2007 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS PLPH33 — ПРОДУЦЕНТА ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.2234-07

1 октября 2007 года

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 марта 2007 г. № 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 августа 2007 г.

3. Разработаны ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет».

4. Введены в действие с 1 октября 2007 г.

5. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens PlPh33 — продуцента пектинлиазы и фитазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Биологическая характеристика Penicillium canescens PlPh33 и его гигиенический норматив

Штамм мицелиального гриба Penicillium canescens PlPh33 является продуцентом пектинлиазы и фитазы. Получен из штамма Penicillium canescens ВКПМ F-178 путем селекции. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3867D.

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар) при температуре 25 — 28 °C в течение 5 — 7 сут., pH 5,0 — 6,0. При температуре 5 и 37 °C роста колоний не наблюдается.

На среде Чапека с дрожжевым автолизатом и сусло-агаре колонии достигают максимального диаметра 5 — 6 см. Колонии радиально складчатые, средней плотности, ростовая зона плотная. Мицелий белый, конидиальная зона голубовато-серебристая, конидиогенез обильный. Обратная сторона палевая, буроватая, со временем темно-коричневая.

При микроскопическом исследовании конидиеносцы двухъярусные, терминальные, фуркатные, шероховатые, длиной 150 мкм, шириной 3 — 4 мкм. Метулы шероховатые, размером 10 — 18 x 2,5 — 3,5 мкм, фиалиды ампулиформные, размером 7 — 8 x 2 — 3 мкм, конидии чаще округлые, гладкие, размером 2,2 — 3,0 x 2,0 — 3,0 мкм.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 2000 кл./куб. м, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность агаризованной среды и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам на 3-и сут.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Импактор микробиологический «Флора-100» ТУ 9443-001-05031637-2002

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77

Прибор MAS — 100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Ареометр-сахарометр с диапазоном измерений 0 — 10% с ценой деления 0,1% ГОСТ 18481-87

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением 10x ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 90 мм ГОСТ 23932-90

Пробирки бактериологические П1 и П2 вместимостью 15 и 20 мл ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74

Секундомер                                        ГОСТ 9586-75
Барометр                                          ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Агар микробиологический ГОСТ 17206-84

Экстракт солодовый ГОСТ 418-84

Пектин ГОСТ Р 51806-2001

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Кислота молочная пищевая (для подкисления

бактериальной флоры) ГОСТ 490-79

Среда сусло-агар: солодовое сусло 7° Б — 98%, агар-агар — 2%, pH среды — 4,5 — 5,0, режим стерилизации: Р — 0,8 кгс/кв. см, 40 мин. Для приготовления солодового сусла 7° Б солодовый экстракт растворяют в дистиллированной воде до 7% содержания сахара с помощью ареометра.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают требования:

• санитарных правил СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами»;
• правил техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
• правил электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора;
• руководства «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
• «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении 630 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 10 л/мин. на поверхность агаризованной среды. Время аспирации воздуха (1 — 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 — 3-и сут. после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 — 60 °C, добавляют молочную кислоту из расчета 2 мл на 0,5 л среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры, pH 5,0 — 6,0), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28 °C. Через 3 — 4 сут. проводят подсчет выросших типичных по морфологическим признакам колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

При микробиологическом анализе воздуха производственных помещений дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с агаризованной средой. После отбора проб чашки покрывают слоем 2%-го водного пектина толщиной 0,5 см. Затем инкубируют в термостате при 28 °C в течение 48 — 72 ч и подсчитывают количество зон осветления и разложения пектина вокруг выросших колоний.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2. С. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 — 3 чашки каждой используемой среды.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха проводят по формуле:

                               N x 1000

X = --------, V

где:

X — концентрация клеток продуцента в воздухе, кл./куб. м;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 — коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

11. Оформление результатов измерений

штамма-продуцента P. canescens PlPh33 в воздухе рабочей зоны

1. <a id="p100091"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________

2. <a id="p100092"></a>Место отбора пробы _________________________________________________

3. <a id="p100093"></a>Название лаборатории _______________________________________________

4. <a id="p100094"></a>Юридический адрес организации ______________________________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл./куб. м

Научный руководитель:

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

---