МУК 4.1.4055-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Количественное определение анатоксина-а в питьевой и природной воде методом иммуноферментного анализа. Методические указания по методам контроля
(утв. Роспотребнадзором 27.09.2024)
Примечание
Документ введен в действие с 27.12.2024.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 27 сентября 2024 года
Дата введения 27 декабря 2024 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНАТОКСИНА-а В ПИТЬЕВОЙ И ПРИРОДНОЙ ВОДЕ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ МУК 4.1.4055-24
1. Разработаны: ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (О.О. Синицына, Н.В. Кузь, В.В. Турбинский, О.С. Пивнева).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 27 сентября 2024 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания по методам контроля (далее — МУК) описывают порядок применения методики количественного определения анатоксина-а в питьевой и природной воде методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией (далее — ИФА) в диапазоне 0,05 — 5,0 мкг/дм3.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1. Анатоксин-а (C10H15NO) — молекулярная масса 165,23 г/моль, регистрационный номер CAS: 64285-06-9, представляет собой родственный тропану бициклический алкалоид вторичного амина, распространенный в поверхностных водах. Основными продуцентами являются цианобактерии (например, Anabaena, Oscillatoria, Plantkothrix, Microcystis, Cylindorspermum, Phormidium и Aphanizomenon).
2.2 Физические и химические свойства.
Хорошо растворим в воде. Относительно стабилен в водной среде в естественных водоемах в условиях нормальной дневной освещенности. При воздействии яркого солнечного света и высоких значений pH анатоксин-а подвергается фотохимическому распаду в течение нескольких часов. В отсутствие солнечного света и нейтральных и низких значениях pH период полураспада может составлять от нескольких дней, недель до нескольких месяцев. Не разрушается при кипячении (период полураспада 65 минут при температуре плюс 105 °C). При водоподготовке может окисляться озоном. Устойчив к действию хлора и других сильных окислителей (двуокиси хлора, хлорамина), ультрафиолетового излучения (УФ).
2.3. Анатоксин-а имитирует действие ацетилхолина, тем самым блокирует синаптическую передачу нервных импульсов, что приводит к перевозбуждению, истощению холинэргических систем, нарушению функции нервной системы, судорогам. Смерть наступает из-за паралича дыхательных мышц.
2.4. Основной путь поступления анатоксина-а в организм человека — употребление содержащей токсин или цианобактерии питьевой воды. Меньшее значение имеют другие возможные пути поступления — заглатывание небольших количеств воды во время рекреации на «цветущих» водных объектах, вдыхание водных аэрозолей, содержащих цианотоксин во время приема душа, употребление пищевых продуктов (например, рыбы, моллюсков), включающих токсикогенные цианобактерии, или сельскохозяйственных культур, выращенных в условиях орошения водой из «цветущего» водоема. Возможно отравление и при использовании пищевых добавок на основе водорослей, загрязненных цианотоксином. Противоядия к данному токсину не существует.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении условий проведения анализа и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность (и ее составляющие) <1> результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
<1> ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 23.04.2002 № 161-ст (далее ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002).
Метрологические характеристики
IV. Метод измерений
4.1. Количественное определение анатоксина-а в воде основано на технологии ИФА, в основе которого лежит взаимодействие «антиген-антитело»: свободный анатоксин-а и конъюгат анатоксина-а конкурируют за центры связывания антител к анатоксину-а, которые в то же самое время иммуносорбируются на поверхности планшета, покрытого вторичными антителами. Не связавшийся конъюгат удаляется в процессе промывки. После добавления в лунки раствора субстрата (хромогена) фермент в составе связавшегося с антителами к анатоксину-а конъюгата взаимодействует с субстратом, превращая хромоген в вещество голубого цвета. Добавление стоп-реагента приводит к изменению цвета с голубого на желтый.
4.2. Оптическую плотность прореагировавшей смеси измеряют фотометрически при 450 нм, по результатам измерения судят о количестве анатоксина-а в исследуемой пробе (величина оптической плотности раствора обратно пропорциональна концентрации анатоксина-а в воде).
4.3. Расчет содержания анатоксина-а проводят по стандартной кривой или с помощью специального программного обеспечения (далее — ПО).
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Фотометр-планштный иммуноферментный анализатор | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Колбы мерные | Вместимостью 10, 50, 100, 1000 см3 типа 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2, ГОСТ 1770-74 |
| Цилиндры мерные | Вместимостью 25, 50 и 100 см3, исполнение 1-4, 1(2-4)-25-2, 1(2-4)-50-2, 1(2-4)-100-2 и 1(2-4)-500-2, ГОСТ 1770-74 |
| Дозатор пипеточный одноканальный с одноразовыми наконечниками | Диапазон объема дозирования 10 — 100, 20 — 200 и 100 — 1000 мм3 |
| Дозатор пипеточный многоканальный с одноразовыми наконечниками | Диапазон объема дозирования 50 — 300 мм3 |
| Компьютер с ПО для обработки результатов | - |
| pH-метр лабораторный | - |
| Таймер | - |
| Прибор/приборы для измерения атмосферного давления, температуры и относительной влажности воздуха | - |
| Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Аскорбиновая кислота | ГОСТ 4815-76 |
| Тиосульфат натрия | ГОСТ 27068-86 |
| Бихромат калия | ГОСТ 4220-75 |
| Серная кислота | ГОСТ 14262-78 |
| Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная) | ГОСТ Р 52501-2005 |
| Тест-набор для количественного определения анатоксина-а по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом | - |
| Примечание: допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
Вспомогательное оборудование, устройства, материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Микропланшетный шейкер | Орбита до 10 мм, диапазон регулировки оборотов 300 — 1000 об/мин |
| Вортекс (шейкер) для пробирок, виал | Вибрационное движение со скоростью встряхивания от 100 до 1500 об/мин |
| Бутыли одноразовые из темного стекла с завинчивающимися крышками | Объемом 100 см3 |
| Виалы из ПНД прозрачные | Вместимостью 4, 10, 40 см3 с навинчивающейся крышкой |
| Виалы из ПНД непрозрачные | Вместимостью 4, 10, 40 см3 с навинчивающейся крышкой |
| Стаканы химические с носиком | ГОСТ 25336-82, вместимостью 100 — 150 см3, типа В-1-100(150) или Н-1-100(150) |
| Фильтры стекловолоконные для фильтрации проб с помощью шприца | Размер пор не более 1,2 мкм |
| Холодильная/морозильиая камера | ГОСТ 26678-85 |
| Шприцы медицинские одноразовые | ГОСТ ISO 7886-1-2011, вместимостью не менее 2 см3 |
| Наконечники для пипеток однократного применения | Объемом не менее 200 мкл |
| Наконечники для пипеток однократного применения | Объемом не менее 1000 мкг |
| Микропланшетная мойка | - |
| Стеклянные палочки | - |
| Воронка лабораторная стеклянная | - |
| Пленка для заклеивания микропланшетов или парафильм | - |
| Примечание: допускается использование вспомогательного оборудования, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
Пример комплектации тест-системы для определения анатоксина-а приведен в приложении 1 к настоящим МУК.
Специфичность тест-набора для определения анатоксина-а приведена в приложении 2 к настоящим МУК.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88, ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2017, а также требования, изложенные в технической документации на планшетный иммуноферментный анализатор и тест-системы.
6.2. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009-83.
6.3. Организация обучения работников безопасности труда осуществляется в соответствии с законодательством Российской Федерации <2>.
<2> Постановление Правительства Российской Федерации от 24.12.2021 № 2464 «О порядке обучения по охране труда и проверки знания требований охраны труда».
6.4. Внимание! Стандартные растворы, входящие в состав тест-систем, содержат анатоксин-а. Кроме того, раствор субстрата содержит тетраметилбензидимин, а стоп-раствор — разбавленную серную кислоту. При работе не допускать контакта реагентов с кожей и слизистыми оболочками. При попадании реагентов на кожу рук, тщательно промыть ее водой. При попадании реагентов в глаза, на кожу губ и слизистую рта следует тщательно промыть их большим количеством воды в течение не менее 15 минут, при необходимости — обратиться за медицинской помощью. Исключить прием пищи и напитков, курение в рабочей зоне. По окончании работы тест-системы убирают в холодильник, который опечатывается.
6.5. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа.
К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного анализатора.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на планшетном иммуноферментном анализаторе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
VIII. Отбор и хранение проб
8.1. Отбор проб воды проводят в соответствии с документами по стандартизации <3> в стеклянную тару темного стекла с завинчивающимися крышками. Рекомендуется одноразовое использование емкостей.
<3> ГОСТ Р 59024-2020 «Вода. Общие требования к отбору проб», введенный приказом Росстандарта от 10.09.2020 № 640-ст; ГОСТ Р 70282-2022 «Охрана окружающей среды. Поверхностные и подземные воды. Общие требования к отбору проб льда и атмосферных осадков», введенный приказом Росстандарта от 05.10.2022 № 1075-ст.
8.2. При отборе проб питьевой воды, образцы следует обработать аскорбиновой кислотой (до 1 мг/мл) и бисульфатом натрия (1 мг/мл) сразу после отбора для удаления остаточного хлора. Образцы питьевой воды, обработанные аскорбиновой кислотой, не требуют консервации. Тиосульфат натрия нельзя использовать для нейтрализации остаточного хлора, так как он разрушает анатоксин-а.
8.3. Пробы природной воды должны быть законсервированы с помощью прилагаемого концентрата буфера для разбавления образцов в соотношении 1:10 (например: 1 мл концентрата буфера для разбавления образцов добавить 9 мл природной воды).
8.4. При отборе проб проверяют pH воды. При необходимости доводят pH исследуемого образца воды до 5 — 7 pH, добавляя при постоянном перемешивании 0,1 Н раствор соляной кислоты или 0,1 Н раствор гидроксида натрия, контролируя pH с помощью pH-метра.
8.5. Пробы должны быть защищены от естественного и искусственного света, т.к. воздействие света приведет к деградации анатоксина-а.
8.6. Анатоксин-а является внутриклеточным, а также внеклеточным токсином цианобактерий. При измерении общего анатоксина-а требуется лизис клеток цианобактерий как в природной, так и сохранившихся клеток цианобактерий (после очистки и водоподготовки) в питьевой воде. Для лизиса клеток рекомендуется выполнить три цикла замораживания/размораживания. Процедура с использованием трех циклов замораживания/размораживания не приведет к деградации анатоксина-а. В случае необходимости, консервированные пробы природной воды могут быть профильтрованы в виалу на 4 см3 с использованием шприцевого фильтра с мембраной из стекловолокна.
8.7. До начала анализа пробы хранят в холодильнике. Допускается хранение проб до выполнения анализа в течение 28 дней при температуре плюс 2 — 8 °C. Допускается пересылка проб в охлажденном состоянии при условии их анализа на следующий день. При необходимости длительного хранения пробы помещают в морозильную камеру при температуре минус 20 °C.
IX. Подготовка к выполнению измерений
9.1. Лабораторную стеклянную посуду для проведения исследований моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.
9.2. Подготовку и проверку фотометра, pH-метра и другого необходимого оборудования проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации для данных приборов.
9.3 Хранение и подготовка тест-набора для иммуноферментного анализа.
9.3.1. Наборы хранят при температуре плюс 2 — 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. После отделения необходимого количества стрипов (лунок) неиспользуемые стрипы (лунки) необходимо поместить обратно в оригинальную упаковку из фольги и плотно укупорить вместе с прилагаемым влагопоглотителем. Продолжать хранение набора в холодильнике при температуре плюс 2 — 8 °C <4>.
<4> Примечание: в случае использования аналогичного набора, хранение в соответствии с указаниями изготовителя.
9.3.2. Перед анализом доводят температуру всех реагентов до комнатной температуры плюс 20 — 25 °C в течение 1,5 — 2 часов. Если в концентратах буфера образовались кристаллы, нужно растворить их при температуре плюс 40 °C и охладить концентраты до комнатной температуры перед разведением.
9.3.3. Готовый раствор субстрата, смешанный с хромогеном, светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При окрашивании раствора субстрата (хромогена) в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.
9.3.4. Для приготовления готового раствора конъюгата во флакон с лиофилизированным конъюгатом анатоксина-а с помощью дозатора вносят 3 мл готового разбавителя для конъюгата. Перемешивают с помощью вортекса в течение 5 секунд, оставляют в покое на 10 минут и снова перемешивают на вортексе в течение 5 секунд.
Срок годности готового раствора 2 недели при температуре плюс 2 — 8 °C или до 1 месяца при температуре минус 20 °C.
9.3.5. Для приготовления готового раствора антител во флакон с лиофилизированными антителами к анатоксину-а с помощью дозатора вносят 3 мл готового разбавителя для антител. Перемешивают с помощью вортекса в течение 5 секунд, оставляют в покое на 10 минут и снова перемешивают на вортексе в течение 5 секунд.
Срок годности готового раствора 2 недели при температуре плюс 2 — 8 °C или до 1 месяца при температуре минус 20 °C.
9.3.6. Стандартные растворы, субстрат и стоп-растворы готовы к использованию и не требуют дополнительных разведений.
9.3.7. С целью приготовления буфера для промывки исходный концентрированный раствор буфера разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:5 (например, к 100 см3 концентрата прибавляют 400 см3 дистиллированной или деионизированной воды). Срок годности готового раствора — 1 месяц.
9.4 Приготовление растворов.
9.4.1. Для приготовления 0,1 Н раствора соляной кислоты стандарт-титр разбивают с торца стеклянной палочкой в воронке, помещенной в стеклянный стакан на 100 см3, с помощью промывалки омывают палочку, воронку и разбитый стандарт-титр дистиллированной водой. Содержимое переносят количественно в мерную колбу на 1000 см3 и разбавляют дистиллированной водой до метки. Срок годности готового раствора — 6 месяцев.
9.4.2. Для приготовления 0,1 Н раствора гидроксида натрия стандарт-титр разбивают с торца стеклянной палочкой в воронке, помещенной в стеклянный стакан на 100 см3, с помощью промывалки омывают палочку, воронку и разбитый стандарт-титр дистиллированной водой. Содержимое переносят количественно в мерную колбу на 1000 см3 и разбавляют дистиллированной водой до метки. Срок годности готового раствора — 6 месяцев.
9.5 Подготовка проб воды.
9.5.1. Для исследования проб воды на содержание суммы внутриклеточного и свободного (внеклеточного) анатоксина-а пробы лизируют. От 5 до 10 см3 пробы тщательно перемешивают и быстро переносят в виалу на 40 см3 для выполнения трех циклов заморозки-размораживания. Если образец был предварительно заморожен, потребуется только два цикла заморозки-размораживания. Можно использовать виалы и меньшего объема, но для этого следует уменьшить объем образцов до менее, чем 25% от объема виалы. Следует убедиться, что образцы полностью замораживаются и размораживаются в каждом цикле. Образцы размораживают при температуре приблизительно плюс 35 °C в водяной бане и перемешивают после каждого цикла.
X. Проведение измерений
10.1. Рекомендуется избегать прикосновения и загрязнения нижней стороны лунок микротитровального планшета, так как каждая лунка стрипа при изменении оптической плотности выступает в роли оптической кюветы.
10.2. Не допускается заменять реагенты в составе набора для тестирования на реагенты из другого набора с другим номером партии.
10.3 Подготовка тест-набора.
10.3.1. Доводят температуру всех реагентов тест-набора до комнатной температуры (плюс 20 — 25 °C) в течение 0,5 — 1 часов.
10.3.2. Перед непосредственным использованием реагентов тест-набора встряхивают каждый флакон с реагентами.
10.3.3. Сразу после использования реагенты тест-набора убирают в холодильник.
10.3.4. На всех стадиях исследования следует избегать воздействия прямых солнечных лучей.
10.3.5. Реагенты и растворы вносят в планшет с осторожностью, не касаясь наконечниками дна и стенок лунок.
10.3.6. Для каждого реагента и раствора используют индивидуальный съемный наконечник для пипеток дозатора.
10.3.7. Точные результаты могут быть получены только при аккуратном и строгом соблюдении данной методики на всех стадиях исследования.
10.4 Проведение измерений.
10.4.1. В рамку-планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех стандартов, внутреннего контроля и исследуемой пробы при анализе в двух повторностях. Записывают положения лунок со стандартами, контролем и исследуемой водой на схеме планшета. Пример рабочей схемы микротитровального планшета приведен в приложении 3 к настоящим МУК.
10.4.2. С помощью дозатора добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см3 каждого стандарта, контроля, исследуемой воды, при этом каждый раз заменяя наконечник пипетки.
10.4.3. Далее с помощью дозатора в каждую лунку добавляют по 0,05 см3 раствора конъюгата.
10.4.4. В каждую лунку с помощью дозатора добавляют по 0,05 см3 раствора антител. Планшет заклеивают пленкой или парафильмом, с осторожностью перемешивают содержимое (не расплескивая) круговыми движениями планшета в течение 60 секунд по поверхности стола (или перемешивают с применением микропланшетного шейкера в течение 60 секунд) и оставляют для инкубации при комнатной температуре плюс 20 — 25 °C в течение 60 минут в темном месте.
10.4.5. По окончании инкубации удаляют пленку, содержимое лунок выливают в раковину, промакивают перевернутый планшет на стопке бумажных полотенец.
10.4.6. Лунки заполняют буфером для промывки (см. п. 9.3.7), внося по 0,25 см3 в каждую лунку, используя дозатор. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой. Выливают буфер для промывки из лунок и тщательно промакивают перевернутый планшет на стопке бумажных полотенец. Процедура промывки повторяется 4 раза. После последней промывки и промакивания проверяют лунки на наличие оставшегося в них буфера и, в случае необходимости, тщательно выбивают остатки буфера <5>.
<5> Примечание: необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания лунок в процессе выполнения анализа. Для увеличения производительности допускается использование автоматического устройства для отмывки иммунологических планшетов.
10.4.7. После отмывки в каждую лунку с помощью дозатора добавляют по 0,10 см3 смеси субстрата с хромогеном. Планшет заклеивают пленкой или парафильмом, с осторожностью перемешивают круговыми движениями планшета по поверхности стола в течение 30 секунд (или перемешивают с применением микропланшетного шейкера в течение 30 секунд) и оставляют для инкубации при комнатной температуре плюс 20 — 25 °C в течение 20 — 30 минут в темном месте.
10.4.8. По окончании инкубации в каждую лунку с помощью пипеточного дозатора в той же последовательности, как в предыдущем шаге, в каждую лунку добавляют по 0,10 см3 стоп-реагента. Смесь перемешивают, осторожно вращая планшет.
10.4.9. С помощью фотометра измеряют оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 450 нм. Время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 15 минут.
XI. Обработка результатов анализа
11.1. Для обработки результатов ИФА используют специализированное ПО, рекомендованное разработчиком тест наборов. Образец градуировочной кривой должен быть приведен в руководстве по использованию тест-набора.
11.2. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности на микропланшетном иммуноферментном анализаторе (планшетном фотометре, ридере) при длине волны 450 нм против нулевого стандарта, значение которого принимается за 100%. Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.
Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,8 (A450нм < 0,8), это является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.
Измеренные показатели оптической плотности переносят в программу обработки и располагают в соответствии с номерами образцов.
11.3. По величинам значений оптической плотности (logit Bi/B0), вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим им значениям концентрации анатоксина-а строят градуировочную кривую в системе координат logit Bi/B0/LogCi (рис. 1).
Рис. 1. Градуировочная кривая ИФА анатоксина-а (Logit-Log)
11.4. Концентрацию анатоксина-а считывают по соответствующим градуировочным кривым по значениям оптической плотности (logit Bi/B0), вычисленным по формулам (1, 2, 3):
где: Cp — концентрация анатоксина-а в пробе, мкг/дм3;
Xp — логарифм концентрации анатоксина-а в пробе, найденный по формуле (2):
X_{p} = \frac{\text{У}_{\text{р}} - \text{а}}{b} , (2)
где: Уp - формула (3):
\text{У}_{p} = lg(\frac{B_{p}/B_{0}}{1 - B_{p}/B_{0}}), (3)
где: Bp — оптическая плотность стандартных и исследуемых растворов;
B0 — среднее значение оптической плотности нулевого раствора.
11.5. Если результаты анализа стандартного раствора для внутреннего контроля находятся за пределами диапазона (0,75 +/- 0,185) мкг/дм3, то анализ проводят повторно.
11.6. В случае обработки результатов анализа вручную, измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу программы MS Excel и располагают в соответствии с номерами образцов. Рассчитывают средние значения оптической плотности для каждого из стандартов. С целью построения градуировочной кривой, необходимо рассчитать значение logit Bi/B0 для каждого из стандартов и отложить полученные значения по вертикальной оси (y) против соответствующей концентрации соответствующего стандарта анатоксина-а по горизонтальной логарифмической оси (x) на графической бумаге. Затем отложить значения logit Bi/B0 для контроля и образцов, при интерполяции с использованием стандартной кривой будут получены уровни концентраций анатоксина-а.
11.7. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости, условие (4):
\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{(\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2})} \leq r, (4)
где: X1, X2, — результаты параллельных определений, мг/кг:
r — значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma_{r} .
При невыполнении условия (4) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XII. Оформление результатов
12.1 Результат количественного анализа рассчитывается по формуле (5):
(\overline{X} \pm \Delta),\text{мг}/\text{дм}^{3}, (5)
где: \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, мкг/дм3;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мкг/дм3, формула (6):
\Delta = \delta \cdot X/100, (6)
где: \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, табл. 3.1), %.
Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.
В случае получения результатов ниже предела обнаружения следует указывать результат со знаком «<», например: «Содержание анатоксина-а в воде < 0,05 мкг/дм3».
При обнаружении высоких концентраций анатоксина-а в исследуемых пробах воды, находящихся за пределами рабочего диапазона методики, необходимо дополнительно разбавить пробы соответствующим разбавляющим буфером. При этом, результат, полученный по градуировочной кривой, необходимо умножить на фактор разбавления.
Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования, указанные в табл. 3.1, то два параллельных определения проводят повторно.
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с документами по стандартизации <6>. Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.
<6> ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002; ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст.
Приложение 1 к МУК 4.1.4055-24
РЕКОМЕНДУЕМАЯ КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНАТОКСИНА-а
1. Тест-набор для количественного определения анатоксина-а по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом, включает следующие компоненты:
-
микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), покрытых вторичными антителами (антимышиными), в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем;
-
комплект стандартных растворов анатоксина-а в воде (по 1,5 мл каждый) с концентрациями: 0 (нулевой стандарт), 0,15; 0,40; 1,0; 2,5; 5,0 мкг/л анатоксина-а в воде;
-
стандартный раствор анатоксина-а в воде для внутреннего контроля, концентрации (0,75 +/- 0,185) мкг/л, 1,5 мл;
-
лиофилизированный ферментный конъюгат анатоксина-а, ферментная основа — пероксидаза хрена, 3 флакона;
-
раствор субстрата (цветной) (3,3';5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ)), 12 мл;
-
пустые прозрачные и непрозрачные флаконы из полиэтилена низкого давления (ПНД) для объединения восстановленного ферментного конъюгата и антитела (при необходимости);
-
стоп-раствор (обращаться осторожно, содержит разбавленную серную кислоту), 12 мл.
Приложение 2 к МУК 4.1.4055-24
РЕКОМЕНДУЕМАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕСТ-НАБОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНАТОКСИНА-а
Специфичность тест-набора <7> для определения анатоксина-а
<7> Примечание: специфичность к конгенерам анатоксина-а других тест-систем может отличаться от указанной выше, данная информация должна содержаться в прилагаемой инструкции по использованию тест-систем.
| Вещество | Специфичность, % |
|---|---|
| (+) Анатоксин-а | 100 |
| Гомоанатоксин-а | 124,8 |
| (-) Анатоксин-а | 0,3 |
| Дигидроанатоксин | 1 |
Приложение 3 к МУК 4.1.4055-24 (рекомендуемый образец)
РАБОЧАЯ СХЕМА МИКРОТИТРОВАЛЬНОГО ПЛАНШЕТА
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Постановление Правительства Российской Федерации от 24.12.2021 № 2464 «О порядке обучения по охране труда и проверки знания требований охраны труда».
3. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».
4. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».
5. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».
6. ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений».
7. ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений».
8. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
9. ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
10. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
11. ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».
12. ГОСТ 4815-76 «Кислота аскорбиновая пищевая. Технические условия».
13. ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
14. ГОСТ 27068-86 «Натрий серноватистокислый (натрия тиосульфат) 5-водный. Технические условия».
15. ГОСТ 14262-78 «Кислота серная особой чистоты. Технические условия».
16. ГОСТ 4220-75 «Калий двухромово-кислый. Технические условия».
17. ГОСТ 12.1.019-2017 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
18. ГОСТ 12.1.004-85 «Пожарная безопасность. Общие требования».
19. ГОСТ 12.4.009-83 Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание.
20. ГОСТ ISO 7886-1-2011 «Шприцы инъекционные для однократного применения стерильные».
21. ГОСТ Р 59024-2020 «Общие требования к отбору проб».
22. ГОСТ Р 70282-2022 «Охрана окружающей среды. Поверхностные и подземные воды. Общие требования к отбору проб льда и атмосферных осадков».
23. ГОСТ 12.1.005-88 «Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».
24. ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
| ББК 51.215 |
|---|