МУК 4.1.4000-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовых концентраций антибиотиков (амоксициллин, ампициллин, азитромицин, эритромицин, оксациллин, бензилпенициллин, кларитромицин, ципрофлоксацин) в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)
Примечание
Документ введен в действие с 19.05.2024.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 19 февраля 2024 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ АНТИБИОТИКОВ (АМОКСИЦИЛЛИН, АМПИЦИЛЛИН, АЗИТРОМИЦИН, ЭРИТРОМИЦИН, ОКСАЦИЛЛИН, БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИН, КЛАРИТРОМИЦИН, ЦИПРОФЛОКСАЦИН) В ВОДЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.4000-24
Дата введения 19 мая 2024 года
Методические указания разработаны ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (Н.В. Зайцева, Т.В. Нурисламова, Т.Д. Карнажицкая, М.О. Старчикова); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» (Г.И. Терентьев, А.А. Поспелова).
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) описывают порядок применения высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее — ВЭЖХ/МС-МС) для измерения массовых концентраций азитромицина, амоксициллина, ампициллина, бензилпенициллина, кларитромицина, оксациллина, ципрофлоксацина, эритромицина в пробах воды (в питьевой воде, расфасованной в емкости, питьевой воде систем централизованного, в том числе горячего, и нецентрализованного водоснабжения, воде подземных и поверхностных водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования, воде плавательных бассейнов, аквапарков) в диапазонах, указанных в табл. 1.1.
Наименования определяемых соединений, диапазоны измерений массовых концентраций антибиотиков в пробах воды и анализируемых растворах
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1. Физико-химические свойства антибиотиков представлены в табл. 2.1.
Физико-химические свойства антибиотиков
| Показатель | Характеристика |
| Наименование | Азитромицин (9-деоксо-9а-аза-9а-метил-9а-гомоэритромицин А 9-деоксо-9а-аза-9а-метил-9а-гомоэритромицин дигидрат) <*> |
| Регистрационный номер CAS | 83905-01-5 |
| Брутто-формула | C38H72N2O12 |
| Агрегатное состояние | Белый кристаллический порошок |
| Молекулярная масса | 749,0 |
| Tпл., °C | 113 — 115 |
| Tкип., °C | 822,1 |
| Плотность, г/см3 | 1,2 |
| Растворимость в воде, г/100 г | 2,37·10-4 (25 °C) |
| Растворимость в органических растворителях | Хорошо растворим в хлороформе, диметилсульфоксиде и этаноле, практически нерастворим в воде |
| Давление паров, мм рт. ст. | 2,65·10-24 (25 °C) |
| Константа диссоциации, pKa | 8,5 |
| Стабильность | Несовместим с сильными окислителями |
| Фармакологическое действие | Бактериостатическое |
| Класс антибиотиков | Класс макролидов, подкласс азалидов |
| Наименование | Амоксициллин ([2S-[2альфа,5альфа,6бета(S*)]]-6-[[Амино-(4-гидроксифенил) ацетил]амино]-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота (и в виде тригидрата или натриевой соли) <*> |
| Регистрационный номер CAS | 26787-78-0 |
| Брутто-формула | C16H19N3O5S |
| Агрегатное состояние | Белый кристаллический порошок |
| Молекулярная масса | 365,4 |
| Tпл., °C | 194 |
| Tкип., °C | 743,2 |
| Плотность, г/см3 | 1,5 |
| Растворимость в воде, г/100 г | 0,34 (25 °C) |
| Растворимость в органических растворителях | Трудно растворим в этаноле, нерастворим в маслах и жирных кислотах, растворим в разбавленных кислотах и щелочах |
| Давление паров, мм рт. ст. | 4,6·10-17 (25 °C) |
| Константа диссоциации, pKa | 2,6 |
| Стабильность | Стабильный |
| Фармакологическое действие | Бактерицидное |
| Класс антибиотиков | Пенициллины |
| Наименование | Ампициллин (2S,5R,6R)-6-[(R)-2-амино-2 фенилацетамидо]-3,3 диметил-7-оксо-4тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота) <*> |
| Регистрационный номер CAS | 69-53-4 |
| Брутто-формула | C16H19N3O4S |
| Агрегатное состояние | Белый мелкокристаллический порошок |
| Молекулярная масса | 349,4 |
| Tпл., °C | 208 |
| Tкип., °C | 684 |
| Плотность, г/см3 | 1,5 |
| Растворимость в воде, г/100 г | 1,111 (25 °C) |
| Растворимость в органических растворителях | Метаноле, диметилацетамиде, диметилсульфоксиде, практически нерастворим в этилацетате, петролейном эфире, бензоле и хлороформе |
| Давление паров, мм рт. ст. | - |
| Константа диссоциации, pKa | 2,5 |
| Стабильность | Стабильный |
| Фармакологическое действие | Бактерицидное |
| Класс антибиотиков | Пенициллины |
| Наименование | Бензилпенициллин (3,3-диметил-7-оксо-6-[(2-фенилацетил)амино]-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота) <*> |
| Регистрационный номер CAS | 61-33-6 |
| Брутто-формула | C16H18N2O4S |
| Агрегатное состояние | Белый мелкокристаллический порошок |
| Молекулярная масса | 334,4 |
| Tпл., °C | 214 — 217 |
| Tкип., °C | 663,3 |
| Плотность, г/см3 | 1,4 (25 °C) |
| Растворимость в воде, г/100 г | 0,021 (25 °C) |
| Растворимость в органических растворителях | Растворим в метаноле, этаноле, этилацетате, бензоле, ацетоне, хлороформе |
| Давление паров, мм рт. ст. | - |
| Константа диссоциации, pKa | 2,7 |
| Стабильность | Нестабилен в присутствии кислот, гидроксидов щелочных металлов, глицерина |
| Фармакологическое действие | Бактерицидное |
| Класс антибиотиков | Пенициллины |
| Наименование | Кларитромицин (6-O-Метилэритромицин) <*> |
| Регистрационный номер CAS | 81103-11-9 |
| Брутто-формула | C38H69NO13 |
| Агрегатное состояние | Белый кристаллический порошок |
| Молекулярная масса | 748,0 |
| Tпл., °C | 220 |
| Tкип., °C | 805,5 |
| Плотность, г/см3 | 1,2 (25 °C) |
| Растворимость в воде, г/100 г | 1,7·10-4 (25 °C) |
| Растворимость в органических растворителях | Растворим в ацетоне, мало растворим в метаноле, этаноле, ацетонитриле и практически нерастворим в воде |
| Давление паров, мм рт. ст. | 2,32·10-25 (25 °C) |
| Константа диссоциации, pKa | 8,99 |
| Стабильность | Стабильный |
| Фармакологическое действие | Бактериостатическое, бактерицидное |
| Класс антибиотиков | Макролиды |
| Наименование | Оксациллин (2S,5R,6R)-3,3-диметил-6-[(5-метил-3-фенил-1,2-оксазол-4-карбонил) амино]-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота) <*> |
| Регистрационный номер CAS | 66-79-5 |
| Брутто-формула | C19H19N3O5S |
| Агрегатное состояние | Белый кристаллический порошок |
| Молекулярная масса | 401,4 |
| Tпл., °C | 188 |
| Tкип., °C | 686,8 |
| Плотность, г/см3 | 1,5 (25 °C) |
| Растворимость в воде, г/100 г | - |
| Растворимость в органических растворителях | Хорошо растворим в воде, плохо растворим в спирте, хлороформе |
| Давление паров, мм. рт. ст. | - |
| Константа диссоциации, pKa | 2,72 |
| Стабильность | Стабильный |
| Фармакологическое действие | Бактерицидное |
| Класс антибиотиков | Пенициллины |
| Наименование | Ципрофлоксацин (1-циклопропил-6-фтор-4-оксо-7-пиперазин-1-ил-хинолин-3-карбоновая кислота) <*> |
| Регистрационный номер CAS | 85721-33-1 |
| Брутто-формула | C17H18FN3O3 |
| Агрегатное состояние | Слегка желтоватый кристаллический порошок |
| Молекулярная масса | 331,34 |
| Tпл., °C | 255 — 257 |
| Tкип., °C (мм рт. ст.) | 581,8 |
| Плотность, г/см3 | 1,5 |
| Растворимость в воде, г/100 г | - |
| Растворимость в органических растворителях | Растворим в 0,1 н соляной кислоте, плохо растворим в воде и этаноле |
| Давление паров, мм рт. ст. | 2,85·10-13 (при плюс 25 °C) |
| Константа диссоциации, pKa | 6,09 |
| Стабильность | Разрушается при воздействии УФ, беречь от замораживания |
| Фармакологическое действие | Бактерицидное |
| Класс антибиотиков | Фторхинолоны |
| Наименование | Эритромицин (6-(4-диметиламино-3-гидрокси-6-метил-оксан-2-ил)окси-14-этил-7,12,13-тригидрокси-4-(5-гидрокси-4-метокси-4,6-диметил-оксан-2-ил)-окси-3,5,7,9,11,13-гексаметил-1-оксациклотетрацекан-2,10-дион) <*> |
| Регистрационный номер CAS | 114-07-8 |
| Формула | C37H67NO13 |
| Агрегатное состояние | Белый или слегка желтый кристаллический порошок |
| Молекулярная масса | 733,9 |
| Tпл., °C | 133 — 135 |
| Tкип., °C | 719,69 |
| Плотность, г/см3 | 1,2 |
| Растворимость в воде, г/100 г | 0,2 (25 °C) |
| Растворимость в органических растворителях | Растворим в метаноле, хлороформе |
| Давление паров, мм рт. ст. | 2,12·10-25 (25 °C) |
| Константа диссоциации, pKa | 8,8 |
| Стабильность | Стабильный |
| Фармакологическое действие | Бактериостатическое, в высоких дозах бактерицидное |
| Класс антибиотиков | Макролиды |
| Примечание: <*> — в соответствии с классификацией Международного союза теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC). | |
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении условий проведения анализа <1> и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.
<1> ГОСТ Р ИСО 5725-1 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-2 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст (далее — ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6).
Диапазоны измерений, значения погрешности (и ее составляющих)
| Наименование определяемого соединения | Диапазон измерений определяемого соединения в воде, мг/дм3 | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), \sigma_{r} , % | Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости <2>), \sigma_{R} , % | Показатель правильности (границы относительной систематической погрешности), \pm \delta_{c} , % | Показатель точности (границы относительной погрешности при доверительной вероятности P = 0,95), \pm \delta , % |
|---|---|---|---|---|---|
| Азитромицин | 0,000005 — 0,00005 | 11 | 16 | 7 | 34 |
| Амоксициллин | 0,00002 - 0,0002 | 10 | 14 | 10 | 32 |
| Кларитромицин | 0,00002 — 0,0002 | 10 | 13 | 7 | 29 |
| Ципрофлоксацин | 0,00002 — 0,0002 | 14 | 14 | 8 | 33 |
| Оксациллин | 0,005 — 0,05 | 7 | 10 | 8 | 24 |
| Бензилпенициллин | 0,005 — 0,05 | 6 | 7 | 8 | 20 |
| Ампициллин | 0,005 — 0,05 | 7 | 9 | 7 | 22 |
| Эритромицин | 0,00005 — 0,0005 | 9 | 10 | 9 | 24 |
<2> Пункт 5.1.10.1 РМГ 61-2010 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки», введенных приказом Росстандарта от 13.12.2011 № 1064-ст.
Границы относительной погрешности при доверительной вероятности P = 0,95 соответствуют относительной расширенной неопределенности измерений при коэффициенте охвата k = 2.
Значения показателя точности используют при:
- оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;
- оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;
- оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.
IV. Метод измерений
4.1. Метод основан на извлечении и концентрировании антибиотиков из воды способом твердофазной экстракции (далее — ТФЭ), за исключением оксациллина, бензилпенициллина и ампициллина, которые анализируют без концентрирования при непосредственном вводе в хроматограф образцов воды, разделении на жидкостном хроматографе на колонке с обращенной фазой C18 и масс-спектрометрическом детектировании в режиме мониторинга множественных реакций (англ. Multiple Reaction Monitoring, далее — MRM).
4.2. Идентификация антибиотиков проводится по наличию характеристичных ионов в масс-спектрах и по времени удерживания. Количественное определение проводят по основным дочерним ионам методом абсолютной градуировки.
4.3. Степень извлечения ципрофлоксацина, кларитромицина, азитромицина, амоксициллина из воды способом ТФЭ составляет от 70% до 100%, эритромицина от 80% до 100%.
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерений | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Система ВЭЖХ/МС-МС, включающая: - жидкостный хроматограф, оснащенный насосом для градиентного элюирования, дегазатором, термостатом колонок, автоматическим дозатором проб; - масс-спектрометрический детектор с тройным квадруполем; - программное обеспечение работы системы | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений. Электроспрей, положительная ионизация: чувствительность сигнал:шум = 6000:1 (при дозировании 1 пг резерпина); предел СКО выходного сигнала 5% (при дозировании 5 пг резерпина) |
| Весы лабораторные электронные I класса точности, НмПВ — 0,001 г, НПВ — 120 г | Пределы допускаемой погрешности от НмПВ до 50 г: +/- 1,0 мг, ГОСТ Р 53228 |
| Дозаторы жидкости механические одноканальные переменного объема с одноразовыми наконечниками вместимостью 10 — 100 мм3, 20 — 200 мм3, 100 — 1000 мм3, 1 — 10 см3 | ГОСТ 28311 |
| Колбы мерные: 2-10-2, 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 | ГОСТ 1770 |
| Измеритель параметров микроклимата | Внесен в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
| Реактив | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Аналитический стандарт азитромицина дигидрата | Массовая доля основного вещества >= 95% |
| Аналитический стандарт амоксициллина тригидрата | Массовая доля основного вещества >= 95% |
| Аналитический стандарт ампициллина | Массовая доля основного вещества >= 95% |
| Аналитический стандарт бензилпенициллина | Массовая доля основного вещества >= 95% |
| Аналитический стандарт кларитромицина | Массовая доля основного вещества >= 95% |
| Аналитический стандарт оксациллина моногидрата | Массовая доля основного вещества >= 93% |
| Аналитический стандарт ципрофлоксацина | Массовая доля основного вещества >= 95% |
| Аналитический стандарт эритромицина | Массовая доля основного вещества >= 94% |
| Метанол для LC-MS | Массовая доля основного вещества >= 95% |
| Муравьиная кислота для аналитики | Массовая доля основного вещества >= 85% |
| Натрий серноватистокислый 5-водный (натрия тиосульфат), ч.д.а. | Массовая доля основного вещества >= 98%, ГОСТ 27068 |
| Ацетон, 1 сорт | Массовая доля основного вещества >= 99%, ГОСТ 2768 |
| Этилацетат (высший сорт) | Массовая доля основного вещества >= 99%, ГОСТ 8981 |
| Вода деионизированная, полученная с использованием системы производства ультрачистой воды | ГОСТ Р 52501 |
| Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией. | |
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств и материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Хроматографическая металлическая колонка длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм с обращенно-фазным сорбентом зернением 3,5 мкм | - |
| Шкаф сушильный электрический, диапазон рабочих температур от плюс 50 °C до плюс 200 °C | - |
| Центрифуга с допустимой скоростью центрифугирования не менее 3500 об/мин | - |
| Ультразвуковая лабораторная баня | - |
| Устройство для ТФЭ с вакуумным насосом и штативом для картриджей | - |
| Устройство очистки воды, позволяющее получать деионизированную воду | - |
| Устройство для фильтрации растворителей | - |
| Мембранный фильтр из нейлона (полиамида, ПА) диаметром 47 мм, размер пор 0,2 мкм для фильтрации растворителей | - |
| Шприц медицинский одноразовый типа «Луер» вместимостью 2 см3 | ГОСТ ISO 7886-1 |
| Шприцевые фильтрующие насадки гидрофильные диаметрами 13 мм и 4 мм, размер пор 0,2 мкм | - |
| Картриджи для ТФЭ с липофильно-гидрофильным сорбентом | Стандартные пластиковые шприцы вместимостью 6 см3, содержащие 500 мг сорбента поли(дивинилбензол-co-N-винилпирролидона) с размером частиц 60 мкм, HLB 6 мл/500 мг (англ. hydrophilic-lipophilic balance cartridges contain 6 ml/500 mg per cartridge sorbent poly(divinylbenzene-co-N-vinylpyrrolidone) particle size 60\mu m , HLB 6CC/500 mg) |
| Пробирки полипропиленовые конические градуированные вместимостью 15 см3 с винтовой крышкой | - |
| Хроматографические виалы из темного стекла вместимостью 2 см3 с завинчивающейся крышкой | - |
| Вставки для хроматографических виал вместимостью 250 мм3 | - |
| Бутыли из темного стекла <3> с завинчивающейся крышкой для отбора и хранения проб объемом не менее 250 см3 | - |
| Аргон газообразный высокой чистоты (99,998%) | - |
| Редуктор кислородный | - |
| Примечание: допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений соблюдают меры противопожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004, имеют средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009 и соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019.
6.2. Работа в лаборатории осуществляется в соответствии с методическими документами <3>.
<3> ПНД Ф 12.13.1-03 «Методические рекомендации. Техника безопасности при работе в аналитических лабораториях (общие положения)», утвержденные директором ФГУ «Центр экологического контроля и анализа» Министерства природных ресурсов Российской Федерации 04.09.2003.
6.3. Работа с сосудами, работающими под давлением, осуществляется в соответствии с законодательством Российской Федерации <4>.
<4> Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением, утвержденные приказом Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору от 15.12.2020 № 536 (зарегистрировано Минюстом России 31.12.2020, регистрационный № 61998).
6.4. При работе с химическими реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007 и ГОСТ 12.1.005.
6.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать гигиенические нормативы <5>.
<5> СанПиН 1.2.3685-21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021 регистрационный № 62296), с изменениями, внесенными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.12.2022 № 24 (зарегистрировано Минюстом России 09.03.2023, регистрационный № 72558).
6.6. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила, указанные в инструкции по эксплуатации жидкостного хромато-масс-спектрометра.
6.7. Утилизацию растворов после выполнения измерений проводят в соответствии с инструкцией по обращению с химическими отходами, действующей на предприятии.
VII. Требования к квалификации операторов
7.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором.
VIII. Условия измерений
8.1 При приготовлении растворов и подготовке проб к анализу в лаборатории соблюдают следующие условия:
- температура воздуха плюс 15 — 30 °C;
- атмосферное давление (84,0 — 106,7 кПа) (630 — 800 мм рт. ст.);
- влажность воздуха 20 — 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
IX. Подготовка к выполнению измерений
9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хромато-масс-спектрометрической системы, установление градуировочных характеристик.
9.2 Подготовка посуды.
Лабораторную посуду промывают проточной водопроводной водой, деионизированной водой, исключая применение поверхностно-активных веществ; последовательно промывают органическими растворителями: этилацетатом и ацетоном. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Сушка посуды проводится в сушильном шкафу при температуре плюс 105 — 110 °C.
9.3 Приготовление растворов.
9.3.1. Раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде с объемной концентрацией 0,1%.
В мерную колбу вместимостью 500 см3 вносят 0,5 см3 муравьиной кислоты, доводят объем раствора до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Срок хранения раствора при температуре плюс 4 — 15 °C не более 30 дней.
9.3.2. Раствор муравьиной кислоты в метаноле с объемной концентрацией 0,1%.
В мерную колбу вместимостью 500 см3 вносят 0,5 см3 муравьиной кислоты, доводят объем раствора до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Срок хранения раствора при температуре плюс 4 — 15 °C не более 12 месяцев.
9.3.3 Подвижная фаза для элюирования.
Состав подвижной фазы: смесь 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты (A) и метанола (B) задают на двух каналах насоса в режиме градиентного элюирования (табл. 9.2).
9.3.4. Исходный раствор эритромицина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см3.
В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают навеску эритромицина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см3 метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация эритромицина в исходном растворе 1 мг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 6 месяцев.
9.3.5. Разбавленный раствор № 1 эритромицина в метаноле с массовой концентрацией 2 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором 0,05 см3 исходного раствора эритромицина в метаноле с концентрацией 1 мг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация эритромицина в разбавленном растворе № 1 составляет 2 мкг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.
9.3.6. Разбавленный раствор № 2 эритромицина в метаноле с массовой концентрацией 0,05 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором 0,625 см3 разбавленного раствора эритромицина в метаноле № 1 с концентрацией 2 мкг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация эритромицина в разбавленном растворе № 2 составляет 0,05 мкг/см3. Используют свежеприготовленный раствор.
9.3.7. Разбавленный раствор № 3 эритромицина в метаноле с массовой концентрацией 0,01 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят дозатором 2 см3 разбавленного раствора эритромицина в метаноле № 2 с концентрацией 0,05 мкг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация эритромицина в разбавленном растворе № 3 составляет 0,01 мкг/см3. Используют свежеприготовленный раствор.
9.3.8. Исходный раствор азитромицина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см3.
В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают навеску азитромицина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см3 метанола; содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация азитромицина в исходном растворе 1 мг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 6 месяцев.
9.3.9. Разбавленный раствор № 1 азитромицина в метаноле с массовой концентрацией 1 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором 0,025 см3 исходного раствора азитромицина в метаноле с концентрацией 1 мг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация азитромицина в разбавленном растворе № 1 составляет 1 мкг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.
9.3.10. Разбавленный раствор № 2 азитромицина в метаноле с массовой концентрацией 0,005 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором 0,125 см3 разбавленного раствора азитромицина в метаноле № 1 с концентрацией 1 мкг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация азитромицина в разбавленном растворе № 2 составляет 0,005 мкг/см3. Используют свежеприготовленный раствор.
9.3.11. Разбавленный раствор № 3 азитромицина в метаноле с массовой концентрацией 0,001 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором 5 см3 разбавленного раствора азитромицина в метаноле № 2 с концентрацией 0,005 мкг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация азитромицина в разбавленном растворе № 3 составляет 0,001 мкг/см3. Используют свежеприготовленный раствор.
9.3.12. Исходный раствор амоксициллина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см3.
В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают навеску амоксициллина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см3 метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески; доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация амоксициллина в исходном растворе 1 мг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.
9.3.13. Исходный раствор кларитромицина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см3.
В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают навеску кларитромицина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см3 метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация кларитромицина в исходном растворе 1 мг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 6 месяцев.
9.3.14. Исходный раствор ципрофлоксацина в метаноле с массовой концентрацией 0,2 мг/см3.
В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают навеску ципрофлоксацина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 25 см3 метанола, закрывают колбу пробкой и помещают в ультразвуковую баню на 5 — 10 мин до полного растворения ципрофлоксацина; доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация ципрофлоксацина в исходном растворе 0,2 мг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.
9.3.15. Разбавленный раствор № 1 смеси амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле с массовой концентрацией 2 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором по 0,05 см3 исходных растворов амоксициллина, кларитромицина в метаноле с концентрациями 1 мг/см3 и 0,25 см3, ципрофлоксацина в метаноле с концентрацией 0,2 мг/см3; доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовые концентрации амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в разбавленном растворе № 1 составляют 2 мкг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.
9.3.16. Разбавленный раствор № 2 смеси амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле с массовой концентрацией 0,02 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором 0,25 см3 разбавленного раствора амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле № 1 с концентрацией 2 мкг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в разбавленном растворе № 2 составляет 0,02 мкг/см3. Используют свежеприготовленный раствор.
9.3.17. Разбавленный раствор № 3 смеси амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле с массовой концентрацией 0,004 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором 5 см3 разбавленного раствора амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в метаноле № 2 с концентрацией 0,02 мкг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина в разбавленном растворе № 3 составляет 0,004 мкг/см3. Используют свежеприготовленный раствор.
9.3.18. Исходный раствор ампициллина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см3.
В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают навеску ампициллина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см3 метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация ампициллина в исходном растворе 1 мг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.
9.3.19. Исходный раствор бензилпенициллина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см3.
В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают навеску бензилпенициллина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см3 метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация бензилпенициллина в исходном растворе 1 мг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.
9.3.20. Исходный раствор оксациллина в метаноле с массовой концентрацией 1 мг/см3.
В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают навеску оксациллина (0,010 +/- 0,001) г с учетом массовой доли основного вещества и формы аналитического стандарта, приливают 5 см3 метанола, содержимое колбы перемешивают до полного растворения навески, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация оксациллина в исходном растворе 1 мг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 3 месяца.
9.3.21. Разбавленный раствор № 1 ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в метаноле с массовой концентрацией 25 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором по 0,625 см3 исходных растворов ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина с концентрацией — 1 мг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в разбавленном растворе № 1 составляет 25 мкг/см3. Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °C 1 месяц.
9.3.22. Разбавленный раствор № 2 ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в метаноле с массовой концентрацией 5 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят дозатором 5 см3 исходного раствора ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина с концентрацией 25 мкг/см3, доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Массовая концентрация ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в разбавленном растворе № 2 составляет 5 мкг/см3. Используют свежеприготовленный раствор.
9.3.23 Водный раствор натрия тиосульфата с массовой долей 2%.
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2 г натрия тиосульфата, доводят объем раствора до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре 10 дней.
9.4 Подготовка хромато-масс-спектрометрической системы.
9.4.1. Подготовку хромато-масс-спектрометрической системы к работе проводят в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.
9.4.2 Режим работы хромато-масс-спектрометрической системы.
Режим работы хромато-масс-спектрометрической системы устанавливают в соответствии с условиями, указанными в табл. 9.1.
Режим работы хромато-масс-спектрометрической системы <6>
<6> Примечание: допускается корректировка рабочих параметров масс-спектрометрического детектора в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.
| Показатель | Параметры |
| 1 | 2 |
| Ионизация | Электростатическим распылением (англ. Electrospray Ionization, ESI) |
| Полярность | Положительная |
| Поток газа-осушителя (азота) (англ. Drying gas) | 5 дм3/мин |
| Поток газа-распылителя (азота) (англ. Nebulizing gas) | 2 дм3/мин |
| Поток нагревающего газа (воздуха) (англ. Heating gas) | 5 дм3/мин |
| Температура интерфейса | 300 °C |
| Температура нагревательного блока (внутри нагревательного блока находится линия десольватации) | 400 °C |
| Температура линии десольватации | 250 °C |
| Напряжение на интерфейсе | 4,0 кВ |
| Сила тока на интерфейсе | 0,4 мкА |
| Режим сканирования | MRM |
| Колонка металлическая, заполненная сорбентом C18 зернением 3,5 мкм | Внутренний диаметр 2,1 мм, длина 150 мм |
| Температура термостата колонок | 40 °C |
| Подвижная фаза | Раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде с объемной концентрацией 0,1% (A), метанол 100% (B) |
| Скорость потока элюента | 0,3 см3/мин |
| Режим подачи элюента | Градиентный <*> |
| Объем вводимой пробы | 10 мм3 |
| Ориентировочное время выхода, мин: | |
| амоксициллина | 4,85 +/- 0,02 |
| ципрофлоксацина | 6,01 +/- 0,02 |
| ампициллина | 6,27 +/- 0,02 |
| азитромицина | 6,80 +/- 0,02 |
| эритромицина | 7,58 +/- 0,02 |
| бензилпенициллина | 7,76 +/- 0,02 |
| оксациллина | 8,21 +/- 0,02 |
| кларитромицина | 8,25 +/- 0,02 |
| Примечание: <*> — режим программирования градиента приведен в табл. 9.2. | |
Режим градиентного элюирования
9.5 Установление градуировочных характеристик.
9.5.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость сигнала детектора от массовой концентрации антибиотика в анализируемом растворе, устанавливают методом абсолютной градуировки по пяти сериям градуировочных растворов. Каждую серию, состоящую из пяти градуировочных растворов, готовят из разбавленных растворов антибиотиков, приготовленных в соответствии с п. 9.3.6 - 9.3.7, 9.3.10 - 9.3.11, 9.3.16 - 9.3.17, 9.3.22.
9.5.2. Градуировочные растворы эритромицина в деионизированной воде готовят в мерных колбах вместимостью 10 см3. В каждую колбу вносят дозатором разбавленные растворы эритромицина № 2 и № 3 в соответствии с табл. 9.3, доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Проводят ТФЭ градуировочных растворов эритромицина с использованием вакуумной установки для ТФЭ и картриджей HLB 6CC/500 мг следующим образом:
- промывают картридж, пропуская через него 5 см3 метанола, 5 см3 деионизированной воды со скоростью потока не более 0,2 см3/мин (без применения вакуума);
- загружают на картридж 10 см3 градуировочного раствора;
- промывают картридж 2 см3 деионизированной воды для удаления слабоудерживаемых компонентов;
- элюируют эритромицин с картриджа 10 см3 метанола, собирая метанольный экстракт в коническую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3, и упаривают при температуре плюс 40 °C в потоке воздуха <7> до 1 см3.
<7> Примечание: допускается применять для данных целей любой инертный газ (азот, аргон, гелий).
Приготовление градуировочных растворов для построения градуировочной характеристики эритромицина
Полученный экстракт фильтруют в хроматографическую виалу через шприцевой фильтр диаметром 13 мм и размером пор 0,2 мкм и анализируют аликвоту в количестве 10 мм3 в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.2).
9.5.3. Градуировочные растворы азитромицина в деионизированной воде готовят в мерных колбах вместимостью 10 см3. В каждую колбу вносят дозатором разбавленные растворы азитромицина № 2 и № 3 в соответствии с табл. 9.4, доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Проводят ТФЭ градуировочных растворов азитромицина с использованием вакуумной установки для ТФЭ и картриджей HLB 6CC/500 мг следующим образом. Промывают картридж, пропуская через него 5 см3 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле, 5 см3 деионизированной воды со скоростью потока не более 0,2 см3/мин (без применения вакуума). Пропускают через картридж 10 см3 градуировочного раствора. Промывают картридж 2 см3 деионизированной воды для удаления слабоудерживаемых компонентов. Элюируют азитромицин с картриджа 5 см3 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле, собирая элюат в коническую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3; упаривают элюат при температуре плюс 40 °C в потоке воздуха до 1 см3, к концентрату добавляют 0,1 см3 деионизированной воды. Пробу перемешивают и упаривают до объема 0,2 см3. После упаривания фильтруют пробу через шприцевой фильтр диаметром 4 мм и размером пор 0,2 мкм в хроматографическую виалу со вставкой объемом 250 мм3 и анализируют аликвоту в количестве 10 мм3 в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.2).
Приготовление градуировочных растворов для построения градуировочной характеристики азитромицина
9.5.4. Градуировочные растворы смеси амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина в деионизированной воде готовят в мерных колбах вместимостью 10 см3. В каждую колбу вносят дозатором разбавленные растворы смеси амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина № 2 и № 3 в соответствии с табл. 9.5, доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Проводят ТФЭ амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина аналогично п. 9.5.3, используя для экстракции 10 см3 градуировочного раствора. Фильтруют экстракт в хроматографическую виалу через шприцевой фильтр диаметром 4 мм и анализируют аликвоту объемом 10 мм3 в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.2).
Приготовление градуировочных растворов для построения градуировочной характеристики амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина
9.5.5. Градуировочные растворы смеси оксациллина, бензилпенициллина, ампициллина в деионизированной воде готовят в мерных колбах вместимостью 10 см3. В каждую колбу вносят дозатором разбавленный раствор смеси оксациллина, бензилпенициллина, ампициллина в метаноле № 2 в соответствии с табл. 9.6, доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой, закрывают притертой пробкой и перемешивают. Фильтруют градуировочный раствор в хроматографическую виалу через шприцевой фильтр диаметром 13 мм с размером пор 0,2 мкм и анализируют аликвоту в количестве 10 мм3 в рабочем режиме хроматографа (п. 9.4.2).
Приготовление градуировочных растворов для построения градуировочной характеристики оксациллина, бензилпенициллина, ампициллина
9.5.6 Обнаружение и количественное определение антибиотиков.
9.5.6.1. Идентификацию антибиотиков осуществляют по выделению родительского и дочерних (основного и подтверждающих) ионов с соответствующим отношением массы иона к его заряду (табл. 9.7) и по времени удерживания на хроматограмме при сравнении с соответствующими стандартами. Тип сканирования — MRM.
Наименование соединения, родительские и дочерние ионы
| Наименование соединения | Родительский ион, m/z <*> | Основной дочерний ион, m/z <*> | Подтверждающие дочерние ионы, m/z <*> |
| Амоксициллин | 366,1 | 114,10 | 208,10 |
| Ампициллин | 350,1 | 106,10 | 191,90 |
| 160,10 | |||
| Азитромицин | 749,2 | 591,20 | 158,05 |
| 116,10 | |||
| Эритромицин | 734,2 | 158,00 | 576,10 |
| Оксациллин | 402,1 | 160,10 | 242,90 |
| Бензилпенициллин | 334,9 | 159,90 | 176,00 |
| Кларитромицин | 748,2 | 158,00 | 590,10 |
| Ципрофлоксацин | 332,1 | 230,90 | 288,10 |
| Примечание: <*> — m/z — отношение массы иона к его заряду. | |||
9.5.6.2. Количественное определение и построение градуировочной характеристики проводят по основному (наиболее интенсивному) дочернему иону (табл. 9.7).
9.5.6.3. Градуировочный коэффициент для определения массовой концентрации антибиотика в анализируемом растворе (экстракте) рассчитывают по формуле (1):
K = \frac{\sum^{n} i = 1 \frac{C_{i}}{S_{i}}}{n} ,\text{нг}/(\text{см}^{3} \cdot \text{усл}.\text{ед}.), (1)
где Ci — массовая концентрация антибиотика в i-м градуировочном растворе, нг/см3;
Si — среднее значение пяти измерений площади пика основного дочернего иона антибиотика, полученное при анализе i-го градуировочного раствора, условные единицы (далее — усл. ед.);
n — количество градуировочных растворов (n = 5).
Построение градуировочной зависимости, обработка и хранение результатов градуировки выполняются программным обеспечением хромато-масс-спектрометра. Градуировочная зависимость считается приемлемой, если коэффициент корреляции (R2) градуировочных кривых для определения азитромицина, амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина составляет не менее 0,9600; эритромицина, оксациллина, бензилпенициллина, ампициллина — не менее 0,9800.
9.5.7 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики выполняют при каждой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация антибиотика соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики.
Градуировочная характеристика признается стабильной, если расхождение между известным значением массовой концентрации определяемого антибиотика в градуировочном растворе и измеренным значением массовой концентрации в этом растворе не превышает норматива контроля Кгр, условие (2):
где C — заданная массовая концентрация антибиотика в градуировочном растворе нг/см3;
Cm — результат измерения массовой концентрации антибиотика в градуировочном растворе, нг/см3;
Кгр — норматив контроля стабильности градуировочной характеристики в абсолютной форме, рассчитанный по формуле (3):
\text{К}_{\text{гр}} = 0,01 \cdot \delta_{\text{гр}} \cdot \text{С},\text{нг}/\text{см}^{3}, (3)
где \delta_{\text{гр}} — погрешность построения градуировочной характеристики, %.
Значения погрешностей построения градуировочных характеристик антибиотиков приведены в табл. 9.8.
Значения погрешностей построения градуировочных характеристик
При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики (2) эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики, строят новую градуировочную характеристику.
Градуировочную характеристику строят заново при смене реактивов или хроматографической колонки, а также в случае других существенных изменений условий хроматографического анализа.
X. Отбор и хранение проб
10.1. Отбор проб воды проводят в соответствии с методическими документами <8>.
<8> ГОСТ Р 56237 «Вода питьевая. Отбор проб на станциях водоподготовки и в трубопроводных распределительных системах», утвержденный приказом Росстандарта от 17.11.2014 № 1628-ст; ГОСТ Р 59024 «Вода. Общие требования к отбору проб», утвержденный приказом Росстандарта от 10.09.2020 № 640-ст.
10.2. Транспортируют и хранят пробы в посуде из темного стекла с завинчивающейся крышкой с фторопластовым вкладышем. Требуемый объем пробы должен быть не менее 250 см3.
10.3. При работе с пробами питьевой воды централизованного водоснабжения, воды бассейнов и аквапарков сразу после отбора добавить в пробу 2%-й раствор натрия тиосульфата из расчета 0,25 см3 на 250 см3 воды.
10.4. Допускается хранение отобранных проб воды при температуре плюс 4 — 15 °C не более 2 суток.
XI. Выполнение измерений
11.1 Подготовка проб.
11.1.1. Подготовку проб для определения эритромицина проводят в соответствии с п. 9.5.2, используя для ТФЭ 10 см3 анализируемой воды. Концентрирование пробы воды в 10 раз.
11.1.2. Подготовку проб для определения азитромицина, амоксициллина, кларитромицина и ципрофлоксацина проводят в соответствии с п. 9.5.3, используя для ТФЭ 10 см3 анализируемой воды. Концентрирование пробы воды в 50 раз.
11.1.3. Перед выполнением прямых измерений ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина пробу воды фильтруют через шприцевой фильтр из полиамида с диаметром пор 0,2 мкм в хроматографическую виалу.
11.2 Порядок выполнения измерений.
11.2.1. Перед анализом антибиотиков в исследуемых пробах воды проводят анализ холостого образца, в качестве которого используют деионизированную воду, прошедшую пробоподготовку в соответствии с п. 11.1.1 - 11.1.3 в зависимости от анализируемого антибиотика.
11.2.2. Для измерения массовых концентраций антибиотиков в анализируемом растворе (мг/дм3) вводят в хроматограф 10 мм3 подготовленной пробы.
11.2.3. Анализируют две параллельные пробы в рабочем режиме хромато-масс-спектрометрической системы (п. 9.4.2).
XII. Обработка результатов измерений
12.1. Расчет массовых концентраций эритромицина, азитромицина, амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина в воде проводят с использованием программного обеспечения прибора в автоматическом режиме или вычисляют по формуле (4):
\text{С } = \frac{S_{i} \cdot K \cdot V_{1}}{V_{2} \cdot k} ,\text{мг}/\text{дм}^{3}, (4)
где C — массовая концентрация антибиотика в анализируемой пробе, мг/дм3;
Si — площадь пика основного дочернего иона антибиотика на хроматограмме в анализируемой пробе, усл. ед.;
K — градуировочный коэффициент для определения массовой концентрации соответствующего антибиотика в экстракте, нг/(см3·усл. ед.);
k — коэффициент концентрирования (k = 10 для расчета массовых концентраций эритромицина в воде; k = 50 для расчета массовых концентраций азитромицина, амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина в воде);
V1 — объем экстракта, см3 (V1 = 1 см3 для эритромицина; V1 = 0,2 см3 для азитромицина, амоксициллина, кларитромицина, ципрофлоксацина);
V2 — объем анализируемой пробы, мм3 (V2 = 10 мм3).
12.2. Расчет массовых концентраций ампициллина, бензилпенициллина и оксациллина в воде проводят с использованием программного обеспечения прибора в автоматическом режиме или вычисляют по формуле (5):
\text{С } = \frac{S_{i} \cdot K}{1000} ,\text{мг}/\text{дм}^{3}, (5)
где C — массовая концентрация антибиотика в анализируемой пробе, мг/дм3;
Si — площадь пика основного дочернего иона антибиотика на хроматограмме в анализируемой пробе, усл. ед.;
K — градуировочный коэффициент для определения массовой концентрации соответствующего антибиотика в пробе воды, нг/(см3·усл. ед.).
12.3. За результат измерения массовой концентрации антибиотиков в воде \overline{C} принимают среднее арифметическое значение двух результатов параллельных измерений C1, C2, для которых выполняется условие (6):
|C_{1} - C_{2}| \leq 0,01 \cdot r \cdot \frac{C_{1} + C_{2}}{2} , (6)
где r — предел повторяемости, %.
Относительные значения предела повторяемости приведены в табл. 12.1.
Диапазоны измерений антибиотиков в воде, значения пределов повторяемости, критического диапазона, пределов воспроизводимости при доверительной вероятности P = 0,95
При невыполнении условия (6) получают еще два результата параллельных измерений.
Если максимальное абсолютное расхождение между наибольшим и наименьшим результатами измерений не превышает критического диапазона CR0,95(4), %, приведенного в табл. 12.1 для P = 0,95 и n = 4, и выполняется условие (7):
|C_{max} - C_{min}| \leq 0,01 \cdot CR_{0,95}(4) \cdot \frac{C_{1} + C_{2} + C_{3} + C_{4}}{4} , (7)
то в этом случае все четыре результата признают приемлемыми и за окончательный результат принимают среднее арифметическое четырех измерений.
При невыполнении условия (7) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (6) и (7).
XIII. Оформление результатов измерений
13.1 Результат измерений представляют в виде выражения (8):
(\overline{C} \pm \Delta)\text{мг}/\text{дм}^{3}, P = 0,95, (8)
где \overline{C} — результат измерений массовой концентрации антибиотика в воде, мг/дм3;
\Delta — характеристика погрешности при P = 0,95, рассчитанная по формуле (9):
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{C}}{100} ,\text{мг}/\text{дм}^{3}, (9)
где \delta — относительное значение характеристики погрешности, %. Значение \delta приведено в табл. 3.1.
Допустимо результат измерений в документах, выдаваемых лабораторией, представлять в виде выражения (9):
(\overline{C} \pm \Delta_{\text{л}})\text{мг}/\text{дм}^{3}, P = 0,95, при условии: \Delta_{\text{л}}<\Delta , (10)
где \pm \Delta_{\text{л}} — значение характеристики погрешности результатов измерений, установленное при внедрении методики в лаборатории и обеспечиваемое контролем стабильности результатов измерений, мг/дм3.
13.2. Численное значение C должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение (\Delta_{\text{л}}) .
XIV. Процедуры обеспечения достоверности измерений
14.1. Контроль точности результатов измерений организуют и проводят путем проведения проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости (п. 12.3), воспроизводимости (п. 14.2), оперативного контроля процедуры измерений (п. 14.3), контроля стабильности градуировочной характеристики (п. 9.5.7) и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с методическими документами <9>.
14.2. Проверка приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости.
Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, являются образцы деионизированной воды с внесенными в них добавками растворов антибиотиков, подготовленных в соответствии с п. 9.5.2 - 9.5.5.
Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, проводят по результатам измерений массовых концентраций антибиотиков в деионизированной воде с одинаковым содержанием измеряемых соединений.
Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия (11):
\frac{|\text{С}_{1} - \text{С}_{2}|}{(\text{С}_{1} + \text{С}_{2})/2} \cdot 100\% \leq R, (11)
где C1 и C2 — результаты измерений массовых концентраций антибиотиков в воде, полученные в условиях воспроизводимости, мг/дм3;
R — предел воспроизводимости (относительное значение), %. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 12.1.
Если условие (10) не выполняется, процедуру повторяют. При повторном превышении предела воспроизводимости выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
14.3. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок.
Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок, являются образцы деионизированной воды с внесенными в них добавками растворов антибиотиков, подготовленных в соответствии с п. 9.5.2 - 9.5.5.
Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры Кк с нормативом контроля К.
Результат контрольной процедуры Кк рассчитывают по формуле (12):
\text{К}_{\text{к}} = |\overline{\text{С}\prime} - \overline{\text{С}} - \text{С}_{\text{д}}|, (12)
\overline{\text{С}\prime} — результат измерений массовой концентрации антибиотика в пробе с известной добавкой — среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (6), мг/дм3;
\overline{\text{С}} — результат измерений массовой концентрации антибиотика в исходной пробе — среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (6), мг/дм3;
Cд — величина введенной добавки, мг/дм3.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле (13):
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{С}\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{С}}^{2}} , (13)
где \Delta_{\text{л},\text{С}\prime} , \Delta_{\text{л},\text{С}} — значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации антибиотика в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мг/дм3.
Примечание: допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражений (14) и (15):
\Delta_{\text{л},\text{С}\prime} = 0,84 \cdot 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{\text{С}\prime}; (14)
\Delta_{\text{л},\text{С}} = 0,84 \cdot 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{\text{С}}, (15)
с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.
Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия (16):
При невыполнении условия (16) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (16) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
14.4. Периодичность контроля приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. СанПиН 1.2.3685-21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания».
3. Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением.
4. ПНД Ф 12.13.1-03 «Методические рекомендации. Техника безопасности при работе в аналитических лабораториях (общие положения)».
5. РМГ 61-2010 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки».
6. ГОСТ 12.1.004 «Пожарная безопасность. Общие требования».
7. ГОСТ 12.1.005 «Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».
8. ГОСТ 12.1.007 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
9. ГОСТ 12.1.019 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
10. ГОСТ 12.4.009 «Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
11. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия».
12. ГОСТ 2768 «Ацетон технический. Технические условия».
13. ГОСТ 8981 «Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия».
14. ГОСТ 27068 «Натрий серноватистокислый (натрия тиосульфат) 5-водный. Технические условия».
15. ГОСТ 28311 «Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».
16. ГОСТ Р ИСО 5725-1 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».
17. ГОСТ Р ИСО 5725-2 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».
18. ГОСТ Р ИСО 5725-3 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».
19. ГОСТ Р ИСО 5725-4 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений».
20. ГОСТ Р ИСО 5725-5 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений».
21. ГОСТ Р ИСО 5725-6 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
22. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
23. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
24. ГОСТ Р 56237 «Вода питьевая. Отбор проб на станциях водоподготовки и в трубопроводных распределительных системах».
25. ГОСТ Р 59024 «Вода. Общие требования к отбору проб».
26. ГОСТ ISO 7886-1 «Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования».