---
title: "\"МУК 4.1.3792-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточного содержания стероидных гормонов в рыбе и морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС/МС). Методические указания\""
number: "МУК 4.1.3792-22"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3792-22"
---

## "МУК 4.1.3792-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточного содержания стероидных гормонов в рыбе и морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС/МС). Методические указания"

# "МУК 4.1.3792-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточного содержания стероидных гормонов в рыбе и морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС/МС). Методические указания"

(утв. Роспотребнадзором 27.10.2022)


<a id="p100001"></a>Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**А.Ю.ПОПОВА**
27 октября 2022 года


#### <a id="p100002"></a>4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


<a id="p100003"></a>**ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ**
**В РЫБЕ И МОРЕПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ**
**ХРОМАТОГРАФИИ В СОЧЕТАНИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ АНАЛИЗОМ**
**(ВЭЖХ-МС/МС)**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.3792-22**

<a id="p100005"></a>Методические указания разработаны ФГБУН "Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи" (В.А. Тутельян, Д.Б. Никитюк, С.А. Хотимченко, И.Е. Соколов, О.В. Багрянцева, З.Г. Гурэу, А.Д. Малинкин, А.И. Колобанов); ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Е.В. Елизарова).


### <a id="p100006"></a>I. Общие положения и область применения


<a id="p100007"></a>1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают методику определения остаточных количеств стероидных гормонов в рыбе, используемых в процессе ее выращивания в условиях аквакультуры и прудах в соответствии с законодательными требованиями по использованию водных объектов рыбохозяйственного значения для целей рыболовства [<1>](#p100009), методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (далее - ВЭЖХ-МС/МС).

<a id="p100008"></a>

---

<a id="p100009"></a><1> Федеральный закон от 02.07.2013 N 148-ФЗ "Об аквакультуре (рыбоводстве) и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации".

<a id="p100010"></a>1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для производственного контроля испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке [<2>](#p100012).

<a id="p100011"></a>

---

<a id="p100012"></a><2> Федеральный закон от 28.12.2013 N 412-ФЗ "Об аккредитации в национальной системе аккредитации"; Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 05.12.2018 N 100 "О Порядке включения аккредитованных органов по оценке соответствия (в том числе органов по сертификации, испытательных лабораторий (центров)) в единый реестр органов по оценке соответствия Евразийского экономического союза, а также его формирования и ведения".


#### <a id="p100013"></a>1.3 МУК носят рекомендательный характер.



### <a id="p100014"></a>II. Физико-химические свойства стероидных гормонов


<a id="p100015"></a>2.1. Эстрон - женский половой стероидный гормон. Систематическое название - 1,3,5-эстратриен-3-ол-17-он [<3>](#p100017). Химическая формула: C18H22O2. Молекулярный вес: 270,37 г/моль. Регистрационный номер CAS: 53-16-7. Синонимы: 3-Hydroxy-1,3,5(10)-estratrien-17-one; 1,3,5(10)-Estratrien-3-ol-17-one; Folliculin.

<a id="p100016"></a>

---

<a id="p100017"></a><3> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC, далее - ИЮПАК).

<a id="p100018"></a>Дигидротестостерон - биологически более активная форма стероидного гормона тестостерона. Систематическое название - $5\alpha - \text{дигидротестостерон} - D3$ (16,16,17-D3) [<4>](#p100020). Химическая формула: C19H30O2. Молекулярный вес: 290,45 г/моль. Регистрационный номер CAS: 521-18-6.

<a id="p100019"></a>

---

<a id="p100020"></a><4> В соответствии с ИЮПАК.

<a id="p100021"></a> $17\alpha - \text{метилтестостерон}$ - синтетический стероидный гормон, метилпроизводное тестостерона. Систематическое название - 17-метилтестостерон, $17\alpha - \text{метиландростен} - 4 - \text{ол} - 17\beta - \text{он} - 3$ [<5>](#p100023). Химическая формула: C20H30O2. Молекулярный вес: 302,45 г/моль. Регистрационный номер CAS: 58-18-4. Синонимы: Mesterone; $17\alpha - Methyl - 4 - androsten - 17\beta - ol - 3 - one$ ; $17\beta - Hydroxy - 17\alpha - methyl - 4 - androsten - 3 - one$ ; Methyltestosterone.

<a id="p100022"></a>

---

<a id="p100023"></a><5> В соответствии с ИЮПАК.

<a id="p100024"></a>Местанолон - андроген, анаболический стероидный гормон. Химическая формула C<sub>20</sub>H<sub>32</sub>O<sub>2</sub>. Молекулярный вес: 304,47 г/моль. Регистрационный номер CAS: 521-11-9. Синонимы: Methylandrostanolone, Mestanolone, $5\alpha - Androstane - 17\alpha - methyl - 17\beta - ol - 3 - one$ , $17\alpha - Methyldihydrotestosterone$ , $17\beta - Hydroxy - 17\alpha - methyl - 5\alpha - androstan - 3 - one$ , Mestaline, $17\alpha - Methylandrostan - 17\beta - ol - 3 - one$ .
<a id="p100025"></a>Химические названия и химические формулы веществ изображены на [рис. 1](#p100027).

<a id="p100026"></a> ![II. Физико-химические свойства стероидных гормонов](https://i.bukva.ai/Dz19JJR7/img_0.png) 

<a id="p100027"></a>Рис. 1. Структурные формулы эстрона, дигидростерона,
 $17\alpha - \text{метилстерона}$ , местанолона


### <a id="p100028"></a>III. Метод измерений


<a id="p100029"></a>3.1. Метод основан на экстракции стероидных гормонов из гомогенизированного мяса рыбы раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле с последующей твердофазной экстракцией и дериватизацией раствором гидроксиламина в метиловом спирте. Количественное определение производных гормонов производится при помощи метода ВЭЖХ-МС/МС с использованием внешней калибровки.


### <a id="p100030"></a>IV. Метрологические характеристики


<a id="p100031"></a>4.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в [табл. 1](#p100033) для соответствующих диапазонов концентраций.

<a id="p100032"></a>Таблица 1

<a id="p100033"></a>Метрологические характеристики


| <a id="p100034"></a>Анализируемый объект | <a id="p100035"></a>Диапазон определяемых концентраций, мкг/кг | <a id="p100036"></a>Показатель точности (границы относительной погрешности) $\pm \delta$ , %<br>(P = 0,95) | <a id="p100037"></a>Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), $\sigma_{r}$ , % | <a id="p100038"></a>Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), $\sigma_{R}$ , % | <a id="p100039"></a>Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, % | <a id="p100040"></a>Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, %<br>(P = 0,95) |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100041"></a>Эстрон | <a id="p100042"></a>0,2 - 10 | <a id="p100043"></a>40 | <a id="p100044"></a>11,2 | <a id="p100045"></a>11,6 | <a id="p100046"></a>31 | <a id="p100047"></a>32 |
| <a id="p100048"></a>Дигидротестостерон | <a id="p100049"></a>0,2 - 10 | <a id="p100050"></a>43 | <a id="p100051"></a>7,0 | <a id="p100052"></a>9,0 | <a id="p100053"></a>20 | <a id="p100054"></a>25 |
| <a id="p100055"></a>$17\alpha - \text{метилтестостерон}$ | <a id="p100056"></a>0,2 - 10 | <a id="p100057"></a>37 | <a id="p100058"></a>6,4 | <a id="p100059"></a>9,0 | <a id="p100060"></a>18 | <a id="p100061"></a>25 |
| <a id="p100062"></a>Местанолон | <a id="p100063"></a>0,4 - 10 | <a id="p100064"></a>51 | <a id="p100065"></a>11,5 | <a id="p100066"></a>14,6 | <a id="p100067"></a>32 | <a id="p100068"></a>41 |



### <a id="p100069"></a>V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы


<a id="p100070"></a>5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в [табл. 2](#p100072) - [4](#p100118).

<a id="p100071"></a>Таблица 2

<a id="p100072"></a>Средства измерений


| <a id="p100073"></a>Наименование средств измерения | <a id="p100074"></a>Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| --- | --- |
| <a id="p100075"></a>Хроматограф жидкостный с масс-спектрометрическим детектором | <a id="p100076"></a>Внесено в реестр "Утвержденные типы средств измерений" Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| <a id="p100077"></a>Весы лабораторные аналитические | <a id="p100078"></a>Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228 |
| <a id="p100079"></a>Дозаторы медицинские лабораторные | <a id="p100080"></a>ДПОП-1-10-100, ДПОП-1-100-1000, ДПОП-1-1000-10000 по [ГОСТ 28311](https://bukva.ai/docs/standart-gost-28311-2021) |


<a id="p100081"></a>*Примечание.* Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

<a id="p100082"></a>Таблица 3

<a id="p100083"></a>Вспомогательное оборудование и материалы


| <a id="p100084"></a>Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | <a id="p100085"></a>Обозначение документов, технических характеристик |
| --- | --- |
| <a id="p100086"></a>Центрифуга лабораторная термостатируемая | <a id="p100087"></a>С максимальной скоростью не менее 14000 об/мин для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 - 2 см3 и не менее 7000 об/мин для центрифужных пробирок объемом 15, 50 см3. Диапазон рабочих температур от плюс 4 до 25 °C |
| <a id="p100088"></a>Пробирки центрифужные | <a id="p100089"></a>Полипропиленовые с винтовой крышкой вместимостью 15 и 50 см3 |
| <a id="p100090"></a>Пробирки микроцентрифужные типа "Эппендорф" | <a id="p100091"></a>Полипропиленовые с герметичной крышкой вместимостью от 1,5 до 2 см3 |
| <a id="p100092"></a>Гомогенизатор лабораторный | <a id="p100093"></a>- |
| <a id="p100094"></a>Концентратор лабораторный | <a id="p100095"></a>Концентрирование в токе азота. Максимальная рабочая температура не менее плюс 40 °C |
| <a id="p100096"></a>Ложки и шпатели | <a id="p100097"></a>По ГОСТ 9147 |
| <a id="p100098"></a>Хроматографическая колонка | <a id="p100099"></a>Заполненная обращенно-фазным сорбентом C18, зернение не более 3,5 мкм |
| <a id="p100100"></a>Наконечники для дозаторов медицинских лабораторных | <a id="p100101"></a>Номинальный объем 0,01 - 0,1 см3; 0,05 - 1 см3; 1 - 10 см3 |
| <a id="p100102"></a>Хроматографические виалы | <a id="p100103"></a>С винтовой крышкой, вместимостью 2 см3 |
| <a id="p100104"></a>Перемешивающее устройство типа "вортекс" | <a id="p100105"></a>Диапазон вращающего момента не меньше 1000 - 3000 об/мин |
| <a id="p100106"></a>Лабораторный мультиротатор | <a id="p100107"></a>С программируемыми типами вращения |
| <a id="p100108"></a>Шейкер-инкубатор | <a id="p100109"></a>Максимальная рабочая температура не менее плюс 40 °C |
| <a id="p100110"></a>Ультразвуковая ванна | <a id="p100111"></a>Частота не менее 35 Гц |
| <a id="p100112"></a>Колбы мерные | <a id="p100113"></a>Тип 2-10-2, 2-100-2, 2-1000-2 по [ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) |
| <a id="p100114"></a>Холодильник комбинированный лабораторный | <a id="p100115"></a>Минимальная температура в холодильной камере не выше плюс 4 °C<br>Минимальная температура в морозильной камере не выше минус 25 °C |


<a id="p100116"></a>*Примечание.* Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

<a id="p100117"></a>Таблица 4

<a id="p100118"></a>Реактивы


<table>
<colgroup><col width="43%"><col width="57%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100119"></a>Наименование реактивов</td><td><a id="p100120"></a>Обозначение и наименование документов, технические характеристики</td></tr>
<tr><td><a id="p100121"></a>1</td><td><a id="p100122"></a>2</td></tr>
<tr><td><a id="p100123"></a>Азот газообразный</td><td><a id="p100124"></a>Особой чистоты (далее - ОСЧ) (I и II сорт) по ГОСТ 9293</td></tr>
<tr><td><a id="p100125"></a>Аргон в баллонах</td><td><a id="p100126"></a>По нормативным документам</td></tr>
<tr><td><a id="p100127"></a>Ацетонитрил для хроматографии</td><td><a id="p100128"></a>ОСЧ</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100129"></a><a id="p100130"></a>Вода для лабораторного анализа<br>Бидистиллированная по <a href="https://bukva.ai/docs/gost-r-52501-2005">ГОСТ 52501</a></td></tr>
<tr><td><a id="p100131"></a>Метиловый спирт для хроматографии</td><td><a id="p100132"></a>ОСЧ</td></tr>
<tr><td><a id="p100133"></a>Муравьиная кислота для хроматографии</td><td><a id="p100134"></a>Чистый для анализа (далее - ЧДА)</td></tr>
<tr><td><a id="p100135"></a>Натрий хлористый (NaCl)</td><td><a id="p100136"></a>ХЧ по ГОСТ 4233</td></tr>
<tr><td><a id="p100137"></a>Магний сернокислый (MgSO4)</td><td><a id="p100138"></a>ХЧ по <a href="https://bukva.ai/docs/gost-4523-77">ГОСТ 4523</a></td></tr>
<tr><td><a id="p100139"></a>Гидроксиламина гидрохлорид (NH2OH·HCl)</td><td><a id="p100140"></a>ЧДА по <a href="https://bukva.ai/docs/gost-5456-79">ГОСТ 5456</a></td></tr>
<tr><td><a id="p100141"></a>Первичные и вторичные амины (PSA)</td><td><a id="p100142"></a>Средний размер частиц не более 40 мкм</td></tr>
<tr><td><a id="p100143"></a>Силикагель с привитыми октадецильными группами C18 (C18)</td><td><a id="p100144"></a>Средний размер частиц не более 40 мкм</td></tr>
<tr><td><a id="p100145"></a>Эстрон (аналитический стандарт)</td><td><a id="p100146"></a>Содержание основного вещества не менее 98,0%</td></tr>
<tr><td><a id="p100147"></a>Дигидротестостерон (аналитический стандарт)</td><td><a id="p100148"></a>Содержание основного вещества не менее 99,5%</td></tr>
<tr><td><a id="p100149"></a>$17\alpha - \text{метилтестостерон}$ (аналитический стандарт)</td><td><a id="p100150"></a>Содержание основного вещества не менее 97,4%</td></tr>
<tr><td><a id="p100151"></a>Местанолон (аналитический стандарт)</td><td><a id="p100152"></a>Содержание основного вещества не менее 98,0%</td></tr>
<tr><td></td><td><a id="p100153"></a>Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.</td></tr>
</table>



### <a id="p100154"></a>VI. Безопасность проведения измерений и квалификация операторов


<a id="p100155"></a>6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать технику безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также технику безопасности, изложенную в технической документации на прибор.
<a id="p100156"></a>6.2. Помещение должно соответствовать пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
<a id="p100157"></a>6.3. Помещение, в котором проводится определение стероидных гормонов, оборудуется приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции по подготовке образцов к анализу необходимо проводить в вытяжном шкафу. Анализ содержания стероидных гормонов в подготовленных образцах проводится в специализированном проветриваемом помещении, оснащенном вытяжкой, при температуре не более плюс 25 °C с целью защиты дыхания.
<a id="p100158"></a>6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химико-аналитической лаборатории. Измерения в соответствии с настоящими методическими указаниями может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.


### <a id="p100159"></a>VII. Отбор проб


<a id="p100160"></a>7.1. Отбор проб рыбы для проведения анализа осуществляется по [ГОСТ 31339](https://bukva.ai/docs/standart-501-st). Подготовка к анализу средней пробы рыбы (свежая, охлажденная, мороженая) осуществляется по [ГОСТ 7636](https://bukva.ai/docs/gost-7636-85).


### <a id="p100161"></a>VIII. Условия измерений



#### <a id="p100162"></a>8.1 Условия проведения измерений.

<a id="p100163"></a>При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- <a id="p100164"></a>процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 - 30 °C и относительной влажности не более 85%;
- <a id="p100165"></a>выполнение измерений на жидкостном хроматографе и масс-спектрометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к приборам.


### <a id="p100166"></a>IX. Подготовка к выполнению измерений



#### <a id="p100167"></a>9.1 Приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ.


##### <a id="p100168"></a>9.1.1 Приготовление компонента A подвижной фазы.

<a id="p100169"></a>Для приготовления компонента A подвижной фазы (0,1%-й (объем) раствор муравьиной кислоты в воде): в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 300 - 400 см3 бидистиллированной воды, вносят 1 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.
<a id="p100170"></a>Приготовленный раствор подвижной фазы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более пяти рабочих дней.

##### <a id="p100171"></a>9.1.2 Приготовление компонента B подвижной фазы.

<a id="p100172"></a>Для приготовления компонента B подвижной фазы (0,1%-й (объем) раствор муравьиной кислоты в метиловом спирте): в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 300 - 400 см3 метилового спирта, вносят 1 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, доводят метиловым спиртом до метки, вновь перемешивают.
<a id="p100173"></a>Приготовленный раствор подвижной фазы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

#### <a id="p100174"></a>9.2 Приготовление растворов.

<a id="p100175"></a>9.2.1. Приготовление раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле с объемной долей 1% (1%-й раствор).
<a id="p100176"></a>В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 30 - 40 см3 ацетонитрила, вносят 1 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают.
<a id="p100177"></a>Приготовленный раствор подвижной фазы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.
<a id="p100178"></a>9.2.2. Приготовление 100 мМ раствора гидроксиламина гидрохлорида в метиловом спирте.
<a id="p100179"></a>В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 0,07 г гидроксиламина гидрохлорида, помещают 3 - 4 см3 метилового спирта, перемешивают, доводят метиловым спиртом до метки, вновь перемешивают.
<a id="p100180"></a>Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

##### <a id="p100181"></a>9.2.3 Подготовка сернокислого магния.

<a id="p100182"></a>Используемый при проведении экстракции в качестве сорбента сернокислый магний в пределах срока годности необходимо высушивать для удаления влаги. Сорбент прокаливают при температуре плюс 180 - 200 °C в течение 6 - 10 часов и хранят в эксикаторе над безводным хлористым кальцием.
<a id="p100183"></a>Критерием годности реактива служит отсутствие дополнительного водного слоя при проведении стадии экстракции до температуры плюс 30 - 40 °C и через 2 - 3 минуты перемешивания реакционной массы.
<a id="p100184"></a>9.3. Приготовление индивидуальных, стоковых и градуировочных растворов, матричных градуировочных стандартов.
<a id="p100185"></a>9.3.1. Приготовление индивидуальных стандартных растворов стероидных гормонов.
<a id="p100186"></a>Для приготовления индивидуальных стандартных растворов стероидных гормонов эстрона, дигидротестостерона, $17\alpha - \text{метилтестостерона}$ и местанолона в ацетонитриле с концентрацией 1 мг/см3 в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 10 мг каждого стандартного образца стероидных гормонов, помещают 3 - 4 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают.
<a id="p100187"></a>Индивидуальные стандартные растворы стероидных гормонов хранят при температуре минус 24 - 18 °C не более 6 месяцев.

##### <a id="p100188"></a>9.3.2 Приготовление стокового раствора стероидных гормонов.

<a id="p100189"></a>Для приготовления стокового раствора стероидных гормонов эстрона, дигидротестостерона, $17\alpha - \text{метилтестостерона}$ и местанолона в ацетонитриле с концентрацией 10 мкг/см3 в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 3 - 4 см3 ацетонитрила, 0,1 см3 каждого стандартного раствора (по [п. 9.3.1](#p100185)), перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают.
<a id="p100190"></a>Стоковый раствор стероидных гормонов хранят при температуре минус 24 - 18 °C не более 3 месяцев.

##### <a id="p100191"></a>9.3.3 Приготовление градуировочных растворов стероидных гормонов.

<a id="p100192"></a>Градуировочные растворы стероидных гормонов эстрона, дигидротестостерона, $17\alpha - \text{метилтестостерона}$ и местанолона в ацетонитриле с концентрацией 10, 20, 50, 100, 200, 400 и 500 нг/см3 готовятся последовательным разведением стокового раствора (по [п. 9.3.2](#p100188)) в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 - 2 см3. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 6 контрольных точек.
<a id="p100193"></a>Градуировочные растворы стероидных гормонов хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 дня.
<a id="p100194"></a>9.3.4. Приготовление матричных градуировочных стандартов стероидных гормонов.
<a id="p100195"></a>Для построения градуировочной характеристики берут "чистые" пробы, не содержащие определяемые аналиты более 0,2 мкг/кг (например, мясо морских рыб (минтай, треска, горбуша)). Пробу измельчают в лабораторном гомогенизаторе до однородного состояния. Добавляют градуировочные растворы стероидных гормонов в ацетонитриле (по [п. 9.3.3](#p100191)) из расчета 0,1 см3 на каждые 5 г образца с перемешиванием 1 мин на устройстве типа "вортекс".
<a id="p100196"></a>Матричные градуировочные стандарты хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 дня.

#### <a id="p100197"></a>9.4 Контроль стабильности градуировочной характеристики.


##### <a id="p100198"></a>9.4.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

<a id="p100199"></a>Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов. При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух матричных градуировочных стандартов, содержание стероидных гормонов в которых входит в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,2 - 10 мкг/кг. Градуировочная зависимость считается стабильной, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой составляет не менее 0,99.

##### <a id="p100200"></a>9.4.2 Построение градуировочной кривой.

<a id="p100201"></a>Построение градуировочной кривой проводится по отношению площади хроматографического пика фрагментного иона (S., I*сек) к массовой концентрации (мкг/кг) в 6 градуировочных стандартах по [п. 10.2](#p100213). Зависимость линейная, взвешивание равное ([рис. 2](#p100203) - [5](#p100209)). Построение графиков может проводиться при помощи встроенной программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи других программ расчета градуировочных характеристик.

<a id="p100202"></a> ![IX. Подготовка к выполнению измерений](https://i.bukva.ai/Dz19JJR7/img_1.jpg) 

<a id="p100203"></a>Рис. 2. Градуировочная кривая стероидного гормона эстрона,
построенная по отношению площади хроматографического пика
(S., I*сек) фрагментного иона 253 Да к массовой
концентрации (мкг/кг)



<a id="p100204"></a> ![IX. Подготовка к выполнению измерений](https://i.bukva.ai/Dz19JJR7/img_2.jpg) 

<a id="p100205"></a>Рис. 3. Градуировочная кривая стероидного гормона
дигидротестостерона, построенная по отношению площади
хроматографического пика (S., I*сек) фрагментного иона
255 Да к массовой концентрации (мкг/кг)



<a id="p100206"></a> ![IX. Подготовка к выполнению измерений](https://i.bukva.ai/Dz19JJR7/img_3.jpg) 

<a id="p100207"></a>Рис. 4. Градуировочная кривая стероидного гормона
 $17\alpha - \text{метилтестостерона}$ , построенная по отношению площади
хроматографического пика (S., I*сек) фрагментного иона
124 Да к массовой концентрации (мкг/кг)



<a id="p100208"></a> ![IX. Подготовка к выполнению измерений](https://i.bukva.ai/Dz19JJR7/img_4.jpg) 

<a id="p100209"></a>Рис. 5. Градуировочная кривая стероидного гормона
местанолона, построенная по отношению площади
хроматографического пика (S., I*сек) фрагментного иона
229 Да к массовой концентрации (мкг/кг)


#### <a id="p100210"></a>9.5 Подготовка проб рыбы к анализу.

<a id="p100211"></a>9.5.1. Навеску проб рыбы, измельченных с помощью гомогенизатора градуировочного стандарта, массой 5 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3. Вносят 10 см3 бидистиллированной воды, перемешивают и помещают в ультразвуковую ванну на 20 минут. Добавляют 10 см3 раствора ацетонитрила (по [п. 9.2.1](#p100175)) и перемешивают в течение 30 мин на лабораторном мультиротаторе. В пробу добавляют 1 г NaCl и 4 г MgSO4 (по [п. 9.2.3](#p100181)). После добавления солей смесь интенсивно перемешивают в течение 2 мин. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин со скоростью не менее 3500 об/мин при температуре плюс 4 °C. Аликвоту экстракта объемом 6 см3 с помощью пипеточного дозатора помещают в центрифужную пробирку объемом 15 см3, содержащую 150 мг первичных и вторичных аминов (PSA) и 150 мг C18. Перемешивают в течение 1 мин на перемешивающем устройстве типа "вортекс" и центрифугируют в течение 5 мин со скоростью не менее 7000 об./мин при комнатной температуре. Аликвоту экстракта объемом 5 см3 с помощью пипеточного дозатора помещают в центрифужную пробирку объемом 15 см3 и упаривают досуха в лабораторном концентраторе при температуре плюс 40 °C. Затем добавляют 0,5 см3 раствора гидроксиламина гидрохлорида (по [п. 9.2.2](#p100178)), перемешивают в течение 1 мин на перемешивающем устройстве типа "вортекс" и инкубируют при температуре плюс 40 °C в течение 20 мин в шейкере-инкубаторе. После инкубации полученный раствор повторно упаривают в лабораторном концентраторе досуха и перерастворяют в 1 см3 ацетонитрила. Помещают в ультразвуковую ванну на 5 мин, затем перемешивают в течение 1 мин на перемешивающем устройстве типа "вортекс". С помощью пипеточного дозатора аликвоту объемом не менее 0,8 см3 помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 - 2 см3 и центрифугируют в течение 5 мин со скоростью не менее 14000 об/мин при температуре плюс 4 °C. Затем с помощью пипеточного дозатора аликвоту объемом не менее 0,5 см3 помещают в хроматографическую виалу для проведения ВЭЖХ-МС/МС анализа. В инжектор хроматографа вводят не менее 0,005 см3 каждого экстракта в двух повторах и анализируют в условиях по [п. 10.2](#p100213).


### <a id="p100212"></a>X. Проведение измерений


<a id="p100213"></a>10.1. Для осуществления хроматографического анализа используют жидкостной хроматограф, снабженный бинарным насосом, автосамплером и термостатом колонок. Для осуществления масс-спектрометрического анализа используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр с детектором типа "тройной квадруполь".

##### <a id="p100214"></a>10.1.1 Условия проведения измерений ВЭЖХ-МС/МС.

<a id="p100215"></a>Условия проведения ВЭЖХ-МС/МС измерения приведены в [табл. 5](#p100217).

<a id="p100216"></a>Таблица 5

<a id="p100217"></a>Условия проведения измерении ВЭЖХ-МС/МС


<table>
<colgroup><col width="43%"><col width="57%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100218"></a>Параметр</td><td><a id="p100219"></a>Значение</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100220"></a>Бинарный насос</td></tr>
<tr><td><a id="p100221"></a>- Состав подвижной фазы</td><td><a id="p100222"></a><a id="p100223"></a>A - водный раствор муравьиной кислоты 0,1%<br>B - метанольный раствор муравьиной кислоты 0,1%</td></tr>
<tr><td><a id="p100224"></a>- Режим элюирования</td><td><a id="p100225"></a><a id="p100226"></a><a id="p100227"></a><a id="p100228"></a><a id="p100229"></a><a id="p100230"></a>Градиентное элюирование:<br>0 мин - 20% B;<br>4 мин - 100% B;<br>8 мин - 100% B;<br>9 мин - 20% B;<br>13 мин - 20% B</td></tr>
<tr><td><a id="p100231"></a>- Скорость потока</td><td><a id="p100232"></a>0,4 см3/мин</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100233"></a>Рабочие параметры:</td></tr>
<tr><td><a id="p100234"></a>Температура термостата</td><td><a id="p100235"></a>40 °C</td></tr>
<tr><td><a id="p100236"></a>Объем вводимой пробы</td><td><a id="p100237"></a>0,005 см3</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100238"></a>Измерение масс <a href="#p100248">&lt;*&gt;</a></td></tr>
<tr><td><a id="p100239"></a>- Источник ионизации</td><td><a id="p100240"></a>Прогреваемый электроспрей</td></tr>
<tr><td><a id="p100241"></a>- Режим ионизации</td><td><a id="p100242"></a>Регистрация положительных ионов</td></tr>
<tr><td><a id="p100243"></a>- Детектируемые массы, Да</td><td><a id="p100244"></a><a id="p100245"></a><a id="p100246"></a>Эстрон [M+NH+H]+: 286 -&gt; 253, 286 -&gt; 157; Дигидротестостерон [M+NH+H]+: 306 -&gt; 255, 306 -&gt; 159;<br>$17\alpha - \text{метилтестостерон}$ [M+NH+H]+: 318 -&gt; 124, 318 -&gt; 112;<br>Местанолон [M+NH+H]+: 320 -&gt; 229, 320 -&gt; 213</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100247"></a><a id="p100248"></a>Примечание.<br>&lt;*&gt; Детектирование проводится методом регистрации множественных реакций (англ. Multiple reaction monitoring, MRM). Для стероидных гормонов измеряется сигнал двух фрагментных ионов. Первый, более интенсивный, пик служит для количественного определения концентрации гормонов в рыбе, второй используется для подтверждения правильности определения. Энергия соударения (англ. Collision energy, CE) подбирается экспериментально с использованием стандартного образца. Критерием правильности подбора является достижение максимальной интенсивности каждого из фрагментов.</td></tr>
</table>



### <a id="p100249"></a>XI. Обработка результатов измерений



#### <a id="p100250"></a>11.1 Обработка полученных результатов.

<a id="p100251"></a>В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, проводят количественную обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения. Метод обработки хроматограмм - внешний стандарт. При матричной градуировке пересчет полученного результата не требуется.

#### <a id="p100252"></a>11.2 Расчет содержания стероидных гормонов в образцах.

<a id="p100253"></a>Массовую долю стероидных гормонов в пробе рыбы (X1, мкг/кг) вычисляют по линейному уравнению вида y = ax + b при помощи встроенной программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи других программ расчета градуировочных характеристик.


### <a id="p100254"></a>XII. Проверка приемлемости результатов


<a id="p100255"></a>12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

<a id="p100256"></a> $\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(\text{Х}_{1} + X_{2})} \leq r,$ 

<a id="p100257"></a>где X<sub>1</sub>, X<sub>2</sub> - результаты параллельных определений, мкг/кг;
<a id="p100258"></a>r - значение предела повторяемости [(табл. 1)](#p100033), при этом $r = 2,8 \cdot \sigma r$ .
<a id="p100259"></a>При превышении расчетного значения предела повторяемости (r), измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.


### <a id="p100260"></a>XIII. Оформление результатов



#### <a id="p100261"></a>13.1 Результат анализа содержания стероидных гормонов представляют в виде:


<a id="p100262"></a> $(\overline{X} \pm \Delta),\text{мкг}/\text{кг}$ при вероятности P = 0,95,

<a id="p100263"></a>где $\overline{\text{Х}}$ - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мкг/кг;
<a id="p100264"></a> $\Delta$ - граница абсолютной погрешности, мкг/кг,

<a id="p100265"></a> $\Delta = \frac{\delta\text{Х}}{100} ,$ 

<a id="p100266"></a>где $\delta$ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций [(табл. 1)](#p100033), %.
<a id="p100267"></a>В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание вещества в пробе - менее 0,2 мкг/кг".


### <a id="p100268"></a>XIV. Контроль качества результатов измерений


<a id="p100269"></a>14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по [ГОСТ Р ИСО 5725 (1 - 6)](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.






## <a id="p100270"></a>БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ


1. <a id="p100271"></a>Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
2. <a id="p100272"></a>Федеральный закон от 02.06.2013 N 148-ФЗ "Об аквакультуре (рыбоводстве) и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации".
3. <a id="p100273"></a>Технический регламент таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011).
4. <a id="p100274"></a>СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".
5. <a id="p100275"></a>ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".
6. <a id="p100276"></a>ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".
7. <a id="p100277"></a>ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".
8. <a id="p100278"></a>ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".
9. <a id="p100279"></a>ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".
10. <a id="p100280"></a>[ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".
11. <a id="p100281"></a>ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".
12. <a id="p100282"></a>[ГОСТ 28311](https://bukva.ai/docs/standart-gost-28311-2021) "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".
13. <a id="p100283"></a>[ГОСТ 31339](https://bukva.ai/docs/standart-501-st) "Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб".
14. <a id="p100284"></a>ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".
15. <a id="p100285"></a>[ГОСТ 4523](https://bukva.ai/docs/gost-4523-77) "Реактивы. Магний серно-кислый 7-водный. Технические условия".
16. <a id="p100286"></a>[ГОСТ 5456](https://bukva.ai/docs/gost-5456-79) "Реактивы. Гидроксиламина гидрохлорид. Технические условия".
17. <a id="p100287"></a>[ГОСТ 7636](https://bukva.ai/docs/gost-7636-85) "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа".
18. <a id="p100288"></a>ГОСТ 9147 "Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия".
19. <a id="p100289"></a>[ГОСТ Р 52501](https://bukva.ai/docs/gost-r-52501-2005) (ИСО 3696:1987) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".
20. <a id="p100290"></a>ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".
21. <a id="p100291"></a>[ГОСТ Р ИСО 5725 (1 - 6)](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".



<a id="p100292"></a>

---