МУК 4.1.3759-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств биксафена и его метаболита десметил-биксафена в семенах рапса, молочном жире, жире, мясе и субпродуктах млекопитающих, жире и мясе птицы, субпродуктах птицеводства, молоке, яйцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.05.2022)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 24 мая 2022 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БИКСАФЕНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА ДЕСМЕТИЛ-БИКСАФЕНА В СЕМЕНАХ РАПСА, МОЛОЧНОМ ЖИРЕ, ЖИРЕ, МЯСЕ И СУБПРОДУКТАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ЖИРЕ И МЯСЕ ПТИЦЫ, СУБПРОДУКТАХ ПТИЦЕВОДСТВА, МОЛОКЕ, ЯЙЦАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3759-22
1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, М.С. Гречина, А.В. Суслова).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 мая 2022 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тройным квадрупольным масс-детектором (далее — ВЭЖХ-МС/МС) для определения в семенах рапса, молочном жире, жире, мясе и субпродуктах млекопитающих, жире и мясе птицы, субпродуктах птицеводства, молоке, яйцах массовой концентрации биксафена и его метаболита десметил-биксафена в диапазонах 0,01 — 0,10 мг/кг.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности и качества пищевой продукции и продовольственного сырья.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические и токсикологические свойства
2.1. Биксафен. N-(3',4'-Дихлор-5-фторбифенил-2-ил)-3-дифторметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид <1>. Брутто-формула: C18H12C12F3N3O. Молекулярная масса 414,21. Бесцветное кристаллическое вещество без запаха. В водной среде стабилен при pH = 4 — 9. Температура плавления плюс 146,6 °C. Давление паров 4,6·10-5 мПа (при плюс 20 °C). Растворимость в органических растворителях в г/дм3 (плюс 20 — 25 °C): ацетон > 250; этилацетат — 82; метанол — 32; дихлорметан — 102; гептан — 0,056; толуол — 16. Растворимость в воде (плюс 20 — 25 °C): 0,49 мг/дм3.
<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).
2.2. Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность (LD50) для крыс > 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для крыс > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс > 5,38 мг/дм3.
2.3. Область применения: биксафен — системный фунгицид, обладающий защитным, лечебным и искореняющим действиями. Используется в сельском хозяйстве против возбудителей болезней пшеницы. Эффективен против различных болезней зерновых колосовых культур, которые вызываются грибами классов Basidiomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes. Подавляет прорастание мицелия и спор.
2.4. Десметил-биксафен. N-(3',4'-Дихлор-5-фторбифенил-2-ил)-3-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид. Брутто-формула: C17H10C12F3N3O. Молекулярная масса 400,19.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (границы относительной погрешности, P = 0,95), \pm \delta , % | Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), \sigma_{r} , % | Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), \sigma_{R} , % | Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, % | Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, % (P = 0,95) |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Биксафен | ||||||
| Семена рапса | 0,01 — 5,00 | 50 | 12,8 | 18,0 | 36 | 50 |
| Молочный жир | 0,01 — 5,00 | 52 | 9,0 | 12,6 | 25 | 35 |
| Жир млекопитающих и птицы | 0,01 — 5,00 | 50 | 6,4 | 8,9 | 18 | 25 |
| Мясо млекопитающих и птицы | 0,01 — 5,00 | 51 | 9,0 | 12,6 | 25 | 35 |
| Субпродукты млекопитающих и птицы | 0,01 — 5,00 | 56 | 10,4 | 14,6 | 29 | 41 |
| Молоко | 0,01 — 5,00 | 50 | 10,4 | 14,5 | 29 | 41 |
| Яйца | 0,01 — 5,00 | 50 | 9,8 | 13,8 | 28 | 39 |
| Десметил-биксафен | ||||||
| Семена рапса | 0,01 — 5,00 | 50 | 11,3 | 15,8 | 32 | 44 |
| Молочный жир | 0,01 — 5,00 | 50 | 8,6 | 12,1 | 24 | 34 |
| Жир млекопитающих и птицы | 0,01 — 5,00 | 51 | 10,2 | 14,3 | 29 | 40 |
| Мясо млекопитающих и птицы | 0,01 — 5,00 | 51 | 7,1 | 9,9 | 20 | 28 |
| Субпродукты млекопитающих и птицы | 0,01 — 5,00 | 50 | 9,6 | 13,4 | 27 | 38 |
| Молоко | 0,01 — 5,00 | 51 | 11,7 | 16,4 | 33 | 46 |
| Яйца | 0,01 — 5,00 | 55 | 8,3 | 11,6 | 23 | 33 |
| Примечание. Диапазон определяемых концентраций, указанный в таблице 3.1, приведен с учетом разбавления экстракта образца в 50 раз. | ||||||
3.2. Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в таблице 3.2.
Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Полнота извлечения вещества, % | Стандартное отклонение, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Биксафен | |||||
| Семена рапса | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 91,5 | 11,8 | 6,1 |
| Молочный жир | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 82,2 | 7,4 | 3,8 |
| Жир млекопитающих и птицы | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 82,0 | 6,3 | 3,3 |
| Мясо млекопитающих и птицы | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 83,0 | 8,0 | 4,2 |
| Субпродукты млекопитающих и птицы | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 81,4 | 8,7 | 4,6 |
| Молоко | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 85,2 | 9,8 | 5,1 |
| Яйца | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 89,3 | 9,1 | 4,8 |
| Десметил-биксафен | |||||
| Семена рапса | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 92,0 | 12,4 | 6,5 |
| Молочный жир | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 86,8 | 9,0 | 4,7 |
| Жир млекопитающих и птицы | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 85,3 | 10,1 | 5,3 |
| Мясо млекопитающих и птицы | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 82,2 | 7,0 | 3,6 |
| Субпродукты млекопитающих и птицы | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 93,7 | 14,7 | 7,7 |
| Молоко | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 87,3 | 12,2 | 6,4 |
| Яйца | 0,01 | 0,01 — 5,00 | 80,8 | 7,1 | 3,7 |
| Примечание. Диапазон определяемых концентраций, указанный в таблице 3.2, приведен с учетом разбавления экстракта образца в 50 раз. | |||||
IV. Метод измерений
4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.
4.2. Экстракцию вещества из анализируемых проб растительной продукции и продукции животного происхождения выполняют ацетонитрилом, с использованием смеси солей для экстракции (смесь сульфата магния, хлорида натрия, цитрата натрия и натрия лимоннокислого двузамещенного, 1,5-водного), очистку экстрактов проводят методом дисперсионной твердофазной экстракции с применением смеси сорбентов на основе первичного-вторичного амина и октадецилсилана.
4.3. Нижний предел измерения биксафена и его метаболита десметил-биксафена в анализируемом объеме пробы — 2,5 пг.
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь, снабженный автоматическим пробоотборником и термостатом колонки | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Прибор для измерения атмосферного давления, температуры и относительной влажности воздуха | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы лабораторные аналитические, предел допустимой погрешности +/- 0,0005 г | ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные, предел допустимой погрешности +/- 0,01 г | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-го класса точности, вместимостью 50, 100 и 1000 см3 | ГОСТ 1770 |
| Меры массы | ГОСТ OIML R 111-1 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Пробирки градуированные с притертой пробкой 2-го класса точности объемом 10,0 см3 | ГОСТ 1770 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 10, 100 и 500 см3 | ГОСТ 1770 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Аналитический стандартный образец биксафена | CAS № 581809-46-3, с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Аналитический стандартный образец десметил-биксафена | CAS № 1655498-06-8, с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Азот особой чистоты, сорт 1, в баллонах | ГОСТ 9293 (ИСО 2435) |
| Аммоний муравьинокислый (формиат аммония) для ВЭЖХ | Чистота не менее 99,0% |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Чистота не менее 99,9% |
| Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная) | ГОСТ Р 52501 |
| Калий углекислый (карбонат калия, поташ) | Химически чистый, прокаленный по ГОСТ 4221 |
| Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора) | Химически чистый |
| Магний сернокислый (сульфат магния) | Безводный химически чистый |
| Натрий хлористый (хлорид натрия) | Химически чистый по ГОСТ 4233 |
| Натрий лимоннокислый двузамещенный, 1,5-водный | Химически чистый |
| Натрий лимоннокислый трехзамещенный | Чистый для анализа по ГОСТ 22280 |
| Сорбент для твердофазной экстракции на основе первичного-вторичного амина | Площадь поверхности ~ 570 м2/г, средний размер пор 67 А, средний размер частиц 60 мкм |
| Сорбент для твердофазной экстракции на основе силикагеля с привитыми октадецильными группами (C18) | Площадь поверхности ~ 547 м2/г, средний размер пор 64 А, средний размер частиц 58 мкм |
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
Вспомогательное оборудование, устройства, материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Груша резиновая | - |
| Керамические гомогенизаторы для пробирок на 50 см3 | - |
| Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками, вместимостью 50 и 15 см3 | - |
| Мельница лабораторная | - |
| Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении | - |
| Морозильная камера или морозильный ларь, поддерживающий температуру не выше минус 18 °C | - |
| Стаканы химические с носиком, вместимостью 100 и 400 см3 | ГОСТ 25336 |
| Фильтры мембранные для фильтрации проб с помощью шприца, размер пор 0,22 мкм | - |
| Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм | - |
| Центрифуга лабораторная, роторная, скорость вращения до 4000 об/мин | - |
| Шприцы медицинские одноразовые вместимостью 5 см3 | ГОСТ ISO 7886-1 |
Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостные хроматографы.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.
<2> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 № 536 «Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности „Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением“ (зарегистрировано Минюстом России 31.12.2020, регистрационный № 61998).»
6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1. Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ, смеси растворителей для разбавления градуировочных растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, смеси солей для экстракции и смеси сорбентов для очистки экстрактов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, отбор проб.
8.2 Очистка органических растворителей.
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.
8.3. Приготовление 0,01 М раствора формиата аммония в воде (компонент А подвижной фазы для ВЭЖХ).
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 0,631 г формиата аммония, растворяют в деионизированной воде, доводят деионизированной водой до метки и тщательно перемешивают. Приготовленный раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.
8.4. Приготовление смеси растворителей для разбавления градуировочных растворов.
Смешивают ацетонитрил и воду в соотношении 9:1 по объему. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.
8.5 Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.
8.5.1. Исходный раствор биксафена для градуировки (концентрация 100 мкг/см3).
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,0100 +/- 0,0005) г биксафена, добавляют 50 — 70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс 2 — 6 °C не более 3 месяцев.
8.5.2. Исходный раствор десметил-биксафена для градуировки (концентрация 100 мкг/см3).
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,0100 +/- 0,0005) г десметил-биксафена, добавляют 50 — 70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре плюс 2 — 6 °C не более 3 месяцев.
Растворы № 1 — 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.
8.5.3. Раствор № 1 биксафена и десметил-биксафена для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см3).
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают по 10 см3 исходного раствора биксафена (п. 8.5.1) и десметил-биксафена (п. 8.5.2) с концентрациями 100 мкг/см3, доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор № 1 с концентрацией биксафена и десметил-биксафена 10 мкг/см3. Раствор № 1 хранят в холодильнике при температуре плюс 2 — 6 °C не более одного месяца.
8.5.4. Раствор № 2 биксафена и десметил-биксафена для градуировки и внесения (концентрация 0,1 мкг/см3).
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 1,0 см3 градуировочного раствора № 1 с концентрацией биксафена и десметил-биксафена 10 мкг/см3 (п. 8.5.3), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор № 2 с концентрацией биксафена и десметил-биксафена 0,1 мкг/см3. Раствор № 2 хранят в холодильнике при температуре плюс 2 — 6 °C не более одного месяца.
8.5.5. Рабочие растворы № 3 — 6 биксафена и десметил-биксафена для градуировки (концентрация 0,5 — 10 нг/см3).
В 3 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают 10, 5 и 1 см3 градуировочного раствора № 2 с концентрацией биксафена и десметил-биксафена 0,1 мкг/см3 (п. 8.5.4), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 3 — 5 с концентрациями биксафена и десметил-биксафена 10, 5 и 1 нг/см3 соответственно.
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 градуировочного раствора № 4 с концентрацией биксафена и десметил-биксафена 5 нг/см3 (п. 8.5.5), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают; получают рабочий раствор № 6 с концентрацией биксафена и десметил-биксафена 0,5 нг/см3. Растворы хранят в холодильнике при температуре плюс 2 — 6 °C не более двух недель.
8.6. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой при соотношении компонентов А и Б (компонент А — 0,01 М раствор формиата аммония в воде, приготовленный по п. 8.3, компонент Б — ацетонитрил) 1:1 и скорости подачи растворителя 0,3 см3/мин до установления стабильной базовой линии.
8.7 Приготовление смеси солей для экстракции.
Для приготовления одного набора смеси солей для экстракции смешивают (4,00 +/- 0,01) г магния сернокислого, (1,00 +/- 0,01) г натрия хлористого, (1,00 +/- 0,01) г натрия лимоннокислого трехзамещенного и (0,50 +/- 0,01) г натрия лимоннокислого двузамещенного, 1,5-водного, до использования хранят в герметичной упаковке (не более 6 месяцев).
Примечание: возможно использование коммерческих наборов солей для экстракции проб фруктов и овощей массой 10 г.
8.8 Приготовление смеси сорбентов для очистки экстрактов.
Для приготовления одного набора смеси сорбентов для очистки экстрактов в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 помещают (150 +/- 4) мг сорбента для твердофазной экстракции на основе смеси первичных и вторичных аминов, (900 +/- 4) мг магния сернокислого и (150 +/- 4) мг твердофазного сорбента на основе октадецилсилана, закрывают герметично крышкой, встряхивают для перемешивания, хранят не более 6 месяцев.
Примечание. Возможно использование дисперсионных наборов для фруктов и овощей с маслом и воском, помещенных в полипропиленовые пробирки вместимостью 15 см3.
8.9 Установление градуировочных характеристик.
Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика от концентрации биксафена и десметил-биксафена в растворе (нг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.
В инжектор хроматографа вводят по 5 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
8.10 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание биксафена и десметил-биксафена в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,5 до 10 нг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение:
A = \frac{|X - C|}{C} \times 100;
где: A — величина расхождения, %;
X — концентрация вещества в пробе при контрольном измерении, нг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см3;
B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).
IX. Отбор и хранение проб
9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с методическими документами <3>.
<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 № 2051-79; Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности, Москва — 2018 64 с.; ГОСТ 31654 «Яйца куриные пищевые. Технические условия»; ГОСТ 31450 «Молоко питьевое. Технические условия»; ГОСТ 32262 «Группа Н17. Межгосударственный стандарт. Масло топленое и жир молочный. Технические условия»; ГОСТ 10583 «Семена рапса. Промышленное сырье»; ГОСТ Р 54676 «Жиры птицы пищевые. Технические условия»; ГОСТ 25292 «Жиры животные топленые пищевые. Технические условия»; ГОСТ 31962 «Мясо кур (тушки кур, цыплят; цыплят-бройлеров и их части). Технические условия»; ГОСТ 34159 «Продукты из мяса. Общие технические условия»; ГОСТ 32244 «Субпродукты мясные обработанные. Технические условия».
9.2. Растительные пробы хранят при температуре плюс 2 — 6 °C не более недели. Животные образцы хранят при температуре плюс 2 — 6 °C не более суток. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.
9.3 Перед анализом образцы измельчают.
X. Выполнение определения
10.1 Экстракция.
Измельченный образец массой 5 г (образец молока массой 5 г) помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3. При экстракции семян рапса, к измельченному образцу предварительно вносят 5 см3 деионизованной воды для увлажнения пробы. Добавляют 10 см3 ацетонитрила, перемешивают. В пробирку помещают керамический гомогенизатор, закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную 2 мин, вносят в пробирку смесь солей для экстракции (приготовленную по п. 8.7), закрывают крышкой и интенсивно встряхивают (вручную) в течение 1 мин. Затем пробу центрифугируют 10 мин при скорости вращения 4000 оборотов/мин.
Пробирку с экстрактом помещают в морозильную камеру на 2,5 — 3 часа при температуре не выше минус 18 °C. Полученный холодный образец центрифугируют 5 мин при скорости вращения 4000 оборотов/мин и подвергают очистке с применением дисперсионной твердофазной экстракции по п. 10.2.
10.2 Очистка экстракта.
Часть экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 6 — 7 см3 с помощью пипетки переносят в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, содержащую смесь сорбентов, приготовленную по п. 8.8. Закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную в течение 30 сек. Центрифугируют 5 мин при скорости вращения 4000 оборотов/мин. Отбирают в градуированную пробирку на 10 см3 раствор экстракта объемом 1 см3, доводят до метки бидистиллированной водой. Общий объем пробы 10 см3. Перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм) в виалу вместимостью 2 см3 с фторопластовой прокладкой и навинчивающейся крышкой. Помещают в автосамплер хроматографа для анализа в условиях хроматографирования по п. 10.3.
10.3 Условия проведения анализа.
Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов при следующих режимных параметрах:
- источник ионизации: электростатическое распыление;
- режим работы: регистрация дочерних положительных ионов (биксафен) и отрицательных ионов (десметил-биксафен) после разрушения материнских ионов (регистрация «перехода»).
Параметры масс-спектрометрического детектора.
- материнский ион масса (заряд): 414,04;
- дочерние ионы масса (заряд): 394 (количественный расчет), 266 (подтверждающий ион);
- напряжение на фрагментаторе, В: 109;
- энергия разрушения (соударения), В: 9 (414,04 -> 394), 25 (414,04 -> 266).
- материнский ион (масса/заряд): 398,01;
- дочерние ионы (масса/заряд): 358 (количественный расчет), 378 (подтверждающий ион);
- напряжение на фрагментаторе, В: 91;
- энергия разрушения (соударения), В: 13 (398,01 -> 358), 9 (398,01 -> 378);
- скорость сканирования: 200 мс;
- давление на распылителе: 35 psi;
- скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм3/мин;
- температура газа 1: плюс 350 °C;
- скорость газа 2 (азот): 12 дм3/мин;
- температура газа 2: плюс 400 °C;
- температура квадруполей (1 и 3): плюс 100 °C.
- хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм;
- температура колонки: плюс 40 °C;
- скорость потока элюента: 0,3 см3/мин;
- объем вводимой пробы: 5 мм3;
- подвижная фаза: 0,01 М раствор формиата аммония в воде — ацетонитрил (45:55, по объему).
Линейный диапазон детектирования 2,5 — 50 пг.
Ориентировочное время выхода биксафена — 6,438 мин, десметил-биксафена — 4,403 мин.
Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 10 нг/см3, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз), что позволяет расширить диапазон измеряемых концентраций до 5 мг/кг.
XI. Обработка результатов анализа
11.1. Содержание биксафена и десметил-биксафена в пробах семян рапса, молочном жире, жире, мясе и субпродуктах млекопитающих, жире и мясе птицы, субпродуктах птицеводства, молоке, яйцах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
X = \frac{A \cdot V_{\text{кон}} \cdot \text{С } \cdot \text{Кр} \cdot 100}{1000 \cdot m \cdot f} ,
где A — концентрация биксафена и десметил-биксафена соответственно, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, нг/см3;
Vкон — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3, равен 10 см3;
m — масса анализируемого образца, г;
C — коэффициент, учитывающий разбавление экстракта, взятого для анализа, C = 10;
Кр — кратность разбавления (если экстракт подвергался разбавлению);
f — полнота извлечения вещества, приведенная в таблице 3.2 (в %).
Для выражения содержания десметил-биксафена в эквиваленте действующего вещества биксафена, уровень метаболита умножают на коэффициент K, равный соотношению молекулярных масс действующего вещества и его метаболита (414,21/400,19 = 1,04).
XII. Оформление результатов
12.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание биксафена и десметил-биксафена в пробах семян рапса, молочном жире, жире, мясе и субпродуктах млекопитающих, жире и мясе птицы, субпродуктах птицеводства, молоке, яйцах — менее 0,01 мг/кг».
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Организация контроля качества измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.
13.2. Плановый виутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:
C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime},
где \pm \Delta_{\text{л},\text{Х}}( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \delta \cdot \text{Х }/100,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = \overline{\text{Х}}\prime - \overline{\text{Х}} - \text{С}_{\text{д}},
где \overline{\text{Х}}\prime , \overline{\text{Х}} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости R:
\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{(\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2})} \leq R,
где X1, X2 - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 № 536 «Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности „Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением“.»
3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 № 2051-79.
4. ГОСТ Р ИСО 5725 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
5. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
6. ГОСТ OIML R 111-1 «Государственная система обеспечения единства измерении (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования».
7. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
8. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
9. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
10. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) «Азот газообразный и жидкий. Технические условия».
11. ГОСТ 4221 «Калий углекислый. Технические условия».
12. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
13. ГОСТ 22280 «Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия».
14. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
15. ГОСТ ISO 7886-1 «Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования».
16. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
17. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
18. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
19. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
20. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
21. ГОСТ 31654 «Яйца куриные пищевые. Технические условия».
22. ГОСТ 31450 «Молоко питьевое. Технические условия».
23. ГОСТ 32262 «Масло топленое и жир молочный. Технические условия».
24. ГОСТ 10583 «Рапс для промышленной переработки. Технические условия».
25. ГОСТ Р 54676 «Жиры птицы пищевые. Технические условия».
26. ГОСТ 25292 «Жиры животные топленые пищевые. Технические условия».
27. ГОСТ 31962 «Мясо кур (тушки кур, цыплят-бройлеров и их части). Технические условия».
28. ГОСТ 34159 «Продукты из мяса. Общие технические условия».
29. ГОСТ 32244 «Субпродукты мясные обработанные. Технические условия».
30. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности, Москва — 2018. 64 с.