МУК 4.1.3667-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение стеринов в молоке и молочной продукции методом газовой хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.10.2020)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 октября 2020 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВ В МОЛОКЕ И МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3667-20
1. Разработаны ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (В.Ю. Ананьев, О.В. Андросова, А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, А.А. Константинов, И.П. Семенова, И.С. Шумилина, М.М. Дударев).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 октября 2020 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) распространяются на молоко и молочную продукцию и устанавливают метод определения стеринов (холестерин, брассикастерин, стигмастерин, кампестерин и бета-ситостерин) методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Метод измерений
2.1. Метод основан на предварительном гидролизе стероидов, содержащихся в жировой фазе молока и молочной продукции в стерины, определении методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационным детектора и идентификации по времени удерживания.
III. Метрологические характеристики
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций (в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6).
Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного контроля точности, повторяемости, воспроизводимости
Полнота извлечения, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.
Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20)
IV. Средства измерений, посуда, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
4.1 Средства измерений
| Хроматограф газовый, включающий следующие элементы: а) инжектор; б) термостат с программированием температуры, обеспечивающий нагрев колонки до температуры 315 °C; в) детектор пламенно-ионизационный; г) программное обеспечение для сбора и обработки данных |
|
|---|---|
| Весы лабораторные аналитические | ГОСТ OIML R 76-1 |
| Микрошприц вместимостью 10 мм3 с погрешностью дозирования не более 5% | |
| Колбы мерные с притертыми пробками 2-5-2, 2-100-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Цилиндры 2-25, 2-50 | ГОСТ 1770 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
4.2 Реактивы
| Натрия сульфат, безводный | ГОСТ 4166 |
|---|---|
| Натрия гидроокись, хч | ГОСТ 4328 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
| Калия гидроокись, чда | ГОСТ 24363 |
| Метанол-яд | ГОСТ 6995 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ 5962 |
| Дихлорметан (Хлористый метилен) | ГОСТ 9968-86 |
| Гелий газообразный марки А (объемная доля гелия не менее 99,995%) | |
| Холестерин с массовой долей основного вещества не менее 95,0% | |
| Брассикастерин с массовой долей основного вещества не менее 95,0% | |
| Кампестерин с массовой долей основного вещества не менее 95,0% | |
| Стигмастерин с массовой долей основного вещества не менее 95,5% | |
| \beta - \text{ситостерин} с массовой долей основного вещества не менее 70,5% |
Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.
4.3 Вспомогательные устройства, материалы
| Колонка капиллярная с неполярной неподвижной фазой и верхней температурной границей рабочего диапазона не менее 320 °C. Длина и диаметр газохроматографической колонки, толщина слоя неподвижной фазы должны обеспечивать приемлемое хроматографическое разрешение и число теоретических тарелок для полного разделения стеринов | |
|---|---|
| Генератор водорода | |
| Компрессор | |
| Баня водяная с регулируемым обогревом с погрешностью поддержания температуры | |
| Испаритель роторный | ГОСТ 28165 |
| Воронки делительные ВД-3-250ХС с фторопластовым краном | ГОСТ 25336 |
| Колба коническая Кн-1-100-29/32 ТС, Кн-1-250-29/32 ТС | ГОСТ 25336 |
| Колбы круглодонные К-1-50-29/32, К-1-100-29/32, К-1-250-29/32 | ГОСТ 25336 |
| Стаканы В-1-50, В-1-100, В-1-1000 | ГОСТ 25336 |
| Воронки В-56-80, В-75-110 | ГОСТ 25336 |
| Емкости стеклянные (виалы) для жидких проб вместимостью 2 см3, снабженные крышками с силиконовой и тефлоновой мембраной | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Бумага индикаторная универсальная для определения pH | |
| Устройство вакуумное для твердофазной экстракции | |
| Картридж для твердофазной экстракции (далее — ТФЭ) объемом не менее 6 см3 | ГОСТ 31694 |
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
IV. Требования безопасности
5.1 Условия безопасного проведения работ.
При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности — по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018.
Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
5.2 Требования к квалификации операторов.
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт эксплуатации данного оборудования, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VI. Условия измерений
6.1 При выполнении анализа в лаборатории следует соблюдать следующие условия:
- температура окружающего воздуха от 15 °C до 30 °C;
- относительная влажность воздуха от 20% до 80%;
- атмосферное давление от 84 кПа до 106 кПа.
VII. Подготовка к выполнению измерений
7.1 Подготовка газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором
7.1.1. Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором готовят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и устанавливают режим для анализа.
Хроматографические условия проведения анализа:
- инжектируемый объем анализируемой пробы — 1 мм3;
- температура испарителя — 300 °C;
- время задержки включения детектора — 5 мин;
- тип колонки — НР-5;
- газ-носитель — азот;
- скорость потока гелия через колонку — 1,5 см3/мин;
- режим работы — без деления потока;
- соотношение водород:воздух — 1:10;
- энергия ионизации — 70 эВ;
- температура детектора — 320 °C;
- температурная программа:
- начальная температура колонки — 150 °C, время анализа при данной температуре — 1 мин;
- скорость нагрева колонки 10 °C/мин до 300 °C, время анализа при данной температуре 20 минут;
- скорость нагрева колонки 10 °C/мин до 315 °C, время анализа при этой температуре 10 минут.
Допускается использование других хроматографических условий, обеспечивающих разделение компонентов в пробе, необходимую чувствительность и воспроизводимость.
7.2 Приготовление стандартных растворов стеринов.
7.2.1. Приготовление растворов стеринов массовой концентрации 1,0 мг/см3.
Взвешивают 10,0 мг индивидуального стерина (холестерина, брассикастерина, кампестерина, стигмастерина, \beta - \text{ситостерина} ) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см3 и растворяют в гексане. Растворы хранят в холодильнике при температуре минус 18 °C в течение 6 месяцев.
7.2.2 Приготовление смеси градуировочных растворов стеринов.
Для определения стеринов из индивидуальных растворов массовой концентрации 1,0 мг/см3 готовят смесь градуировочных растворов массовой концентрации 100 мкг/см3 (раствор 1), 50 мкг/см3 (раствор 2), 25 мкг/см3 (раствор 3), 5 мкг/см3 (раствор 4), 1 мкг/см3 (раствор 5).
Для приготовления раствора 1 градуированной пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 см3 переносят соответственно по 5 см3 индивидуального раствора стерина, доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.
Для приготовления градуировочного раствора 2 в хроматографическую виалу переносят 0,5 см3 градуировочного раствора 1 и 0,5 см3 гексана.
Для приготовления градуировочного раствора 3 в хроматографическую виалу переносят 0,5 см3 градуировочного раствора 2 и 0,5 см3 гексана.
Для приготовления градуировочного раствора 4 в хроматографическую виалу переносят 0,2 см3 градуировочного раствора 3 и 0,8 см3 гексана.
Для приготовления градуировочного раствора 5 в хроматографическую виалу переносят 0,2 см3 градуировочного раствора 4 и 0,8 см3 гексана.
Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
Допускается изменять массу навесок стеринов при приготовлении растворов стеринов массовой концентрации 1,0 мг/см3.
7.3 Раствор гидроксида калия в этаноле молярной концентрации 2 М.
В мерной колбе вместимостью 1000 см3 взвешивают (112,1 +/- 0,1) г предварительно измельченного гидроксида калия и доводят объем раствора до метки этанолом, интенсивно перемешивают до полного растворения гидроксида калия и остужают до комнатной температуры.
Срок хранения раствора в плотно закрытой склянке при температуре плюс 4 °C — не более 6 месяцев.
7.4 Построение градуировочной кривой
При построении градуировочной зависимости для количественного определения стеринов анализируют рабочие стандартные градуировочные растворы п. 7.2.2 различных уровней концентраций в указанных условиях п. 7.1. Затем строят графики зависимости массы стеринов во вводимой пробе от площади хроматографического пика для каждого спектра, используемого для количественного определения. Построение графиков может проводиться при помощи программы для работы с электронными таблицами.
Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой каждого пика составляет не менее 0,98.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации стеринов в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 градуировочным растворам стеринов. Для построения градуировочной характеристики осуществляют не менее трех параллельных измерений градуировочных растворов.
VIII. Отбор проб
8.1. Отбор проб к анализу производится в соответствии с ГОСТ 13928, ГОСТ 26809.1, ГОСТ 26809.2.
Перед началом проведения анализа отобранные пробы молока и молочных продуктов, за исключением молочных консервов и молочных продуктов в запаянных или закатанных банках, хранятся при температуре 4 °C, пробы мороженого — при температуре не превышающей 2 °C.
IX. Выполнение измерений
9.1. В коническую колбу вместимостью 250 см3, вносят 5 г анализируемой пробы продукта <1> (в зависимости от содержания жира масса навески может варьироваться), добавляют 20 см3 2 М раствора гидроокиси калия, тщательно перемешивают и проводят гидролиз: кипячением на водяной бане с обратным холодильником не менее 60 мин, периодически тщательно перемешивая. Содержимое колбы охлаждают до температуры 40 °C и добавляют 10 см3 дистиллированной воды, затем помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3. Добавляют 15 см3 гексана и экстрагируют неомыляемые вещества, осторожно встряхивая на протяжении одной минуты. Чтобы добиться лучшего разделения слоев, добавляют 2 — 4 см3 этилового спирта. После расслоения фаз верхний гексановый слой сливают в коническую колбу, а нижний слой повторно экстрагируют новыми порциями гексана по 15 см3 каждая дважды. Экстракцию проводят вдали от прямого солнечного света, чтобы предохранить пробу от попадания на нее ультрафиолетовых лучей. Объединенный гексановый слой промывают в делительной воронке несколькими порциями по 20 см3 дистиллированной воды до нейтральной реакции промывных вод по универсальной индикаторной бумаге. Отмытую гексановую фракцию пропускают через бумажный фильтр, переносят в колбу для упаривания, упаривают раствор на роторном испарителе <2> при температуре не выше 30 °C, далее перерастворяют в 8 см3 гексана.
<1> В случае густой или твердой пробы — следует растворить в подогретой дистиллированной воде. В случае необходимости предварительного выделения жира возможно применение метода Фолча, согласно которому экстракцию жирной фазы проводят смесью хлороформ-метанол (2:1).
<2> Допускается упаривание в токе азота.
9.2. Для дополнительной очистки проводят твердофазную экстракцию: картридж для ТФЭ заполняют 0,5 г сорбента оксидом алюминия <3>. Картридж промывают 5 см3 смеси хлористый метилен-метанол, в соотношении 9:1, затем промывают 5 см3 гексана, после нанесения исследуемого раствора элюируют 10 см3 смесью хлористый метилен-метанол, в соотношении 9:1, при этом собирают элюат. Полученный элюат анализируют с помощью газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором.
<3> Допускается использование других сорбентов, например, силикагеля.
X. Проведение анализа проб
10.1. Для оценки фона (чистоты аналитической системы) перед началом работы инжектируют в прибор 1 мм3 чистого растворителя (гексан) и записывают хроматограмму, на которой не должно присутствовать посторонних пиков.
10.2. В испаритель газового хроматографа вводят 1 мм3 анализируемой пробы продукта, подготовленной в соответствии с п. 9.1, далее выполняют хроматографическое разделение в условиях, приведенных в п. 7.1. Записывают хроматограммы и идентифицируют индивидуальные стерины по совпадению времен удерживания.
Пробу продукта анализируют не менее двух раз.
XI. Обработка результатов анализа
11.1. В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, создают таблицу пиков с использованием программного обеспечения. Расчеты площади пика и массовой доли стеринов выполняются системой обработки данных в автоматическом режиме.
11.2 Массовую долю стеринов X, мг/100 г, вычисляют по формуле:
X = \frac{C_{\text{ст}} \cdot S_{x} \cdot V_{\text{р}}}{S_{\text{ст}} \cdot m} \cdot 0,1 , где
Cст — массовая концентрация стеринов в градуировочном растворе, мкг/см3;
Sx — площадь пика стеринов в анализируемой пробе, усл. ед.;
Vр — объем раствора для растворения стеринов после пробоподготовки, см3;
Sст — площадь пика стеринов в градуировочном растворе, усл. ед.;
m — масса анализируемой пробы, г.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до второго знака.
11.3. Не учитывают пики стеринов с интенсивностью отклика сигнала менее 2% от высоты пика холестерина и с соотношением сигнал/шум менее 10.
Результат обнаружения растительных масел и жиров на растительной основе с интенсивностью свыше 2% от высоты пика холестерина представляют в документах в виде наличия каждого стерина в отдельности, на основании чего делают заключение о фальсификации жировой фазы пробы продукта растительными маслами или жирами на растительной основе.
XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)
X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/100 г;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XIII. Оформление результатов
13.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/100 г при вероятности P = 0,95, где
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/100 г;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/100 г;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
XIV. Контроль качества результатов
14.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.
Библиографические ссылки
1. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
2. ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».
3. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
4. ГОСТ 12.1.010 «Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования».
5. ГОСТ 12.1.018 «Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ OIML R 76-1 «Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
8. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
9. ГОСТ ИСО 5725-1 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».
10. ГОСТ Р ИСО 5725-6 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
11. ГОСТ 5962 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».
12. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».
13. ГОСТ 13928 «Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу».
14. ГОСТ 24363 «Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия».
15. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
16. ГОСТ 26809.1 «Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты».
17. ГОСТ 26809.2 «Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты».