МУК 4.1.3407-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клотианидина в яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2016)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2016 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КЛОТИАНИДИНА В ЯБЛОКАХ, ВИНОГРАДЕ, ЯБЛОЧНОМ И ВИНОГРАДНОМ СОКАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3407-16

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2016 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.230/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации клотианидина в яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Клотианидин

(Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин (IUPAC).

Молекулярная масса: 249,7.

Брутто формула: C₆H₈ClN₅O₂S.

Клотианидин представляет собой порошок без цвета и запаха. Температура плавления 176,8 °C. Давление пара — 1,3 x 10-4 мПа (25 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow lgP = 0,7 (25 °C), pKa = 11,09 (20 °C).

Растворимость в воде (20 °C) — 0,304 (pH 4), 0,34 (pH 10) г/дм3. Растворимость (г/дм3, 25 °C) в гептане < 0,00104, в ксилоле — 0,028, дихлорметане — 1,32, метаноле — 6,26, октаноле — 0,938, ацетоне — 15,2, этилацетате — 2,03.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс LD50 > 5 000 мг/кг, ингаляционная токсичность для крыс LC50 (4 ч) > 6,1 мг/л. Не мутаген, не онкоген для крыс и мышей, не тератоген для крыс и кроликов. При прямом контакте опасен для пчел, не опасен при использовании в качестве протравителя и в случае обработок не непосредственно на цветущие культуры.

Область применения. Инсектицид из группы неоникотиноидов для борьбы с сосущими и грызущими насекомыми на рисе, кукурузе, рапсе, овощных и фруктовых культурах. Используется для протравливания семян, обработки почвы и вегетирующей культуры.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения клотианидина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении клотианидина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов водным ацетоном, последующей очистки в системе несмешивающихся растворителей и на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация клотианидина проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-15.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, владеющий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, имеющий опыт работы, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (смесь № 3) (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают 2 см3 этилацетата, затем 3 см3 смеси № 1.

7.3 Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Насыщенный раствор хлористого натрия: в плоскодонную колбу вместимостью 2 дм3 помещают 400 г хлористого натрия, добавляют 1 дм3 теплой дистиллированной воды и перемешивают до окончания растворения соли. Полученный раствор сливают декантацией в чистую колбу, не растворившийся остаток соли отбрасывают.

7.4 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор клотианидина с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску клотианидина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы с концентрациями клотианидина 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя исходный раствор и смесь № 3, а также ацетонитрил).

Исходный раствор с концентрацией 2,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,4 см3 основного раствора и доводят до метки смесью № 3.

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 исходного раствора и доводят объем до метки смесью № 3.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2,5 см3 исходного раствора и доводят объем до метки смесью № 3.

7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 исходного раствора и доводят объем до метки смесью № 3.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 исходного раствора и доводят объем до метки смесью № 3.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 1 мкг/см3 (для проверки поведения клотианидина на патроне для ТФЭ): в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора с концентрацией 0,5 мг/см3 и доводят до метки ацетонитрилом.

Основной и исходный раствор клотианидина можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы — в течение недели.

При изучении полноты определения клотианидина используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5 Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация клотианидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клотианидина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = KS, где

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{\text{к}}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации клотианидина в градуировочном растворе;

Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации клотианидина в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

7.6 Проверка хроматографического поведения клотианидина

на патроне для твердофазной экстракции

В круглодонную колбу емкостью 25 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора клотианидина в ацетонитриле с концентрацией 1 мкг/см3, приготовленного по п. 7.4.2.5. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 смеси № 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 смеси № 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют 10 см3 этилацетата со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.2.

Фракции, содержащие клотианидин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 32786-14 «Виноград столовый свежий. Технические условия» и с ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки». Пробы ягод винограда и яблок хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного и яблочного сока хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9. Проведение определения

9.1 Подготовка проб

9.1.1. Экстракция клотианидина из яблок и винограда. Навеску 10 г измельченной матрицы помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см3 и дважды порциями по 30 см3 экстрагируют смесью № 2 в ультразвуковой бане по 10 мин. Экстракт пропускают через химическую воронку, заполненную безводным сульфатом натрия (3 г), и упаривают до водного остатка на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °C. Водный остаток доводят до 50 см3 насыщенным раствором хлористого натрия, переносят в делительную воронку и дважды порциями по 15 см3 экстрагируют хлористым метиленом. Объединенные органические фракции пропускают через химическую воронку, заполненную безводным сульфатом натрия (3 г) и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции на основе силикагеля (п. 9.1.3).

9.1.2. Экстракция клотианидина из яблочного и виноградного соков. Навеску 10 г сока доводят до 50 см3 насыщенным раствором хлористого натрия, переносят в делительную воронку и дважды порциями по 15 см3 экстрагируют хлористым метиленом. Объединенные органические фракции пропускают через химическую воронку, заполненную безводным сульфатом натрия (3 г), и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции на основе силикагеля (п. 9.1.3).

9.1.3. Очистка на патроне для твердофазной экстракции. Сухой остаток, полученный по п. 9.1.1 и п. 9.1.2, растворяют в 1 см3 смеси № 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см3 смеси № 1 и так же наносят на патрон. Патрон промывают 10 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Клотианидин элюируют 8 см3 этилацетата, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.2 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила (A) и 0,005 М ортофосфорной кислоты (B) в градиентном режиме: 0 — 1 мин — 5% A, 1 — 8 мин — увеличение A от 5 до 30%, 8 — 10 мин — 30% A, 10 — 10,1 мин — уменьшение A от 30 до 5%, 10,1 — 13 мин — 5% A. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 270 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание клотианидина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = S_{x} \cdot K \cdot \frac{V}{P} , где

Sx — площадь пика клотианидина на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств клотианидина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клотианидина с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют смесью № 3.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг, где 0,01 мг/кг — предел обнаружения клотианидина в яблоках).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X'} , где

\pm \Delta_{\text{л},X} ( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры Kк рассчитывают по формуле:

K_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\text{д}} , где

\overline{X}\prime , \overline{X} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X'}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Kк) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Kк| <= K, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , где (3)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.