МУК 4.1.3187-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств эпоксиконазола в зеленой массе, зерне и масле кукурузы методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 24.07.2014)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 24 июля 2014 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЭПОКСИКОНАЗОЛА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И МАСЛЕ КУКУРУЗЫ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3187-14

Разработаны сотрудниками «Всероссийского НИИ защиты растений», С.-Петербург (Долженко В.И., Цибульская И.А., Карпова Л.М.).

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.176/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации эпоксиконазола в зеленой массе, зерне и масле кукурузы в диапазоне концентраций 0,05 — 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: эпоксиконазол.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-{2-(4-фторфенил)-[3-(2-хлорфенил)оксиран-2-ил]метил}-1Н-1,2,4-триазол.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C17H13ClFN3O.

Молекулярная масса: 329,8.

Эпоксиконазол представляет собой 2R,3S — 2S,3R энантиомерную пару.

Бесцветные кристаллы без запаха.

Температура плавления: 136,2 °C. Давление пара при 20 °C: < 0,01 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол-вода: Kow log P = 3,44 (pH 7).

Растворимость: в воде — 6,63 x 10-4 г/100 см3 (20 °C); гептане — 0,04; ацетоне — 14,4; дихлорметане — 29,1 (г/100 см3).

Вещество не гидролизуется при pH 5 — 7 в течение 12 дней.

В биологически активных почвах эпоксиконазол разлагается почвенными микроорганизмами — DT50 около 2 — 3 месяцев, в растениях экстенсивно деградирует.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD50 для крыс > 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD50 для крыс > 2 000 мг/кг; не оказывает раздражающего действия на кожу и глаза кролика.

Область применения. Системный фунгицид широкого спектра действия, обладает профилактическим и лечебным свойствами, эффективен против возбудителей ржавчины, мучнистой росы и пятнистости на зерновых и сое.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20, P = 0,95) приведены в табл. 2.

Таблица 2

2. Метод измерений

Методика основана на определении эпоксиконазола методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора после его извлечения из образцов зеленой массы кукурузы, зерна и масла органическим растворителем, очистке экстракта в системе двух несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Идентификация эпоксиконазола проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см2) необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением» ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа капиллярную колонку кондиционируют в токе азота при температуре термостата колонок 250 °C до стабилизации нулевой линии.

7.2 Подготовка растворителей

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 см3 растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного растворителя при температуре 40 °C до объема 1 см3 и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

7.3 Подготовка хроматографической колонки

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и диаметром 10 мм вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 10 см3 гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 см3 смеси гексан-ацетон (8:2 по объему), после чего она готова к работе.

7.4 Проверка хроматографического поведения эпоксиконазола

на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора эпоксиконазола с концентрацией 5 мкг/см3. Отдувают растворитель током азота, остаток растворяют в 3 см3 смеси гексан-ацетон (8:2 по объему) и наносят на подготовленную колонку. Промывают колонку 50 см3 смеси гексан-ацетон (8:2). Элюат отбрасывают. Затем промывают 40 см3 смеси гексан-ацетон (6:4), отбирая фракции по 10 см3. Каждую фракцию упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре до 40 °C, растворяют в 1 см3 н-гексана и анализируют на содержание эпоксиконазола.

Фракции, содержащие эпоксиконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 см3 н-гексана и вновь анализируют на содержание эпоксиконазола. Рассчитывают содержание эпоксиконазола в элюате, определяют полноту вымывания из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения эпоксиконазола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

7.5 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.5.1. Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/см3. Точную навеску эпоксиконазола (100 +/- 0,1) мкг помещают в мерную колбу на 100 см3, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы эпоксиконазола с концентрациями 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя гексан.

7.5.2. Раствор № 1 с концентрацией эпоксиконазола 5 мкг/см3. В мерную колбу на 100 см3 вносят 5 см3 основного раствора и доводят объем до метки гексаном.

7.5.3. Раствор № 2 с концентрацией эпоксиконазола 2,5 мкг/см3. В мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.5.4. Раствор № 3 с концентрацией эпоксиконазола 1,0 мкг/см3. В мерную пробирку вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.5.5. Раствор № 4 с концентрацией эпоксиконазола 0,5 мкг/см3. В мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки гексаном.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы — в течение 2 недель.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют соответствующие градуировочные растворы эпоксиконазола.

7.6 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация эпоксиконазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

C = КS,

где S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|\text{С } - \text{С}_{\text{К}}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}},

где C — аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

CК — результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}} = 10\% при P = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ 13634-90 «Кукуруза. Требования при заготовках и поставках» и с ГОСТ 8808-91 «Масло кукурузное. ТУ». Зерно кукурузы хранят в полотняных мешочках при комнатной температуре. Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб измельченного зерна методом экстракции органическим растворителем при температуре не выше 40 °C. Пробы масла хранят при 4 — 6 °C в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре не более 30 суток.

9. Проведение определения

9.1 Экстракция эпоксиконазола из зеленой массы кукурузы

Навеску зеленой массы (50 +/- 0,1) г вносят в колбу вместимостью 500 см3, добавляют 200 см3 ацетонитрила и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр быстрой фильтрации под вакуумом на воронке Бюхнера в коническую колбу на 500 см3. Осадок на фильтре промывают 100 см3 ацетонитрила. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 10 г пробы, т.е. 1/5 часть суммарного объема фильтрата в грушевидную колбу для упаривания. Раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 30 °C.

9.1.1 Очистка экстракта в системе несмешивающихся

растворителей

Сухой остаток растворяют в 2 см3 ацетонитрила и 50 см3 воды, снова фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку объемом 250 см3, куда добавляют 15 см3 насыщенного раствора хлорида натрия и 30 см3 гексана. Воронку встряхивают в течение 2 мин и после разделения слоев отбирают гексановую фракцию через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в концентратор объемом 250 см3, а водную фракцию возвращают в делительную воронку. Экстракцию эпоксиконазола из водной фазы гексаном повторяют еще дважды. Объединенный гексановый экстракт упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.

9.1.2 Экстракция эпоксиконазола из зерна кукурузы

Навеску размолотого до состояния «крупки» зерна кукурузы (10 +/- 0,1) г вносят в колбу вместимостью 250 см3, добавляют 5 см3 воды и 50 см3 ацетонитрила и встряхивают на механическом аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр быстрой фильтрации в колбу-концентратор на 250 см3. Экстракцию повторяют дважды. Осадок на фильтре промывают 10 см3 той же смеси. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 30 °C. Далее поступают по п. 9.1.1.

9.1.3 Экстракция эпоксиконазола из масла кукурузы

Навеску масла кукурузы (10 +/- 0,1) г растворяют в гексане (конечный объем 90 см3). В делительной воронке экстрагируют эпоксиконазол трижды по 50 см3 ацетонитрила. Объединенный ацетонитрильный экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 30 °C. Далее поступают по п. 9.1.1.

9.2 Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток, полученный по пп. 9.1.1 - 9.1.3 количественно переносят тремя порциями по 1 см3 элюента № 1 в подготовленную по п. 7.3 стеклянную хроматографическую колонку. Промывают колонку 50 см3 элюента № 1. Элюат отбрасывают. Далее элюируют эпоксиконазол 25 см3 элюента № 2. Элюат собирают в грушевидную колбу-концентратор и упаривают на роторном испарителе при температуре 30 °C до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1 см3 гексана и вводят в испаритель хроматографа 1 мм3 полученного раствора.

9.3 Условия хроматографирования

Газовый хроматограф с электронозахватным детектором. Капиллярная кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с толщиной слоя неполярной неподвижной фазы 0,25 мкм. Температура колонки: программирование от 130 °C (30 с) до 230 °C со скоростью 25 °C/мин. Температура испарителя: 270 °C. Температура детектора: 300 °C. Расход газа-носителя (азот) через колонку: 2,0 см3/мин (деление потока 1:20). Поддув газа-носителя к детектору: 18 см3/мин. Объем конечного экстракта: 1 см3, хроматографируемый объем: 1 мм3. Абсолютное время удерживания эпоксиконазола: 10 мин 30 с +/- 5 с.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание эпоксиконазола в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V}{P} \cdot \frac{100}{f} ,

где Sx — площадь пика определяемого компонента на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

К — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г;

f — полнота извлечения определяемого компонента, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств эпоксиконазола в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор эпоксиконазола с концентрацией 5 мкг/см3, разбавляют гексаном.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, (1)

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,

где \overline{\text{Х}} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг <>, где <> — 0,05 мг/кг — предел обнаружения эпоксиконазола в зерне кукурузы).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime},

где \pm \Delta_{\text{л},\text{Х}}( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,

где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

Кк = X' — X - Cд,

где X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} .

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R, (3)

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.