МУК 4.1.3135-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флоникамида в воде, почве, яблоках и яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 12.11.2013)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛОНИКАМИДА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЯБЛОКАХ И ЯБЛОЧНОМ СОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3135-13

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская, В.В. Человечкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Протокол от 29 октября 2013 г. № 3).

3. Утверждены вр.и.о. руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.143/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флоникамида в воде в диапазоне концентраций 0,001 — 0,01 мг/дм3, в почве в диапазоне концентраций 0,02 — 0,2 мг/кг, яблоках и яблочном соке в диапазоне концентраций 0,05 — 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флоникамид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-трифторметил-N-цианометилникотинамид.

Эмпирическая формула: C_{9}H_{6}F_{3}N_{3}O .

Молекулярная масса: 229,2.

Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 157,5 °C.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_{ow}lgP = 0,3 .

Растворимость в воде (г/дм3, 20 °C) — 5,2.

Растворимость в органических растворителях (г/дм3, 20 °C): ацетон — 163,5, толуол — 0,55, этилацетат — 34,2, дихлорметан — 4,5.

Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная \text{ЛД}_{50} = 884 ; 1768 мг/кг массы тела для самцов и самок крыс соответственно. Острая дермальная для крыс \text{ЛД}_{50}>5000\text{мг}/\text{кг} . Не ирритант для кожи и глаз кроликов. Острая токсичность: рыбы \text{ЛК}_{50}>100\text{мг}/\text{л} , дафнии \text{ЭК}_{50}>100\text{мг}/\text{л} , зеленые водоросли \text{ЭК}_{50}>100\text{мг}/\text{л} . Не токсичен для энтомофагов.

Область применения: селективный, системный инсектицид для сосущих насекомых, повреждающих плодовые, зерновые, овощные культуры.

В России для флоникамида гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

2. Метод измерений

Методика основана на определении флоникамида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация флоникамида проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают 2 см3 этилацетата, затем 3 см3 смеси № 1 (гексан:этилацетат).

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления 0,1 М фосфатного буфера взвешивают 11,4 г калия фосфорнокислого двузамещенного 3-водного и 6,8 г калия дигидрофосфата, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в воде и доводят объем до метки водой.

7.3.3. Смесь ацетонитрила с водой в соотношении 20:80 готовят по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.4. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 13:87 по объему, используя мерные цилиндры.

7.4 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску флоникамида (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2 Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями флоникамида 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 и 10,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя смесь ацетонитрила и воды в соотношении 20:80.

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 10,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2,0 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 5,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 1,0 см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией в 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — 2 дней.

При изучении полноты определения флоникамида в воде, почве, яблоках и яблочном соке используют ацетоновые растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетоном.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация флоникамида в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флоникамида в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

где C — аттестованное значение массовой концентрации флоникамида в градуировочном растворе,

C_{\text{К}} — результат контрольного измерения массовой концентрации флоникамида в градуировочном растворе,

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения флоникамида на патроне

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора флоникамида с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 смеси № 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 смеси № 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют флоникамид этилацетатом со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрил-вода 20:80 и анализируют по п. 9.4.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения флоникамида следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.1979), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб». Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки».

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы фруктов хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18 °C. Перед анализом фрукты, не размораживая, измельчают на терке или в гомогенизаторе.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция флоникамида из воды

Пробу воды 100 см3 помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают 2 — 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой собирают, к водному добавляют 30 см3 этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, и собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрил-вода 20:80 и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.2. Экстракция флоникамида из почвы

Навеску почвы 20 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 20 см3 ацетона. Пробирку плотно закрывают и помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4000 об/мин. От верхнего слоя отбирают аликвоту 10 см3, соответствующую 10 г пробы, переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C, остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрил-вода 20:80 и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.3. Экстракция флоникамида из яблок

Навеску измельченных плодов яблок 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, добавляют 30 см3 0,1 М фосфатного буфера и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Экстракт декантируют в делительную воронку вместимостью 250 см3, пропуская через бумажный фильтр, к остатку в колбе добавляют 30 см3 буфера и повторяют экстракцию. К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 30 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают 2 — 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3 и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

9.4. Экстракция флоникамида из яблочного сока

Навеску сока 20 г помещают в стакан вместимостью 100 см3, доводят объем до 50 см3 0,1 М фосфатным буфером и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают 2 — 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3 и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

9.5. Очистка на патроне для твердофазной экстракции

Сухой остаток, полученный по п. 9.3 или 9.4, растворяют в 1 см3 смеси № 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см3 смеси № 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Флоникамид элюируют 6 см3 этилацетата, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрил-вода 20:80 и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.6. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 — (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 13:87. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 265 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флоникамида в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г;

f — полнота извлечения флоникамида, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств флоникамида в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флоникамида с концентрацией 10,0 мкг/см3, разбавляют смесью ацетонитрил-вода в соотношении 20:80.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

(1)

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,05 мг/кг*, где * — 0,05 мг/кг — предел обнаружения флоникамида в яблоках).»

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},

где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:

K_{\text{к}} = X\prime - X - C_{\text{д}},

K \sqrt{= \Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}.} (2)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X_{1} , X_{2} — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.