МУК 4.1.3130-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств аметоктрадина в воде, почве, огурцах, салате, луке-репке, моркови, томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 12.11.2013)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АМЕТОКТРАДИНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ОГУРЦАХ, САЛАТЕ, ЛУКЕ-РЕПКЕ, МОРКОВИ, ТОМАТАХ, КЛУБНЯХ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ КАРТОФЕЛЯ, ВИНОГРАДЕ И ВИНОГРАДНОМ СОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Разработаны ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.С. Комарова, В.В. Человечкова); ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России (М.С. Орлов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Протокол от 29 октября 2013 г. № 3).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.129/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации аметоктрадина в воде в диапазоне концентраций 0,001 — 0,01 мг/дм3, в почве, огурцах, луке-репке, моркови, томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде и виноградном соке в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг, в салате в диапазоне концентраций 0,005 — 0,05 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: аметоктрадин.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 6-октил-5-этил-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-7-амин.

Структурная формула:

Молекулярная масса: 275,39.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бежевого цвета без запаха.

Температура плавления: 198 °C.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_{ow} lgP>4,4 (20 °C).

Растворимость в воде (мг/дм3, 20 °C): 0,15.

Растворимость в органических растворителях (г/дм3, 20 °C): диметилсульфоксид — 10,7, метанол — 7,2, дихлорметан — 3,0, ацетон — 1,9, этилацетат — 0,8, ацетонитрил — 0,5, толуол — 0,1, н-гептан — 0,01.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность \text{ЛД}_{50}>2000\text{мг}/\text{кг} массы тела. Острая кожная токсичность \text{ЛД}_{50}>2000\text{мг}/\text{кг} массы тела. Острая ингаляционная токсичность \text{ЛК}_{50}(4\text{ч})>5,3\text{мг}/\text{л} . Раздражающее действие для кроликов: кожа — не раздражает; глаза — не раздражает.

Сенсибилизация — не обладает.

Область применения: системный высокоизбирательный фунгицид, применяется на овощах и винограде против фитофтороза, переноспороза, бремия и др.

В России для аметоктрадина гигиенические нормативы не установлены.

1. ПОГРЕШНОСТЬ ИЗМЕРЕНИЙ

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Метрологические параметры

2. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ

Методика основана на определении аметоктрадина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью, очистки перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и последующей очистки на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация аметоктрадина проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, РЕАКТИВЫ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА И МАТЕРИАЛЫ

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

4. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРОВ

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. ПОДГОТОВКА К ОПРЕДЕЛЕНИЮ

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон для удаления кислотных компонентов пробы (слабоосновный анионообменник с привитыми аминогруппами) промывают 2 см3 смеси № 2, затем 3 см3 смеси № 1.

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.3. 20%-й раствор натрия хлористого: в мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 200 г натрия хлористого, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.4. 0,2 М раствор натрия гидроксида: 8,0 г натрия гидроксида помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску аметоктрадина (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

7.4.2 Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями аметоктрадина 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65).

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение недели.

При изучении полноты определения аметоктрадина в воде, почве, огурцах, салате, луке-репке, моркови, томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация аметоктрадина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = K · S, где

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C — аттестованное значение массовой концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе;

\text{С}_{K} — результат контрольного измерения массовой концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения аметоктрадина на патроне

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора аметоктрадина с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 смеси № 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 смеси № 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 3 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют аметоктрадин смесью № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы (ацетонитрил — 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты, 35:65) и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие аметоктрадин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения аметоктрадина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. ОТБОР ПРОБ И ХРАНЕНИЕ

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб». Отбор проб овощей производится в соответствии с техническими условиями по ГОСТ 1726-85 «Огурцы свежие»; ГОСТ 27166-86 «Лук репчатый свежий, заготовляемый и поставляемый»; ГОСТ 1721-85 «Морковь столовая свежая, заготовляемая и поставляемая»; ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие»; ГОСТ 7194-81 «Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества». Отбор проб винограда проводится в соответствии с техническими условиями по ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый». Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы овощей и винограда хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18 °C.

9. ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

9.1. Экстракция аметоктрадина из воды

Пробу воды 100 см3 помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 — 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный натрий сернокислый, и собирают в круглодонную колбу вместимостью 25 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.2. Экстракция аметоктрадина из почвы

Навеску измельченной почвы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, последовательно добавляют 5 см3 воды, 10 см3 ацетонитрила, 8 г семиводного магния сернокислого и 1 г натрия хлористого. Пробирку плотно закрывают и помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают аликвоту 5 см3, переносят в круглодонную колбу вместимостью 25 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.5.

9.3. Экстракция аметоктрадина из огурцов, салата, лука-репки, моркови, томатов, винограда, зеленой массы и клубней картофеля

Навеску измельченной культуры (5 г — зеленая масса картофеля, 10 г — огурцы, салат, лук-репка, морковь, томаты, виноград, клубни картофеля) помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, добавляют 30 см3 смеси № 3 и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Водно-ацетоновый экстракт декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, пропуская через бумажный фильтр быстрой фильтрации, к остатку в колбе добавляют 20 см3 смеси № 3 и повторяют экстракцию. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка, добавляют 20 см3 20%-го водного раствора натрия хлористого, доводят объем до 100 см3 0,2 М раствором натрия гидроксида и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 — 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке 20 см3 0,2 М раствора натрия гидроксида, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, пропуская через воронку, содержащую безводный натрий сернокислый. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

9.4. Экстракция аметоктрадина из виноградного сока

Навеску 10 г сока помещают в стакан вместимостью 150 см3, добавляют 20 см3 20%-го водного раствора натрия хлористого, доводят объем до 100 см3 0,2 М раствором натрия гидроксида и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 — 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке 20 см3 0,2 М раствора натрия гидроксида, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, пропуская через воронку, содержащую безводный натрий сернокислый. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

9.5. Очистка на аминофазном ионообменном патроне

Сухой остаток, полученный по пп. 9.2 - 9.4, растворяют в 1 см3 смеси № 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см3 смеси № 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 3 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Аметоктрадин элюируют 5 см3 смеси № 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе (0,5 см3 — почва; 1 см3 — огурцы, салат, лук-репка, морковь, томаты, клубни и зеленая масса картофеля, виноград и виноградный сок) и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.6. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка для неионогенных среднеполярных соединений (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 295 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание аметоктрадина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V}{P} \cdot \frac{100}{f} , где

S_{x} — площадь пика аметоктрадина на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

Содержание остаточных количеств аметоктрадина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор аметоктрадина с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. ПРОВЕРКА ПРИЕМЛЕМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,005 мг/кг*, где * — 0,005 мг/кг — предел обнаружения аметоктрадина в салате).

13. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

\pm \Delta_{\text{л},\text{Х}}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:

Х ' , X, \text{С}_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }'}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} , (2)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{(\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2})} \leq R , где (4)