МУК 4.1.3102-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств этаметсульфурон-метила в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 08.08.2013)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299).
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
8 августа 2013 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЭТАМЕТСУЛЬФУРОН-МЕТИЛА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.3102-13
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 8 августа 2013 г.
Свидетельство о метрологической аттестации от 04.10.2012 № 01.00282-2008/0138.04.10.12.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств этаметсульфурон-метила в семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,02 — 0,2 мг/кг.
Методические указания носят рекомендательный характер.
Название действующего вещества по ИСО: этаметсульфурон-метил.
Название действующего вещества по ИЮПАК: метил-2-[(4-этокси-6-метиламино-1,3,5-триазин-2-ил)карбамоилсульфамоил]бензоат.
Эмпирическая формула: C H № O S. 15 18 6 6
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: белый, без запаха. -10
Давление паров: 7,73 х 10 мПа (при 25 °С). Коэффициент распределения октанол - вода: K log P 0,89 (pH 7), 1,558
ow
(pH 5).
Температура плавления: 194 °С.
Растворимость в воде (мг/куб. дм, 25 °С: 1,7 (pH 5), 50 (pH 7), 410 (pH 9).
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °С): ацетон — 1,6; ацетонитрил — 0,83, дихлорметан — 3,9; метанол — 0,35; этанол — 0,17; этилацетат — 0,68.
Константа диссоциации (pKa) (при 25 °С): 4,6 (слабая кислота).
Подвергается гидролизу, Т составляет при pH 5 — 41 день. 50
Краткая токсикологическая характеристика
Этаметсульфурон-метил относится к веществам малоопасным по острой пероральной (ЛД для крыс более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности
50
(ЛД для крыс более 2000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по 50 ингаляционной токсичности (ЛК для крыс (4 ч) более 5700 мг/куб. м). Не 50 раздражает кожу и слабо раздражает слизистую оболочку глаз. Онкогенные, мутагенные, тератогенные свойства этаметсульфурон-метила не выявлены.
Этаметсульфурон-метил — послевсходовый гербицид системного действия, проникающий преимущественно через листья растений и ингибирующий фермент ацетолактатсинтазу. Подавляет развитие однолетних и многолетних двудольных сорняков в посевах рапса с нормой расхода 15 — 30 г д.в./га.
В России проходит регистрационные испытания в качестве гербицида в посевах ярового и озимого рапса с нормой расхода 25 г/га.
В России гигиенические нормативы не установлены.
1. Погрешность измерений
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), \pm \delta , % (P = 0,95) | Стандартное отклонение повторяемости, \sigma_{r} , % | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % | Норматив оперативного контроля точности, K, мг/кг (P = 0,95, m = 2) |
| Семена подсолнечника | 0,02 — 0,1 вкл. | 50 | 1,36 | 3,78 | 5,29 | 0,59 · X <*> |
| 0,1 — 0,2 вкл. | 25 | 2,21 | 6,14 | 8,60 | 0,30 · X <*> | |
| Масло подсолнечника | 0,02 — 0,1 вкл. | 50 | 1,49 | 4,14 | 5,80 | 0,59 · X <*> |
| 0,1 — 0,2 вкл. | 25 | 1,54 | 4,28 | 5,99 | 0,30 · X <*> |
<*> X — среднее значение массовой концентрации этаметсульфурон-метила в пробе (мг/кг).
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ,
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
ДЛЯ ЭТАМЕТСУЛЬФУРОН-МЕТИЛА
2. Метод измерений
Метод основан на определении этаметсульфурон-метила с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов семян органическим растворителем, а из образцов масла — буфером, дальнейшей очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на концентрирующих патронах № 1.
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства измерений
| Весы аналитические класса точности — специальный (I) с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г | ГОСТ Р 53228-08 |
|---|---|
| Весы лабораторные общего назначения класса точности — средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см | ГОСТ 1770-74 |
| Микрошприц объемом 100 куб. мм со шкалой деления 0,001 куб. см и погрешностью менее 1 % от номинального объема | |
| Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см | ГОСТ 29227-91 |
| pH-метр/милливольтметр с диапазоном измерения 0...14 pH; +/- 1999 мВ | |
| Хроматографическая система, включающая: - хроматограф жидкостный, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С, ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу; - компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ |
|
| Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см | ГОСТ 1770-74 |
Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
| Этаметсульфурон-метил, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 98,9% | |
|---|---|
| Ацетон, осч | ТУ 6-09-3513-86 |
| Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм | ТУ 6-09-2167-84 |
| Аммоний уксусно-кислый (аммония ацетат) безводный, 98% | |
| Вода дистиллированная и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости) | ГОСТ 6709-72 |
| Гелий, очищенный | ТУ 51-940-80 |
| n-Гексан, хч | ТУ 6-09-3818-89 |
| Калий марганцово-кислый, чда | ГОСТ 20490-75 |
| Калий фосфорно-кислый двузамещенный, 3-водный, чда | ГОСТ 2493-75 |
| Кальций хлористый, ч | ТУ 6-09-4711-81 |
| Кислота уксусная, ледяная, хч | ГОСТ 61-75 |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции со слабоосновным сорбентом с размером частиц 63 - 200 мкм с привитыми аминогруппами (объем - 1 куб. см, масса сорбента - 0,6 г) (патрон N 1) | ТУ 4215-002-05451931-94 |
| Метилен хлористый, хч | ТУ 6-09-2662-77 |
| Натрий серно-кислый, безводный, хч | ГОСТ 4166-76 |
| Натрий углекислый, кислый, хч | ГОСТ 4201-79 |
| Натрий хлористый, хч | ГОСТ 4233-77 |
| Натрия гидроокись, хч | ГОСТ 4328-77 |
| Спирт метиловый (метанол), хч | ГОСТ 6995-77 |
| Этилацетат, чда | ГОСТ 22300-76 |
Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3. Вспомогательные устройства и материалы
| Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами | ГОСТ 25336-82 |
|---|---|
| Аппарат для встряхивания проб с возвратно-поступательным направлением колебаний, максимальной загрузкой 10 кг, амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту | |
| Банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 куб. см | |
| Ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 куб. дм | |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556-81 |
| Воронки делительные на 250 и 500 куб. см | ГОСТ 25336-82 |
| Воронки лабораторные стеклянные | ГОСТ 25336-82 |
| Испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 куб. см, изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об./мин., водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 куб. дм и диапазоном температур от 20 до 100 °С | |
| Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 куб. см | ГОСТ 25336-82 |
| Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250, 1000 и 4000 куб. см ТС | ТУ 92-891.029-91 |
| Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18 | |
| Насос диафрагменный, химически стойкий на 100 %, с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс., избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 куб. дм/мин. | |
| Предколонка хроматографическая стальная длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8 | |
| Стаканы стеклянные термостойкие объемом 100 - 500 куб. см | ГОСТ 25336-82 |
| Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 куб. см и приемной конической колбой объемом 1000 куб. см | |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстрофильтрующие диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г | ТУ 6-09-1678-86 |
| Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм | |
| Центрифуга лабораторная настольная с максимальным рабочим числом оборотов 4000 об./мин., рабочим объемом ротора 200 куб. см х 4 ячейки, выбираемый временной диапазон работы от 0 до 100 мин. и набором полипропиленовых банок емкостью 200 куб. см | |
| Шприц инъекционный однократного применения объемом 10 куб. см | ГОСТ Р ИСО 7886-1-09 |
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать нормы, установленные ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
6. Условия измерений
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению определений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов для проведения анализа, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах N 1, установление градуировочной характеристики.
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.
7.1.2 Очистка ацетона
Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцово-кислый калий из расчета 100 мг/куб. дм. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.
7.1.3 Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.
7.1.4 Очистка этилацетата
Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем этилацетат сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Этилацетат перегоняют при температуре 77,1 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 77,1 °С, отбрасывают.
7.1.5 Очистка хлористого метилена
Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-ного раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °С, отбрасывают.
7.2. Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, 0,01 М водный раствор уксусной кислоты и спирт метиловый.
В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 350 куб. см ацетонитрила, 50 куб. см метанола и 550 куб. см 0,01 М водного раствора уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
7.2.2 Приготовление рабочих растворов
7.2.2.1 Приготовление 0,01 М водного раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу объемом 1000 куб. см помещают 500 куб. см очищенной воды и 600 мг ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой). Раствор используют для приготовления подвижной фазы. Раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.2.2. Приготовление 0,01 М водного раствора аммония уксусно-кислого.
В мерную колбу объемом 1000 куб. см переносят 700 мг аммония уксусно-кислого, добавляют 500 куб. см очищенной воды и перемешивают до полного растворения соли. Доводят водой объем в колбе до метки и еще раз тщательно перемешивают. Раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.2.3 Приготовление 6 М раствора соляной кислоты.
Мерным цилиндром отбирают 246 куб. см концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 куб. см, куда предварительно наливают около 100 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой). Раствор хранят не более 6 месяцев при комнатной температуре.
7.2.2.4. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорно-кислого калия.
В мерную колбу на 500 куб. см переносят 5,7 г калия фосфорно-кислого двузамещенного 3-водного и 50 г натрия хлористого, добавляют 200 - 300 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки. Раствор хранят не более 3 месяцев при комнатной температуре.
7.2.2.5. Приготовление раствора для разведения проб и приготовления стандартных растворов.
Мерным цилиндром отмеряют 15 куб. см ацетонитрила и помещают в плоскодонную колбу объемом 100 куб. см. Туда же помещают 85 куб. см 0,01 М водного раствора аммония уксусно-кислого. Смесь тщательно перемешивают и используют для приготовления стандартных растворов для хроматографирования и растворения проб перед хроматографированием. Раствор хранят не более 2 недель при комнатной температуре.
7.2.3 Приготовление градуировочных растворов
7.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией этаметсульфурон-метила 100,0 мкг/куб. см.
Взвешивают 10 мг этаметсульфурон-метила в мерной колбе объемом 100 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартного раствора. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
7.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией этаметсульфурон-метила 10,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией этаметсульфурон-метила 1,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с 0,01 М раствором уксусно-кислого аммония в соотношении 15:85. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией этаметсульфурон-метила 0,5 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с 0,01 М раствором уксусно-кислого аммония в соотношении 15:85. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией этаметсульфурон-метила 0,2 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с 0,01 М раствором уксусно-кислого аммония в соотношении 15:85. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией этаметсульфурон-метила 0,1 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с 0,01 М раствором уксусно-кислого аммония в соотношении 15:85. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.7. Стандартный раствор N 3 с концентрацией этаметсульфурон-метила 1,0 мкг/куб. см (в ацетонитриле).
Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для изучения хроматографического поведения этаметсульфурон-метила на концентрирующих патронах N 1. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.8. Стандартные растворы этаметсульфурон-метила в ацетоне с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/куб. см для внесения в образцы.
Из стандартного раствора N 2 методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы. Растворы готовят непосредственно перед внесением в контрольные образцы.
7.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации этаметсульфурон-метила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.4. Подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения этаметсульфурон-метила на них
7.4.1 Подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.
Патрон N 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 куб. см этилацетата. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения этаметсульфурон-метила на концентрирующих патронах N 1
Из стандартного раствора этаметсульфурон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см.
Исходный концентратор обмывают последовательно двумя порциями по 10 куб. см этилацетата, затем 5 куб. см 0,1%-ной уксусной кислоты в этилацетате и 10 куб. см 2%-ной уксусной кислоты в этилацетате, наносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с 0,01 М раствором уксусно-кислого аммония в соотношении 15:85 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие этаметсульфурон-метил, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения этаметсульфурон-метила на концентрирующих патронах N 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.
7.5. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 ч.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.79 N 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 22391-89 "Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ Р 52465-05 "Масло подсолнечное. ТУ", ГОСТ Р 52062-03 "Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб".
Отобранные пробы семян подсолнечника подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы подсолнечного масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 10 суток.
9. Выполнение определения
9.1. Семена подсолнечника
9.1.1 Экстракция
Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют 75 куб. см ацетона и помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну и на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. После экстракции пробу центрифугируют 5 мин. при скорости 4000 об./мин. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще раз, используя 75 куб. см ацетона и помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну и на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Пробы центрифугируют, фильтруют, экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, упаривают до маслянистого остатка при температуре не выше 30 °С.
9.1.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 3 куб. см ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора, прибавляют туда же 50 куб. см 0,05 М щелочного буфера (pH 9) и переносят раствор в делительную воронку. Водный экстракт промывают двумя порциями гексана по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний (водный) слой собирают в химический стакан объемом 100 куб. см, а верхний (гексановый) слой отбрасывают. Водную фазу возвращают в делительную воронку и промывают двумя порциями хлористого метилена по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний (метиленовый) слой отбрасывают.
Водный остаток подкисляют 6 М соляной кислотой до pH 3 и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Этаметсульфурон-метил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.1.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1
Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 5 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, и вносят на предварительно кондиционированный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают последовательно двумя порциями по 10 куб. см этилацетата и одной порцией объемом 5 куб. см 0,1%-ной уксусной кислоты в этилацетате и вносят на патрон, элюаты отбрасывают. Этаметсульфурон-метил элюируют 10 куб. см 2%-ной уксусной кислоты в этилацетате. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с 0,01 М раствором уксусно-кислого аммония в соотношении 15:85 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.2. Масло подсолнечника
9.2.1 Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Из пробы подсолнечного масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 куб. см тремя порциями гексана объемом по 30 куб. см. Этаметсульфурон-метил экстрагируют четырьмя порциями по 30 куб. см 0,05 М щелочного буфера (pH 9), каждый раз интенсивно встряхивая воронку в течение 2 мин.
После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой с небольшим количеством эмульсии объединяют к конической колбе объемом 250 куб. см. После четвертой экстракции верхний гексановый слой отбрасывают, а объединенный водный экстракт возвращают в делительную воронку и выдерживают 5 мин. Затем нижний (водный) слой фильтруют через фильтр средней плотности в чистую делительную воронку объемом 250 куб. см.
Водный экстракт промывают двумя порциями гексана по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний (водный) слой собирают в химический стакан объемом 100 куб. см, а верхний (гексановый) слой отбрасывают. Водную фазу возвращают в делительную воронку и промывают двумя порциями хлористого метилена по 30 см, каждый раз интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний (метиленовый) слой отбрасывают.
Водный остаток подкисляют 6 М соляной кислотой до pH 3 и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Этаметсульфурон-метил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.3 "Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1".
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с 0,01 М раствором уксусно-кислого аммония в соотношении 15:85 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.3. Условия хроматографирования
Хроматографическая система, включающая:
- хроматограф жидкостный, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С, ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу;
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.
Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18.
Предколонка хроматографическая стальная длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8.
Подвижная фаза: ацетонитрил - метанол - 0,01 М уксусная кислота в соотношении 35:5:55.
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
10. Обработка результатов
Содержание этаметсульфурон-метила в пробах рассчитывают по формуле:
S · A · V
пр
X = ------------- · P , 100 · S · m ст
где:
X - содержание этаметсульфурон-метила в пробе, мг/кг;
S - высота (площадь) пика стандарта, мм;
ст
S - высота (площадь) пика образца, мм;
пр
A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемого образца, г (куб. см);
P - содержание этаметсульфурон-метила в аналитическом стандарте, %.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:
2 · |X - X | · 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг при вероятности }P = 0,95,
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,02 мг/кг» <*>.
<*> 0,02 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
Контроль стабильности градуировочной характеристики для этаметсульфурон-метила проводят в начале и окончании каждой серии анализов, а также при смене: основного градуировочного раствора № 1 — каждые три месяца, основных градуировочных растворов № 2, 3, 4, 5 и 6 — каждый месяц.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание этаметсульфурон-метила в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/куб. см.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
|X - C| · 100
X — концентрация этаметсульфурон-метила контрольного измерения, мкг/куб. см;
C — известная концентрация градуировочного раствора этаметсульфурон-метила в смеси ацетонитрила с 0,01 М раствором уксусно-кислого аммония в соотношении 15:85, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см;
2,52 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 2,52%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов этаметсульфурон-метила, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},
где \pm \Delta_{\text{л},X} ( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{\text{Х}}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к
_ _ K = X' - X - C , к д _ _ где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив оперативного контроля точности K рассчитывают по формуле:
K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом к контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):
2 · |X - X | · 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:<br>
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
(таб. 1), %.
(5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)