МУК 4.1.3094-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ципроконазола в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, в семенах и масле подсолнечника, рапса и сои методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 31.07.2013)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299).
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
31 июля 2013 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЦИПРОКОНАЗОЛА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И МАСЛЕ КУКУРУЗЫ, В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА, РАПСА И СОИ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 июля 2013 г.
Свидетельство о метрологической аттестации от 4 октября 2012 г. № 01.00282-2008/0137.04.10.12.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств в зеленой массе кукурузы в диапазоне 0,5 — 5,0 мг/кг; в зерне и масле кукурузы в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг; в семенах и масле подсолнечника и сои в диапазоне 0,02 — 0,2 мг/кг; в семенах и масле рапса в диапазоне 0,1 — 1,0 мг/кг.
Методические указания носят рекомендательный характер.
Название действующего вещества по ИСО: ципроконазол.
Название действующего вещества по ИЮПАК: (2RS, 3RS; 2RS, 3SR)-2-(4-хлорфенил)-3-циклопропил-1-(1H-1,2,4,-триазол-1-ил)-бутан-2-ол.
Эмпирическая формула: C_{15}H_{18}ClN_{3}O .
Агрегатное состояние: кристаллический порошок.
Давление насыщенного пара: 2,6\text{х }10^{- 2}\text{мПа} (при 25 °C).
Температура плавления: 106,2 — 106,9 °C.
Коэффициент распределения в системе октанол/вода: K_{ow}logP = 3,1 .
Растворимость в воде (мг/куб. дм): 140 при 25 °C, 93 при 22 °C.
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм при 25 °C): ацетон — 360, этанол — 230, метанол — 410, диметилсульфоксид — 180, ксилол — 120, толуол — 100, дихлорметан — 430, этилацетат — 240, гексан — 1,3, октанол — 100.
Ципроконазол стабилен в водных растворах при pH 1 — 9 при тестовом периоде 35 дней (50 °C) или 14 дней (80 °C). Медленно гидролизуется в 1 н HCl и NaOH.
Не проявляет основных или кислотных свойств в диапазоне pH от 3,5 до 10.
Краткая токсикологическая характеристика
Ципроконазол относится к веществам малоопасным по острой пероральной ( \text{ЛД}_{50} для крыс 1020 — 1333 мг/кг) и дермальной ( \text{ЛД}_{50} для крыс более 2000 мг/кг) токсичностям, но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности ( \text{ЛК}_{50} для крыс (4 ч) более 5650 мг/куб. м). Не вызывает раздражения глаз и не раздражает кожу. Не обладает мутагенной активностью.
Ципроконазол — системный фунгицид защитного, куративного и искореняющего действия, быстро абсорбируется растениями и передвигается акропетально. Ингибитор деметилирования стероидов.
Предлагается в России в качестве фунгицида в посевах яровой и озимой пшеницы для борьбы с эпифитотиями бурой, желтой и стеблевой ржавчины с рекомендуемой нормой расхода по препарату 0,1 куб. дм/га, с мучнистой росой, септориозом, гельминтоспориозной пятнистостью, церкоспореллезом и фузариозом колоса в дозе 0,15 — 0,2 куб. дм/га, в посевах ржи для борьбы с возбудителями мучнистой росы, бурой ржавчины, ринхоспориоза, гельминтоспориозной пятнистостью с рекомендуемой нормой расхода 0,15 — 0,2 куб. дм/га, в посевах сахарной свеклы против церкоспороза, мучнистой росы, ржавчины в дозе 0,15 — 0,2 куб. дм/га.
В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД — 0,005 мг/кг массы тела человека; ОДК в почве — 0,2 мг/кг; ПДК в воде водоемов — 0,001 мг/куб. дм; ОБУВ в воздухе рабочей зоны — 0,7 мг/куб. м; ОБУВ в атмосферном воздухе — 0,001 мг/куб. м; МДУ в сельскохозяйственной продукции (мг/кг): зерно хлебных злаков — 0,05; свекла сахарная, горох, плодовые (семечковые), виноград — 0,1.
1. Погрешность измерений
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значения, приведенные в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ДЛЯ ЦИПРОКОНАЗОЛА
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), \pm \delta , %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, \sigma_{r} , % | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % | Норматив оперативного контроля точности, К, мг/кг (P = 0,95, m = 2) |
| Зеленая масса кукурузы | 0,50 — 1,0 вкл. | 25 | 2,39 | 6,64 | 9,30 | 0,30 х X <*> |
| 2,5 — 5,0 вкл. | 25 | 2,79 | 7,76 | 10,86 | 0,30 х X <*> | |
| Зерно кукурузы | 0,05 — 0,10 вкл. | 50 | 1,81 | 5,03 | 7,05 | 0,59 х X <*> |
| 0,25 — 0,50 вкл. | 25 | 2,91 | 8,09 | 11,33 | 0,30 х X <*> | |
| Масло кукурузы | 0,05 — 0,10 вкл. | 50 | 3,43 | 9,54 | 13,35 | 0,59 х X <*> |
| 0,25 — 0,50 вкл. | 25 | 3,76 | 10,45 | 14,63 | 0,30 х X <*> | |
| Семена подсолнечника | 0,02 — 0,04 вкл. | 50 | 3,09 | 8,59 | 12,03 | 0,59 х X <*> |
| 0,10 — 0,20 вкл. | 25 | 3,22 | 8,95 | 12,53 | 0,30 х X <*> | |
| Масло подсолнечника | 0,02 — 0,04 вкл. | 50 | 3,66 | 10,18 | 14,25 | 0,59 х X <*> |
| 0,10 — 0,20 вкл. | 25 | 4,49 | 12,48 | 17,48 | 0,30 х X <*> | |
| Семена сои | 0,02 — 0,04 вкл. | 50 | 2,50 | 6,95 | 9,73 | 0,59 х X <*> |
| 0,10 — 0,20 вкл. | 25 | 1,18 | 3,28 | 4,59 | 0,30 х X <*> | |
| Масло сои | 0,02 — 0,04 вкл. | 50 | 2,69 | 7,48 | 10,47 | 0,59 х X <*> |
| 0,10 — 0,20 вкл. | 25 | 2,99 | 8,31 | 11,64 | 0,30 х X <*> | |
| Семена рапса | 0,10 — 1,0 вкл. | 25 | 2,76 | 7,67 | 10,74 | 0,30 х X <*> |
| Масло рапса | 0,10 — 1,0 вкл. | 25 | 3,31 | 9,20 | 12,88 | 0,30 х X <*> |
<*> X — среднее значение массовой концентрации ципроконазола в пробе, мг/кг.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ,
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ ЦИПРОКОНАЗОЛА
2. Метод измерения
Метод основан на определении ципроконазола методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием детектора по захвату электронов после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонках с флоризилом.
Идентификация проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность метода достигается за счет подбора колонки и условий программирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства измерений
| Весы аналитические класса точности — специальный (I), с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г | ГОСТ Р 53228-08 |
|---|---|
| Весы лабораторные общего назначения класса точности — средний (III), с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см | ГОСТ 1770-74 |
| Микрошприц объемом 10 куб. мм со шкалой деления 0,1 куб. мм и погрешностью измерения вытесняемого объема +/- 1% | |
| Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см | ГОСТ 29227-91 |
| Хроматографическая система, включающая: - хроматограф газовый с детектором по захвату электронов (ЭЗД), снабженный приспособлениями для капиллярной колонки; - компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ |
|
| Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см | ГОСТ 1770-74 |
Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
| Ципроконазол, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 98,5% | |
|---|---|
| Азот, ос.ч. | ГОСТ 9293-74 |
| Ацетон, ос.ч. | ТУ 6-09-3513-86 |
| Ацетонитрил, ос.ч., УФ-200 нм | ТУ 6-09-2167-84 |
| Вода дистиллированная и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости) | ГОСТ 6709-72 |
| Гелий, очищенный | ТУ-51-940-80 |
| n-Гексан, х.ч. | ТУ 6-09-3818-89 |
| Калий марганцовокислый, ч.д.а. | ГОСТ 20490-75 |
| Кальций хлористый, ч. | ТУ 6-09-4711-81 |
| Кислота соляная, х.ч. | ГОСТ 3118-77 |
| Метилен хлористый, х.ч. | ТУ 6-09-2662-77 |
| Натрий сернокислый, безводный, х.ч. | ГОСТ 4166-76 |
| Натрий хлористый, х.ч. | ГОСТ 4233-77 |
| Флоризил (магния силикат, 99%) для колоночной хроматографии, зернение 60/100 меш. |
Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
| Аппарат для встряхивания проб с возвратно-поступательным направлением колебаний, с максимальной загрузкой 10 кг, амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту | |
|---|---|
| Банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 куб. см | |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556-81 |
| Воронки делительные на 250 и 500 куб. см | ГОСТ 25336-82 |
| Воронки лабораторные стеклянные | ГОСТ 25336-82 |
| Испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 куб. см, изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об./мин., водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 куб. дм и диапазоном температур от 20 до 100 °C | |
| Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 куб. см | ГОСТ 25336-82 |
| Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 куб. см и 4000 куб. см ТС | ТУ 92-891.029-91 |
| Колонка хроматографическая капиллярная из кварцевого стекла с внутренний диаметром 0,25 мм, длиной 30 м, неподвижной фазой, содержащей 100% диметилполисилоксана, и толщиной пленки 0,25 мкм | |
| Насос диафрагменный, химически стойкий на 100%, с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс., избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 куб. дм/мин. | |
| Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 куб. см и приемной конической колбой объемом 1000 куб. см | |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие, диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г | ТУ-6-09-1678-86 |
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать нормы, установленные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-91.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа и уложившиеся в нормативы контроля.
6. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении; выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к определению
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с флоризилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с флоризилом, установление градуировочной характеристики.
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.
7.1.2 Очистка ацетона
Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/куб. дм. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.
7.1.3 Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C отбрасывают.
7.1.4 Очистка хлористого метилена
Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 12 — 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.
7.2. Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление рабочих растворов
7.2.1.1 Приготовление подкисленного ацетонитрила.
К необходимому объему ацетонитрила пипеткой добавляют концентрированную соляную кислоту до pH \approx 1 . При приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой.
7.2.2 Приготовление градуировочных растворов
7.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией ципроконазола 1,0 мг/куб. см.
Взвешивают 50 мг ципроконазола в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике не более 6 месяцев.
7.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией ципроконазола 10,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более месяца.
7.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией ципроконазола 1,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 3 хранится в холодильнике не более 14 дней.
7.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией ципроконазола 0,5 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 14 дней.
7.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией ципроконазола 0,2 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 2 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 14 дней.
7.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией ципроконазола 0,1 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 14 дней.
7.2.2.7. Стандартные растворы ципроконазола с концентрацией 2,0; 1,0; 0,5 и 0,2 мкг/куб. см для внесения в контрольные образцы.
Методом последовательного разведения ацетоном стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,5 и 0,2 мкг/куб. см ципроконазола, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.
7.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации ципроконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.
В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.6. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.4. Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения ципроконазола на ней
7.4.1 Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила с зернением 60/100 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см. Колонку промывают 15 куб. см ацетона и высушивают.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения ципроконазола на колонке с флоризилом
В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора ципроконазола в ацетоне с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора, добавляют 4 куб. см гексана, перемешивают и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1,5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:3 и 6 порциями объемом 5 куб. см каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие ципроконазол, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения ципроконазола на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флоризила.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ Р ИСО 6497-11 «Корма растительного происхождения. Методы отбора проб», ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ Р 53510-09 «Масло соевое. ТУ», ГОСТ 8808-2000 «Масло кукурузное, ТУ», ГОСТ 22391-89 «Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ Р 52465-05 «Масло подсолнечное. ТУ», ГОСТ Р 53457-09 «Масло рапсовое, ТУ», ГОСТ Р 52062-03 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».
Пробы зеленой массы кукурузы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 — 4 °C не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C до 2 лет.
Отобранные пробы зерна кукурузы, а также семян сои, подсолнечника и рапса подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы кукурузного, соевого, подсолнечного и рапсового масел хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 10 суток.
9. Выполнение определения
9.1. Зеленая масса кукурузы
9.1.1 Экстракция
Образец измельченной зеленой массы кукурузы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см. Ципроконазол экстрагируют 70 куб. см ацетонитрила, помещая пробы на аппарат для встряхивания проб на 30 мин. Экстракт фильтруют в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 40 куб. см ацетонитрила и помещая пробу на аппарат для встряхивания проб на 30 мин. Из объединенного экстракта берут аликвоту 1/5 часть в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
9.1.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, добавляют 5 куб. см ацетона, обмывают стенки концентратора, затем прибавляют 80 куб. см дистиллированной воды, перемешивают содержимое в концентраторе и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Ципроконазол экстрагируют тремя порциями хлористого метилена по 40 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. Хлористый метилен собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
9.1.3 Очистка экстракта на колонке с флоризилом
Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора, добавляют 4 куб. см гексана, перемешивают и полученный раствор наносят на подготовленную колонку. Исходную колбу последовательно обмывают 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:3, элюаты отбрасывают. Ципроконазол элюируют с колонки 20 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.2. Зерно кукурузы и семена рапса
9.2.1 Экстракция
Образец измельченного зерна кукурузы или семян рапса массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см. Ципроконазол экстрагируют 50 куб. см ацетонитрила, помещая пробы на аппарат для встряхивания проб на 30 мин. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и помещая пробу на аппарат для встряхивания проб на 30 мин. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и упаривают до капель масла на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
9.2.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, добавляют 5 куб. см ацетона и проводят очистку экстракта по п. 9.1.2.
Затем сухой остаток растворяют в 40 куб. см ацетонитрила и переносят содержимое в делительную воронку объемом 250 куб. см. Добавляют в делительную воронку 20 куб. см гексана и встряхивают пробу 2 мин. Нижний (ацетонитрильный слой) собирают в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрил возвращают в делительную воронку. Повторяют процедуру промывки еще раз, используя 20 куб. см гексана. Ацетонитрил собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.3.
Сухой остаток проб зерна кукурузы растворяют в 5 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Сухой остаток проб семян рапса растворяют в 10 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.3. Семена подсолнечника
9.3.1 Экстракция
Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см. Ципроконазол экстрагируют 50 куб. см ацетона, помещая пробы на аппарат для встряхивания проб на 15 мин. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще раз, используя 50 куб. см ацетона и помещая на аппарат для встряхивания проб на 15 мин. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и упаривают до капель масла на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Далее проводят очистку экстракта по пп. 9.2.2, 9.1.3.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.4. Семена сои
9.4.1 Экстракция
Образец измельченных семян сои массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см. Ципроконазол экстрагируют 50 куб. см подкисленного ацетонитрила, помещая пробы на аппарат для встряхивания проб на 30 мин. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см подкисленного ацетонитрила и помещая пробы на аппарат для встряхивания проб на 30 мин. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и упаривают до капель масла на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Далее проводят очистку экстракта по пп. 9.2.2, 9.1.3.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.5. Масло кукурузы, подсолнечника, рапса и сои
9.5.1 Экстракция и очистка полученного экстракта в системе несмешивающихся растворителей
Из пробы кукурузного (подсолнечного, рапсового или соевого) масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см. Навеску растворяют в 50 куб. см гексана, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и экстрагируют ципроконазол 15 мин. на аппарате для встряхивания проб. Затем экстракт переносят в делительную воронку и после полного разделения слоев нижний (ацетонитрильный) слой собирают в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см, а гексановый слой возвращают в полипропиленовую банку для экстракции. Повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и встряхивая смесь по 15 мин. на аппарате для встряхивания проб.
Объединенный ацетонитрильный экстракт из плоскодонной колбы переносят в чистую полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, добавляют к нему 30 куб. см гексана и помещают на 10 мин. на аппарат для встряхивания проб. Затем экстракт переносят в делительную воронку и после полного разделения слоев нижний (ацетонитрильный) слой собирают в концентратор и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе до капель масла при температуре водяной бани не выше 30 °C. Верхний гексановый слой отбрасывают.
Далее проводят очистку экстракта по пп. 9.2.2, 9.1.3.
Сухой остаток проб кукурузного масла растворяют в 5 куб. см ацетона и 1 мм пробы вводят в хроматограф.
Сухой остаток проб подсолнечного и соевого масла растворяют в 2 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Сухой остаток проб рапсового масла растворяют в 10 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.6. Условия хроматографирования
Колонка хроматографическая капиллярная из кварцевого стекла с внутренним диаметром 0,25 мм, длиной 30 м, неподвижной фазой, содержащей 100% диметилполисилоксана и толщиной пленки 0,25 мкм.
- хроматограф газовый с детектором по захвату электронов (ЭЗД), снабженный приспособлениями для капиллярной колонки;
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.
Температура детектора 320 °C, поток обдува анода (азот) 6,0 куб. см/мин., поток поддува 58,0 куб. см/мин.
Температура испарителя 260 °C, тип газа — гелий, режим Split, давление 31,98 psi, деление потока 10:1, split-поток 20,0 куб. см/мин.
Программированный нагрев колонки с 210 °C (выдержка 15 мин.) по 10 град./мин. до 260 °C (выдержка 5 мин.), режим — постоянный поток, поток колонки 2,0 куб. см/мин., средняя скорость 49 см/с.
Абсолютное время удерживания ципроконазола: 5,683 мин. +/- 3%.
Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,1 — 1,0 нг.
10. Обработка результатов анализа
Содержание ципроконазола в пробах рассчитывают по формуле:
X = \frac{S_{\text{пр}} \cdot A \cdot V}{100 \cdot S_{\text{ст}} \cdot m} \cdot P,
где X — содержание ципроконазола в пробе, мг/кг или мг/куб. дм;
A — концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г;
P — содержание ципроконазола в аналитическом стандарте, %.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}|}{|X_{1} + X_{2}|} \leq r,(1)
где X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг или мг/куб. дм;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\text{х }\sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,02 мг/кг» <*>.
<*> 0,02 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
Контроль стабильности градуировочной характеристики для ципроконазола проводят в начале и по окончании каждой серии анализов, а также при смене основных градуировочных растворов:
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание ципроконазола в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/куб. см.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{|X - C| \cdot 100}{C} \leq 1,60,
C — известная концентрация градуировочного раствора ципроконазола в ацетоне, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см;
1,60 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 1,60%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов ципроконазола, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом «добавок».
C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X'},
где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
K_{k} = \overline{X}' - \overline{X} - C_{\text{д}},
где \overline{X}' , \overline{X} , C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X'}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{|X_{1} + X_{2}|} \leq R,(3)
где X_{1} , X_{2} — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЦИПРОКОНАЗОЛА ИЗ ЗЕЛЕНОЙ МАССЫ, ЗЕРНА
И МАСЛА КУКУРУЗЫ, СЕМЯН И МАСЛА ПОДСОЛНЕЧНИКА, РАПСА И СОИ
(5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)