МУК 4.1.3069-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение концентраций трифенацина (по дифенацину) в атмосферном воздухе населенных мест методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 19.07.2013)

19 июля 2013 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ ТРИФЕНАЦИНА (ПО ДИФЕНАЦИНУ) В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3069-13

1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации от 14.08.2012 № 0126.24.08.12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в атмосферном воздухе населенных мест массовой концентрации трифенацина (по дифенацину) в диапазоне 0,00016 — 0,0032 мг/куб. м.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Трифенацин — смесь производных индан-1,3-дионов, основным компонентом которой является дифенацин (дифацинон) — содержание не менее 70%.

Дифенацин

2-(дифенилацетил)-индан-1,3-дион (IUPAC)

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C_{23}H_{16}O_{3} .

Молекулярная масса: 340,4.

Твердое вещество светло-желтого цвета. Температура плавления 145 — 147 °C. Давление паров 1,37 \cdot 10^{- 5}\text{МПа} (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях (в г/кг): хлороформ — 204; толуол — 73; ксилол — 50; ацетон — 29; этанол — 2,1; н-гептан — 1,8. Практически нерастворим в воде — менее 0,3 мг/куб. дм. Растворим в щелочах с образованием солей. Стабилен в течение 14 дней при pH 6 — 9, гидролизуется (< 24 ч) при pH 4. Быстро разлагается в воде на солнечном свету. Слабая кислота, образует водорастворимые соли щелочных металлов.

Агрегатное состояние в атмосферном воздухе — аэрозоль.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD_{50}) в мг/кг: для крыс — 2,3; мышей — 340; кроликов — 35; кошек — 14,7; собак — 3 - 7,5; острая дермальная токсичность (LD_{50}) для крыс — менее 200 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC_{50}) для крыс — менее 2 мг/куб. дм (4 ч).

Область применения

Дифенацин — ротентицид класса индандионов, обладающий антикоагулянтной активностью, рекомендуется для борьбы с грызунами в открытом грунте (осень, зима, весна) на зимующих культурах (зерновые, пастбищные травы, древесные, кустарниковые насаждения и др.), в защищенном грунте на всех культурах независимо от сезона. Применяется в виде приманки.

1. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей +/- 25%, при доверительной вероятности 0,95.

2. Метод измерений

Измерения концентраций трифенацина (по дифенацину) выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором.

Концентрирование вещества из воздуха осуществляют на бумажный фильтр высокой плотности, экстракцию с фильтров выполняют ацетоном.

Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы — 1 нг. Средняя полнота извлечения с фильтров — 90,2%.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. ТУ 2504-1797-75

Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг ГОСТ Р 53228-08

Колбы мерные 2-100-2 и 2-1000-2 ГОСТ 1770-74

Меры массы ГОСТ OIML R 111-1-09

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 куб. см ГОСТ 29227-91

Пробоотборное устройство 2-канальное, с диапазоном расхода 0,2 — 1,0 куб. дм/мин. и 1,0 — 5,0 куб. дм/мин.

Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2, цена деления 1 °C, пределы измерения 0 — 55 °C ТУ 25-2021.003-88

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74

Гигрометр с диапазоном измерений относительной влажности от 30 до 90% ТУ 25-11-1645-84

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Дифенацин (дифацинон, ратиндан), аналитический стандарт с содержанием основного компонента 98,2% ГСО 7704-99

Ацетон, ос.ч. ГОСТ 2603-79

Ацетонитрил для хроматографии, х.ч. ТУ-6-09-14.2167-84

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная) ГОСТ Р 52501-2005 Калий марганцовокислый (перманганат калия, х.ч. ГОСТ 20490-75

Калий углекислый (карбонат калия, поташ), х.ч., прокаленный ГОСТ 4221-76

Кислота ортофосфорная, х.ч., 85% ГОСТ 6552-80

Спирт этиловый (этанол) ректификованный ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87

Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора), х.ч. ТУ 6-09-4173-85

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аппарат для встряхивания                            ТУ 64-1-2851-78
Бумажные фильтры высокой плотности                  ТУ 2642-001-05015242-07

Воронка Бюхнера ГОСТ 9147-80

Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм ГОСТ 25336-82

Груша резиновая ТУ 9398-005-0576-908

Колба Бунзена ГОСТ 25336-82

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 150 куб. см ГОСТ 9737-93

Мембраны микропористые капроновые ТУ 9471-002-10471723-03

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Насос водоструйный ГОСТ 25336-82

Пинцет медицинский нержавеющий ГОСТ 21241-89

Стаканы химические с носиком, вместимостью 150 куб. см ГОСТ 25336-82

Стекловата

Стеклянные палочки

Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 30

Установка для перегонки растворителей

Фильтродержатель

Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С8, зернением 5 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе на должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка бумажных фильтров средней плотности.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1 Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2 Ацетон

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 840 куб. см ацетонитрила, добавляют 160 куб. см бидистиллированной или деионизованной воды и 1,0 куб. см ортофосфорной кислоты, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.4.1. Исходный раствор дифенацина для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г дифенацина, растворяют в 50 — 60 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре -18 °C в течение 3 месяцев.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.4.2. Раствор № 1 дифенацина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора дифенацина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Градуировочный раствор № 1 хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °C в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.4.3. Рабочие растворы № 2 — 5 дифенацина для градуировки (концентрация 0,05 — 1,0 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,5 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией дифенацина 0,05; 0,1; 0,25 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Рабочие растворы сразу после приготовления помещают в холодильник, где они хранятся при температуре 4 — 6 °C не более 7 дней.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации дифенацина в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки № 2 — 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 7.5.1. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков, на основании которых строят градуировочную зависимость.

7.5.1 Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором.

Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С8, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-ортофосфорная кислота (84:16:0,1, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 312 нм.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования: 1 — 20 нг.

7.6. Подготовка фильтров для отбора проб воздуха

Диаметр бумажного фильтра должен соответствовать внутреннему диаметру фильтродержателя.

Фильтры последовательно по 3 раза промывают на воронке Бюхнера этанолом, затем ацетонитрилом порциями 25 — 30 куб. см, сушат с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, затем на воздухе при комнатной температуре. До использования фильтры хранят в герметично закрытой стеклянной таре.

8. Отбор и хранение проб воздуха

Отбор проб проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ в воздухе населенных мест».

В течение 26 мин. отбирают 2 параллельные пробы, для чего воздух аспирируют с объемным расходом 6 куб. дм/мин. через 2 установленных параллельно фильтродержателя (аллонжа), в каждый из которых помещен бумажный фильтр высокой плотности.

Для измерения концентрации дифенацина на уровне 0,8 ОБУВ для атмосферного воздуха необходимо отобрать 312,5 куб. дм воздуха (две параллельные пробы по 156,25 куб. дм воздуха). Срок хранения отобранных проб, помещенных в полиэтиленовые пакеты, в морозильной камере при температуре -18 °C — 30 дней.

9. Выполнение измерений

Две параллельно отобранные пробы воздуха объединяют, экспонированные фильтры переносят в химический стакан вместимостью 150 куб. см, заливают 20 куб. см ацетона, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Растворитель сливают, фильтры обрабатывают новыми порциями ацетона объемом 15 куб. см еще дважды, выдерживая на ультразвуковой бане последовательно 1 мин., затем 30 с.

Объединенный экстракт упаривают в грушевидной колбе на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C почти досуха, оставшийся растворитель отдувают потоком теплого воздуха. Остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы (подготовленной по п. 7.2) и анализируют при условиях хроматографирования, указанных в п. 7.5.1.

Пробу вводят в испаритель хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площадь пика действующего вещества, с помощью градуировочного графика определяют концентрацию дифенацина в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

10. Обработка результатов анализа

Концентрацию трифенацина (по дифенацину) в пробе воздуха (X), мг/куб. м рассчитывают по формуле:

X = \frac{C \cdot W}{V_{t}} ,

где:

C — концентрация дифенацина в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

W — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

V_{t} — объем пробы воздуха, отобранный для анализа, приведенный к нормальным условиям (давление 760 мм рт. ст., температура 0 °C), куб. дм.

V_{t} = \frac{2R \cdot P \cdot u \cdot t}{273 + T} ,

где:

T — температура воздуха при отборе проб (на входе в аспиратор), °C;

P — атмосферное давление при отборе пробы, мм рт. ст.;

u — расход воздуха при отборе пробы, куб. дм/мин.;

t — длительность отбора пробы, мин.;

R — коэффициент, равный 0,357 для атмосферного воздуха;

2 — коэффициент, учитывающий объединение при анализе 2-х параллельно экспонированных проб.

Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

11. Оформление результатов измерений

Результат количественного анализа представляют в виде:

• результат анализа в мг/куб. м, характеристика погрешности \delta , % (табл.), P = 0,95 или

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{м}^{3}, P = 0,95,

где:

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/куб. м;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/куб. м;

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, табл.), %.

Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.

Если содержание вещества менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание трифенацина (по дифенацину) в пробе атмосферного воздуха — менее 0,00016 мг/куб. м» <*>.

---

<*> 0,00016 мг/куб. м — предел обнаружения при отборе 312,5 куб. дм атмосферного воздуха.

12. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

Таблица

ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

Анализи-    Диапазон  Показатель Показатель     Предел      Предел воспро-
руемый      опреде-   точности   повторяе-   повторяемости  изводимости
объект      ляемых    (границы   мости         (значение    (значение до-
            концент-  относи-    (средне-     допустимого   пустимого рас-
            раций,    тельной    квадра-      расхождения   хождения между
            мг/куб. м погреш-    тичное       между двумя   двумя результа-
                      ности,     отклонение  результатами   тами измерений,
                      P = 0,95), повторяе-   параллельных   полученных

\pm \delta , % мости), определений), в разных \sigma_{r} r, мг/куб. м лабораториях), мг/куб. м R, мг/куб. м (P = 0,95)

Атмосферный 0,00016 — 21 0,20 \cdot X 0,14 \cdot X 0,05 \cdot X воздух 0,0032

\overline{X} — среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в пробе (мг/куб. м).

12.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов растворов для градуировки, содержание дифенацина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,0 мкг/куб. см.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

A = \frac{|X - C| \cdot 100}{C} \leq B,

где:

X — концентрация дифенацина в пробе при контрольном измерении, мкг/куб. см;

C — известная концентрация градуировочного раствора дифенацина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см;

B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов дифенацина, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Образцами для контроля являются реальные пробы воздушной среды. Объем отобранных для контроля процедуры выполнения анализа проб воздуха должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. После отбора проб экстракт с фильтра делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы — X. Во вторую часть делают добавку анализируемого компонента (C_{\text{д}}) и анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы с добавкой — X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы (X) и рабочей пробы с добавкой (X') получают в условиях повторяемости (один аналитик, использование одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.).

C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},

где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/куб. м,

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл.), %.

K_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\text{д}},

где \overline{X}\prime , \overline{X} , C_{\text{д}} — среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно (мг/куб. м).

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).

|K_{\text{к}}| \leq K, (1)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

|X_{1} - X_{2}| \leq R, (2)

где R = 0,20 \cdot \overline{X} ;

\overline{X} = 1/2(X_{1} + X_{2}),

где X_{1} , X_{2} — результаты измерений в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/куб. м.

R — предел воспроизводимости (табл.), мг/куб. м.

Если выполняется условие (2), то воспроизводимость измерений считается удовлетворительной.

---