МУК 4.1.3028-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в бананах, цитрусовых (мякоть, сок) и зерне риса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 03.07.2012)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИФЕНОКОНАЗОЛА В БАНАНАХ, ЦИТРУСОВЫХ (МЯКОТЬ, СОК) И ЗЕРНЕ РИСА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 3 июля 2012 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 00120.22.05.12 от 22.05.2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций дифеноконазола в бананах, цитрусовых и рисе в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.

Дифеноконазол

    C  H  Cl N O
     19 17  2 3 3

Мол. масса 406,3

Соотношение цис и транс-изомеров от 0,7 до 1,5.

Кристаллическое вещество от белого до светло-бежевого цвета. -5

Температура плавления 78,6 °C. Давление паров при 25 °C: 3,3 х 10 мПа.

    Растворимость в органических растворителях (г/куб.  дм):  этанол - 330;
н-гексан  - 3,4; толуол - 490; ацетон - 610. Растворимость в воде при 20 °C
(мг/куб.  дм):  15.  Коэффициент  распределения  н-октанол  -  вода (20 °C)
K   log P = 4,2.    Вещество    устойчиво   к    гидролизу    и    фотолизу

ow (при естественном солнечном свете DT = 145 дней). Дифеноконазол быстро 50 сорбируется почвой и медленно разрушается.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 1453 мг/кг, 50 мышей — > 2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов > 50 2010 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC ) для крыс > 3300 50 мг/куб. дм (4 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел и дождевых червей.

Область применения препарата

Дифеноконазол — системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базилиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши и других патогенов.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

 Анали-    Диапазон    Показатель   Стандарт- Предел  Предел    Норматив
 зируе-  определяемых  точности     ное от-   повто-  воспро- оперативного
 мый     концентраций, (граница     клонение  ряемос- изводи-   контроля
 объект      мг/кг     относи-      повторяе- ти, r,  мости,  точности, К,
                       тельной      мости,    %       R, %        мг/кг

погрешнос- \sigma_{r} , % (P = 0,95, ти), \pm \delta , %, m = 2) P = 0,95

1 2 3 4 5 6 7

Бананы от 0,01 до 50 2,4 8 11 0,59 х \overline{X} 0,1 вкл.

Зерно от 0,01 до 50 2,9 8 11 0,59 х \overline{X} риса 0,1 вкл.

Мякоть от 0,01 до 50 2,5 7 10 0,59 х \overline{X} цитру- 0,1 вкл. совых

Сок от 0,01 до 50 2,6 8 11 0,59 х \overline{X} цитру- 0,1 вкл. совых

\overline{X} — среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в пробе (мг/кг).

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

 Анали-              Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20
 зируемый  ────────────────────────────────────────────────────────────────
 объект     Предел       Диапазон     Полнота   Стандартное  Доверительный
            обнаруже-  определяемых  извлечения отклонение,    интервал

ния, концентраций, вещества, \delta , % среднего мг/кг мг/кг \delta , % результата, +/-, %

 Бананы     0,01       0,01 - 0,1    91,48      2,8          1,5

 Зерно риса 0,01       0,01 - 0,1    85,71      3,4          1,8

 Мякоть     0,01       0,01 - 0,1    91,55      3,1          1,7

цитрусовых

Сок 0,01 0,01 — 0,1 93,10 3,3 1,8 цитрусовых

2. Метод измерений

Метод основан на экстракции дифеноконазола из исследуемой пробы растворителем, очистке экстрактов от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, далее на колонке с силикагелем (бананы, цитрусовые (мякоть, сок) и зерно риса) и на концентрирующем патроне Sep Pak Classik C18 (зерно риса, цитрусовые (мякоть и сок) с последующим измерением содержания дифеноконазола методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронно-захватным детектором (ЭЗД) при программировании температуры и обработкой хроматограмм методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Газовый хроматограф "Кристалл-2000М", снабженный         Номер Госреестра
электронно-захватным детектором с пределом               14516-08

                              -14

детектирования по Линдану 3,5 х 10 г/с, предназначенный для работы с капиллярной колонкой

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим ГОСТ 24104-2001 пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные вместимостью 2-100-2 ГОСТ 1770-74

Меры массы ГОСТ 7328-2001

Микрошприц типа SGE-Cromatek вместимостью 10 куб. мм Номер Госреестра 39206-08

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227-91 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, ГОСТ 1770-74 50, 100 и 250 куб. см

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Дифеноконазол, аналитический стандарт с содержанием ГСО 7656-99 действующего вещества 99,1% (абсолютное значение погрешности +/- 0,9% (НПК «Блок-1»)

Азот газообразный нулевой, марка А (99,999%), в баллонах ТУ 6-21-39-96

Ацетонитрил для хроматографии, осч; УФ-210 нм ТУ 6-09-14-2167-84

Ацетон, осч ГОСТ 2603-79

Вода для лабораторного анализа (деионизованная, ГОСТ Р 52501-2005 бидистиллированная)

н-Гексан (гексан) для ВЭЖХ ТУ 6-09-06-657-84

Калий марганцовокислый (перманганат калия), хч ГОСТ 20490-75

Калий углекислый (карбонат калия, поташ), хч ГОСТ 4221-76

Кислота серная концентрированная, хч ГОСТ 4204-77

Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995-77

Натрий серно-кислый (сульфат натрия) безводный, хч ГОСТ 4166-76

Натрий углекислый (карбонат натрия), хч ГОСТ 83-79

Натрий хлористый, хч, насыщенный водный раствор ГОСТ 4233-77

Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид ТУ 6-09-4173-85 фосфора)

Эфир диэтиловый, чистый для анализа ТУ 2600-001-45682126-11

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Алюминия окись II

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78

Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)

Барометр-анероид с диапазоном измерений от 79,5 ТУ 25-11-1316-76 до 106,5 и ценой деления 0,1 кПа типа М-98

Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные или ТУ 2642-001-05015242-07 фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ

Воронка Бюхнера ГОСТ 9147-80

Воронка делительная вместимостью 250 куб. см ГОСТ 9737-93

Воронки стеклянные конусные типа В-36-80 ХС ГОСТ 25336-82 и В-56-80 ХС

Гигрометр с диапазоном измерений относительной ТУ 25-11-1645-84 влажности от 30 до 90% типа ВИТ-2

Груша резиновая ТУ 9398-05-0576-9082-2003

Колба Бунзена ГОСТ 25336-82

Колбы конические (плоскодонные) вместимостью 100, ГОСТ 23932-90 250 — 300 куб. см

Колбы круглодонные на шлифе (для упаривания) ГОСТ 9737-93 вместимостью 10, 100, 250 куб. см

Колонка стеклянная для препаративной хроматографии длиной 25 см, внутренним диаметром 10 — 12 мм

Концентрирующий патрон Sep Pak Classik C18 Cartidges (360 mg), (Waters, США)

Мельница электрическая бытовая ГОСТ Р 52161.1-2004

Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 25336-82

Стаканы химические вместимостью 100, 250 куб. см ГОСТ 25336-82

Силикагель для колоночной хроматографии 0,2 — 0,5 мм, 40 А

Стекловата

Стеклянные палочки

Термометр с диапазоном измерений от 0 до 55 °C и ГОСТ 28498-90 ценой деления 0,1 °C

Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 30

Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария

Установка для перегонки растворителей

Хроматографическая колонка капиллярная НР-35 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм

Шприц медицинский с разъемом Льюера вместимостью ГОСТ 22090 10 куб. см

Примечание. Допускается использование других вспомогательных средств измерений и устройств иных производителей, технические характеристики которых не уступают указанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны» и ГН 2.2.5.2308-07 «Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением», ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалиста, имеющего квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоившего данную методику и подтвердившего экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению профподготовки допускают оператора с квалификацией лаборант, имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения дифеноконазола на ней, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak Classik C18, проверка поведения вещества на них.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1 Ацетон

Ацетон перегоняют над небольшим количеством марганцовокислого качия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.1.2. н-Гексан

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.3 Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила — 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила — 10 г карбоната калия).

7.1.4 Диэтиловый эфир

Растворитель проверяют на присутствие перекисей. Перекись удаляют путем пропускания растворителя через короткую колонку (диаметр колонки 3 — 4 см, высота сорбента 5 — 6 см), наполненную окисью алюминия. Применение активированной окиси алюминия позволяет одновременно высушивать растворитель.

7.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки (концентрация 250 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,025 г дифеноконазола, растворяют в 50 — 70 куб. см смеси гексан:ацетон (8:2 по объему), доводят до метки этой же смесью, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

7.2.2. Раствор № 1 дифеноконазола для градуировки (концентрация 2,5 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора дифеноконазола для градуировки с концентрацией 250 мкг/куб. см (п. 7.2.1), доводят до метки смесью гексан:ацетон (8:2 по объему), тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.2.3. Рабочие растворы № 2 — 5 дифеноконазола для градуировки (концентрация 0,025 — 0,25 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 4,0 и 10 куб. см раствора № 1 дифеноконазола с концентрацией 2,5 мкг/куб. см (п. 7.2.2), доводят до метки смесью гексан:ацетон (8:2 по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией дифеноконазола 0,025; 0,05; 0,1 и 0,25 мкг/куб. см соответственно.

Растворы № 2 — 5 готовят непосредственно перед использованием.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (S, мВ х сек.) от концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки № 2 — 5.

В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

7.4. Приготовление смесей для приготовления градуировочных растворов и очистки экстрактов на колонке

7.4.1. Смесь гексан:ацетон (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 80 куб. см гексана и 20 куб. см ацетона, перемешивают.

7.4.2. Смесь гексан:ацетон (объемное соотношение 95:5). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 95 куб. см гексана и 5 куб. см ацетона, перемешивают.

7.4.3. Смесь гексан:ацетон (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 90 куб. см гексана и 10 куб. см ацетона, перемешивают.

7.4.4. Смесь гексан:ацетон (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 70 куб. см гексана и 30 куб. см ацетона, перемешивают.

7.4.5. Смесь гексан:диэтиловый эфир (объемное соотношение 4:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 80 куб. см гексана и 20 куб. см диэтилового эфира, перемешивают.

7.5. Приготовление смесей для очистки экстрактов на концентрирующем патроне Sep Pak Classik C18

7.5.1. Смесь ацетонитрил:вода (объемное соотношение 1:9). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см ацетонитрила и 90 куб. см воды, перемешивают.

7.5.2. Смесь ацетонитрил:вода (объемное соотношение 2:8). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 20 куб. см ацетонитрила и 80 куб. см воды, перемешивают.

7.5.3. Смесь ацетонитрил:вода (объемное соотношение 3:7). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 30 куб. см ацетонитрила и 70 куб. см воды, перемешивают.

7.5.4. Смесь ацетонитрил:вода (объемное соотношение 1:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 50 куб. см ацетонитрила и 50 куб. см воды, перемешивают.

7.6. Приготовление растворов внесения

7.6.1. Исходный раствор дифеноконазола для внесения (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г дифеноконазола, растворяют в 50 — 70 куб. см ацетона, доводят им до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.6.2. Раствор № 1 дифеноконазола для внесения (концентрация 5 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 5,0 куб. см исходного раствора дифеноконазола для внесения с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.7. Подготовка колонки с силикагелем

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 — 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию — 4 г силикагеля в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 15 куб. см смеси гексан:ацетон в объемном соотношении 9:1, скорость прохождения растворителя 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

7.8. Подготовка концентрирующего патрона Sep Pak Classik C18 для очистки экстрактов

Концентрирующий патрон Sep Pak Classik C18 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 5 куб. см метанола и 10 куб. см воды со скоростью 5 куб. см/мин. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.9. Проверка хроматографического поведения дифеноконазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора № 5 дифеноконазола для градуировки с концентрацией 0,25 мкг/куб. см (п. 7.2.3), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (8:2 по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40 — 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 5 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку — 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан:ацетон в объемном соотношении 9:1, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 70 куб. см смеси гексан:ацетон (7:3 по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (8:2 по объему), анализируют содержание дифеноконазола по п. 9.5.

Фракции, содержащие дифеноконазол, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения дифеноконазола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

7.10. Проверка поведения дифеноконазола на концентрирующем патроне Sep Pak Classik C18

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора № 5 дифеноконазола для градуировки с концентрацией 0,25 мкг/куб. см (п. 7.2.3), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая на ультразвуковую баню на 40 — 60 с, затем добавляют 9,0 куб. см деионизованной воды, перемешивают и наносят на подготовленный концентрирующий патрон Sep Pak Classik C18 (п. 7.8). Патрон промывают 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:9 по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил:вода (2:8 по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил:вода (объемное соотношение 3:7), элюаты отбрасывают.

Дифеноконазол элюируют с патрона 20 куб. см смеси ацетонитрил:вода (1:1 по объему), отбирая фракционно (по 5 куб. см), элюат упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (8:2 по объему), анализируют содержание дифеноконазола по п. 9.5.

Фракции, содержащие дифеноконазол, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ: ГОСТ 4427-82 «Апельсины. Технические условия»; ГОСТ 4428-82 «Мандарины. Технические условия»; ГОСТ 4492-82 «Лимоны. Технические условия»; ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб»; ГОСТ 6293-90 «Рис. Требования при заготовках и поставках», и «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы цитрусовых и бананов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 1 недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Рис подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более месяца. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Пробы сока цитрусовых анализируют в день изготовления.

Перед анализом образцы измельчают с помощью гомогенизатора.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

9.1.1 Бананы, цитрусовые (мякоть и сок)

Измельченные образцы исследуемых продуктов массой 25 г вносят в коническую колбу на 250 — 300 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетона, интенсивно встряхивают вручную в течение 3 мин. и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин., затем в течение 3 мин. выдерживают на ультразвуковой бане.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр «красная лента». В коническую колбу с пробой вносят новые порции экстрагента объемом 50 куб. см и повторно экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 20 мин., затем на ультразвуковой бане в течение 1 мин., после чего раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтр промывают ацетоном, порцией 30 куб. см.

Экстракт и промывную жидкость помещают в мерный цилиндр на 250 куб. см, отбирают 1/5 экстракта (эквивалентную 5 г образца), переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см и добавляют 30 куб. см деионизованной воды. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до водного остатка. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2 Зерно риса

Измельченные образцы риса массой 25 г вносят в коническую колбу на 250 — 300 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон:вода (8:2 по объему), после встряхивания вручную в течение 3 мин. помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин., затем в течение 3 мин. выдерживают на ультразвуковой бане.

Пробам дают отстояться, надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр «красная лента». В коническую колбу с пробой вносят новые порции экстрагента объемом 50 куб. см и повторно экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 20 мин., затем на ультразвуковой бане в течение 1 мин., после чего раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтр промывают ацетоном порцией 30 куб. см.

Экстракт и промывную жидкость помещают в мерный цилиндр на 250 куб. см, отбирают 1/5 экстракта (эквивалентную 5 г образца), переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см и добавляют 30 куб. см деионизованной воды. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до водного остатка. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Водный остаток, полученный по пп. 9.1.1 или 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Колбу ополаскивают 10 куб. см деионизованной воды, которую также переносят в делительную воронку. Вносят в воронку 15 куб. см насыщенного водного раствора хлористого натрия и 30 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (объемное соотношение 4:1). Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 2 — 3 мин. После полного разделения слоев верхний органический слой (гексан-диэтиловый эфир) фильтруют через слой безводного сульфата натрия в колбу для упаривания вместимостью 100 куб. см. Водную фракцию возвращают и дважды повторяют экстракцию новыми порциями по 25 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (4:1 по объему).

Объединенный органический экстракт, пропущенный через безводный сульфат натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C. Сухой остаток подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток, полученный по п. 9.2, находящийся в колбе для упаривания, растворяют в 5,0 куб. см смеси гексан — ацетон (95:5 по объему), наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.6. Колбу ополаскивают дважды порциями смеси гексан — ацетон по 2,5 куб. см, которую наносят на колонку, скорость прохождения растворителя через колонку — 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан — ацетон в объемном соотношении 9:1, элюат отбрасывают.

Дифеноконазол элюируют с колонки 70 куб. см смеси гексан — этилацетат в объемном соотношении 7:3 со скоростью 1 — 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. При анализе проб бананов сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2 по объему), помещают в ультразвуковую баню на 40 — 60 с и анализируют содержание дифеноконазола методом ГЖХ по п. 9.5.

Пробы зерна риса, цитрусовых (мякоть и сок) подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Sep Pak Classik по п. 9.4.

9.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Sep Pak Classik C18 (зерно риса, цитрусовые (мякоть и сок))

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют с помощью ультразвуковой бани в 1 куб. см ацетонитрила, затем добавляют 9,0 куб. см деионизованной воды, перемешивают и переносят на подготовленный концентрирующий патрон Sep Pak Classik C18 (п. 7.8). Патрон промывают 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:9 по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (2:8 по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (объемное соотношение 3:7), элюаты отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:1 по объему) в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2 по объему) и анализируют содержание дифеноконазола по п. 9.5.

9.5. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф, снабженный электронно-захватным детектором.

Колонка капиллярная НР-35 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.

Температура: детектора — 320 °C, испарителя — 290 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура 230 °C, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 260 °C, выдержка 2 мин., нагрев колонки со скоростью 15 °/мин. до температуры 295 °C.

Газ 1 (азот): давление 100 кПа, 40,27 см/с, поток 1,782 куб. см/мин.

Газ 2 (азот): деление потока 1:3; сброс 6,9 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Ориентировочное время выхода дифеноконазола: 17 мин. 46 с — 17 мин. 50 с.

Линейный диапазон детектирования: 0,025 — 0,25 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,25 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан — ацетон (8:2 по объему), не более чем в 50 раз.

10. Обработка результатов анализа

                                C х V

X = -----, m

где:

C — концентрация дифеноконазола, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r,(1)

где:

    X , X  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X}±\Delta),\text{мг}/\text{кг},\text{при вероятности }P = 0,95,

где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;

\Delta = \frac{\delta \times X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание дифеноконазола в пробах бананов, зерна риса, цитрусовых (мякоть и сок) менее — 0,01 мг/кг <*>».

<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения дифеноконазола в пробах бананов, зерна риса, цитрусовых (мякоть и сок) соответственно.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание дифеноконазола в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,025 до 0,25 мкг/куб. см.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где:

X — концентрация дифеноконазола в пробе при контрольном измерении, мкг/куб. см;

C — известная концентрация градуировочного раствора дифеноконазола, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см;

10 — погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов дифеноконазола, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа

Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C должна удовлетворять условию:

                  д

\text{С}_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},

где:

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,

где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг.

\Delta = \frac{\delta \times X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности, табл. 1), %.

Контрольный параметр процедуры К рассчитывают по формуле: к

\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - \text{С}_{\text{д}},

где \overline{X}\prime,\overline{X},\text{С}_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом к контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

|\text{К}_{\text{к}}| \leq \text{К},(2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r,(3)

где:

    X , X     -    результаты    измерений,    выполненных   в    условиях,
     1   2
воспроизводимости  (разное  время,  разные операторы,  разные лаборатории),

мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.