МУК 4.1.3027-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пенфлуфена в воде, почве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2012)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 3 июля 2012 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
3 июля 2012 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕНФЛУФЕНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ И КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
с момента утверждения
1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 3 июля 2012 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство о метрологической аттестации № 00121.22.05.12 от 22.05.2012.
Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций пенфлуфена в воде, почве и клубнях картофеля в диапазонах 0,0005 — 0,005 мг/куб. дм, 0,01 — 0,1 и 0,01 — 0,1 мг/кг соответственно.
2'-[(RS)-1,3-диметилбутил]-5-фтор-1,3-диметил-1Н-пиразол-4-карбоксанилид (IUPAC)
C H FN O 18 24 3
Белое кристаллическое вещество. Температура плавления 111 °C. Давление -7 -6 паров 4,1 x 10 Па (при 20 °C); 1,2 x 10 Па (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях при 20 °C (г/куб. дм): ацетон - 139; н-гексан - 1,6; диметилсульфоксид - 162; дихлорметан > 250; метанол - 126; толуол - 62; этилацетат - 96. Растворимость в воде при 20 °C (мг/куб. дм): 11,0 (pH 4); 10,9 (pH 7); 11,2 (pH 9). Пенфлуфен гидролитически стабилен в кислых,
нейтральных и щелочных условиях при комнатной температуре.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс > 2000 мг/кг; острая 50 дермальная токсичность (LD ) для крыс > 2000 мг/кг; острая ингаляционная 50 токсичность (LC ) для крыс > 2022,5 мг/куб. м. 50
Пенфлуфен — системный фунгицид широкого спектра действия класса пиразолов, рекомендуется к применению на картофеле для обработки клубней до или во время посадки.
1. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Анали- Диапазон Показатель Стандарт- Предел Предел Норматив зиру- определяемых точности ное повто- вос- оперативного емый концентраций, (граница отклонение ряемо- произ- контроля объект мг/куб. дм относительной повторя- сти, води- точности, K, (мг/кг) погрешности), емости, r, % мости, мг/куб. дм
%, P = 0,95 \sigma_{r} , % R, % (мг/кг) (P = 0,95, m = 2)
_ Вода от 0,0005 до 50 3,7 10 14 0,59 x X <*> 0,005 вкл.
_ Почва от 0,01 до 50 4,1 11 16 0,59 x X <*> 0,1 вкл.
_ Клубни от 0,01 до 50 4,2 12 17 0,59 x X <*> карто- 0,1 вкл. феля
_
<*> X — среднее значение массовой концентрации пенфлуфена в пробе (мг/куб. дм, мг/кг).
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.
| Анализируемый | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | Предел обнаружения, мг/куб. дм (мг/кг) | Диапазон определяемых концентраций, мг/куб. дм (мг/кг) | Полнота извлечения вещества, % | Стандартное отклонение, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
| Вода | 0,0005 | 0,0005 — 0,005 | 91,24 | 3,43 | 1,83 |
| Почва | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 89,74 | 4,03 | 2,15 |
| Клубни картофеля | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 86,18 | 4,17 | 2,22 |
Метод основан на определении пенфлуфена с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после гомогенизирования анализируемого образца измельченного картофеля с флорисилом, последующей экстракции пенфлуфена системой растворителей дихлорметан — ацетон и очистки экстракта на патронах для твердофазной экстракции C18 Sep Pak Classic; извлечения вещества из анализируемого образца почвы водным ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с оксидом алюминия. Для концентрирования и очистки пробы воды использованы патроны для твердофазной экстракции C18 Sep Pak Classic.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
реактивы и материалы
3.1 Средства измерений
Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Номер Госреестра с переменной длиной волны фирмы "Agilent" 16193-06
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим ГОСТ 24104-2001 пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г
Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, ГОСТ 1770-74 2-1000-2
Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227-91 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью ГОСТ 1770-74 25, 50, 100, 250, 500 и 1000 куб. см
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Пенфлуфен, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 99,2%, CAS 494793-67-8 (фирма «Bayer CropScience»)
Ацетонитрил для хроматографии, х.ч. ТУ 6-09-14-2167-84
Вода для лабораторного анализа (деионизованная, ГОСТ Р 52501-2005 бидистиллированная)
н-Гексан, х.ч. ТУ 2631-003-05807999-98
Калий марганцовокислый (перманганат калия), х.ч. ГОСТ 20490-75
Калий углекислый (карбонат калия), х.ч., прокаленный ГОСТ 4221-76
Кальций хлористый (хлорид кальция), х.ч., насыщенный ГОСТ 450-77 водный раствор
Кислота ортофосфорная, х.ч., 85% ГОСТ 6552-80
Кислота серная концентрированная ГОСТ 14262-78
Метилен хлористый (дихлорметан), х.ч. ГОСТ 12794-80
Метиловый спирт (метанол), х.ч. ГОСТ 6995-77
Натрия гидроокись (гидроксид натрия), х.ч. ГОСТ 4328-77
Натрий серно-кислый (сульфат натрия) безводный, х.ч. ГОСТ 4166-76
Натрий углекислый (карбонат натрия), х.ч. ГОСТ 83-79
Оксид алюминия (окись алюминия) для хроматографии, нейтральный, 50 — 200 микрон, CAS 1344-28-01 (фирма «ACROS ORGANICS», Бельгия)
Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид ТУ 6-09-4173-85 фосфора)
Флорисил (60 — 100 меш.), адсорбент для хроматографии («Флука», Швейцария)
Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией.
3.3 Вспомогательные средства измерений,
устройства и материалы
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с или орбитальный ТУ 64-1-2851-78 шейкер OS-10, диапазон регулировки оборотов 50 — 200 об./мин., орбита до 10 мм
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумага индикаторная универсальная pH 1 - 10 ТУ 6-09-1181-89 Бумажные фильтры "красная лента", обеззоленные или ТУ 2642-001-05015242-07
фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ
Воронка делительная вместимостью 250 куб. см ГОСТ 9737-93
Воронки стеклянные конусные типа В-36-80 ХС ГОСТ 25336-82 и В-56-80 ХС
Груша резиновая ТУ 9398-05-0576-9082-2003 Гигрометр с диапазоном измерений относительной ТУ 25-11-1645-84
влажности от 30 до 90% типа ВИТ-2
Колбы конические (плоскодонные) с пришлифованной ГОСТ 23932-90 пробкой вместимостью 250 — 300 куб. см
Колбы круглодонные на шлифе (для упаривания) вместимостью 50, 150 и 250 куб. см
Стеклянная колонка длиной 30 см, внутренним диаметром 18 мм
Стеклянная колонка длиной 25 см, внутренним диаметром 15 мм
Мембранные фильтры микропористые марки ММК, ТУ 9471-002-10471723-2003 капроновые, диаметром 50 мм, размер пор 0,45 мкм
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 25336-82
Патроны для твердофазной экстракции (картриджи) C18 Sep Pak Classic (360 mg), WAT051910 (Waters, США)
Сито с диаметром отверстий 1 мм
Стаканы химические вместимостью 400 куб. см ГОСТ 25336-82
Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 30
Ротационный вакуумный испаритель B-169 фирмы Buchi, Швейцария
Установка для перегонки растворителей
Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB C18, зернение 5 мк
Термометр с диапазоном измерений от 0 до 55 °C и ценой деления 0,1 °C
Центрифуга роторная, скорость вращения до 3500 об./мин., с центрифужными стаканами объемом 100 куб. см
Барометр-анероид М-67 ТУ 2504-1797-75
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм
Шприц медицинский инъекционный однократного ГОСТ 24861-91 применения вместимостью 10 куб. см (ИСО 7886-84)
Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений и устройств иных производителей, технические характеристики которых не уступают указанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03, 2.2.5.2308-07 и 1.2.2701-10. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией лаборант, имеющего опыт работы в химической лаборатории.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление растворов, подготовка колонок с оксидом алюминия и флорисилом, концентрирующих патронов, проверка хроматографического поведения пенфлуфена на колонке с оксидом алюминия, патроне C18 Sep Pak Classic.
7.1 Очистка органических растворителей
7.1.1 Ацетон
Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетона — 10 г перманганата калия и 2 г карбоната калия) или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.
7.1.2 Ацетонитрил
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила — 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила — 10 г карбоната калия).
7.1.3 Гексан
7.1.3.1 Приготовление раствора гидроксида натрия с массовой долей 2,0%
В мерную колбу вместимостью 250 куб. см, содержащую 100 — 150 куб. см бидистиллированной воды, помещают (5,0 +/- 0,1) г натрия гидроксида, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.
7.1.3.2 Очистка гексана
Гексан встряхивают в делительной воронке с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения визуально наблюдаемого окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
7.1.4 Хлористый метилен
7.1.4.1 Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%
Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помешают в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.
7.1.4.2 Очистка растворителя
Растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.
7.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
7.2.1 Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с объемной долей 0,2% (0,2%-ный раствор)
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помешают 250 — 300 куб. см бидистиллированной воды, вносят 2 куб. см ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.
7.2.2 Приготовление подвижной фазы
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помешают 600 куб. см ацетонитрила, вносят 400 куб. см 0,2%-ного раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.
7.3 Кондиционирование хроматографической колонки
Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2.) при скорости подачи растворителя 0,8 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.
7.4 Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения
7.4.1 Исходный раствор пенфлуфена для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г пенфлуфена, растворяют в 50 — 60 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.
Раствор хранят в морозильной камере при температуре -18 °C в течение 3 месяцев.
Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.
7.4.2 Раствор № 1 пенфлуфена для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора пенфлуфена с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.
Градуировочный раствор № 1 хранят в морозильной камере при температуре -18 °C в течение месяца.
Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено — найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.
7.4.3. Рабочие растворы № 2 — 5 пенфлуфена для градуировки (концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см)
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией пенфлуфена 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.
Рабочие растворы сразу после приготовления помещают в холодильник, где они хранятся при температуре 4 — 6 °C не более 10 дней.
7.5 Установление градуированной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мЕА x с) от концентрации пенфлуфена в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки № 2 — 5.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.
7.6 Подготовка колонки с флорисилом
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см, внутренним диаметром 18 мм уплотняют тампоном из стекловаты, насыпают 2 г безводного сульфата натрия, сверху помещают 1 г флорисила.
7.7. Приготовление смеси хлористый метилен — ацетон (объемное соотношение 9:1) для очистки картофеля на колонке с флорисилом
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 450 куб. см хлористого метилена и 50 куб. см ацетона, перемешивают.
7.8 Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта
Оксид алюминия сушат в сушильном шкафу при 150 °C в течение 2 ч, охлаждают в эксикаторе, затем дезактивируют 3% воды по массе (II степень активности по Брокману).
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 15 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г оксида алюминия в 10 куб. см ацетонитрила. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 0,5 см. Колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.
7.9 Проверка хроматографического поведения пенфлуфена на колонке с оксидом алюминия
В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора № 1 пенфлуфена с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки колбы и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.8. Элюат собирают и упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. Исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом 10 куб. см каждая и последовательно наносят на колонку. Каждую порцию собирают в отдельные колбы и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание пенфлуфена по п. 9.4.
Фракции, содержащие пенфлуфен, объединяют и вновь анализируют.
Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание. Проверку хроматографического поведения пенфлуфена следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.
7.10 Подготовка концентрирующих патронов C18 Sep Pak Classic
Патроны C18 Sep Pak Classic устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Сверху в патрон C18 Sep Pak Classic устанавливают медицинский шприц объемом не менее 10 куб. см, используемый в качестве емкости для элюента.
Концентрирующие патроны промывают последовательно 3 куб. см метанола, затем 5 куб. см бидистиллированной воды. Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворителей через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин., при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
Примечание. В отсутствие специального аллонжа жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 2 — 3 капли в секунду.
7.11 Проверка хроматографического поведения пенфлуфена на концентрирующем патроне C18 Sep Pak Classic
В круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора № 1 пенфлуфена с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, остаток растворяют в 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:9, по объему) и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.10. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 2 — 3 капли в секунду. Элюат отбрасывают.
Промывают патрон 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (20:80, по объему). Высушивают патрон пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 2 мин. Пенфлуфен элюируют с патрона 10 куб. см ацетонитрила, собирая 2 порции элюата по 5 куб. см каждая непосредственно в круглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. Остаток в каждой колбе растворяют в 2 куб. см подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание пенфлуфена по п. 9.4. При обнаружении вещества только в первой фракции элюирование пенфлуфена с патрона осуществляют 5 куб. см ацетонитрила; при наличии его в обеих, объем элюента увеличивают до 10 куб. см.
Примечание. Проверку хроматографического поведения пенфлуфена следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.
Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ: вода - ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; почва - ГОСТ 17.4.3.01-83 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; картофель - ГОСТ 51808-2001 «Картофель свежий продовольственный, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ», ГОСТ 7176-85 «Картофель свежий продовольственный, заготовляемый и поставляемый. ТУ», ГОСТ 26832-86 «Картофель свежий для переработки на продукты питания. ТУ», ГОСТ 6014-68 «Картофель свежий для переработки. ТУ» и «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).
Пробы клубней картофеля хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °C. Перед анализом их гомогенизируют. Отобранные пробы воды хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более суток. Почву подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре не более месяца. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр, почвы — просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм.
9.1 Вода
Образец отфильтрованной воды объемом 200 куб. см вносят на концентрирующий патрон C18 Sep Pak Classic, подготовленный по п. 7.10, со скоростью пропускания раствора 2 — 3 капли в секунду, используя разряжение, создаваемое водоструйным насосом. После нанесения пробы патрон промывают 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (10:90, по объему), затем 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (20:80, по объему), элюаты отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 5 куб. см ацетонитрила, собирая элюат в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 50 куб. см. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы, приготовленной по п. 7.2, и анализируют содержание пенфлуфена по п. 9.4.
9.2 Почва
9.2.1 Экстракция
Образец воздушно-сухой почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 — 300 куб. см, вносят 10 куб. см воды и выдерживают 5 мин. при комнатной температуре, после чего добавляют 50 куб. см ацетонитрила и экстрагируют пенфлуфен в течение 5 мин. на ультразвуковой бане, затем дополнительно 5 мин. на аппарате для встряхивания. Пробу центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 2000 оборотов в минуту, дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр «красная лента». Почвенный остаток повторно дважды экстрагируют ацетонитрилом порциями по 50 куб. см с использованием ультразвуковой бани, аппарата для встряхивания, центрифуги.
Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний слой (гексан) отбрасывают, а ацетонитрильный слой промывают еще одной порцией гексана объемом 50 куб. см, которую также отбрасывают. Ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу на 250 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C до водного остатка (объем 5 — 10 куб. см) и далее очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2.2, затем на колонке с оксидом алюминия по п. 9.2.3.
9.2.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Водный остаток в колбе, полученный по п. 9.2.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, туда же добавляют 5 куб. см ацетонитрила, предварительно обмыв им колбу, в которой находилась проба, а также 100 куб. см воды. К смеси добавляют 10 г сухого хлорида натрия и интенсивно перемешивают до полного растворения соли. Пенфлуфен экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая смесь в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой собирают в колбу для упаривания, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха при температуре не выше 35 °C.
9.2.3 Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия
Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки колбы, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.8. Элюат собирают, исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом 10 куб. см каждая и последовательно их наносят на колонку. Элюаты объединяют и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Остаток в колбе растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, приготовленной по п. 7.2, и анализируют содержание пенфлуфена по п. 9.4.
9.3 Клубни картофеля
9.3.1 Экстракция
Образец измельченных клубней картофеля массой 10 г помещают в химический стакан вместимостью 400 куб. см, порциями при перемешивании вносят 15 г флорисила, продолжают перемешивание до получения сыпучего состояния. Затем пробу переносят (насыпая небольшими порциями через воронку) в колонку, подготовленную по п. 7.6. Заполненная колонка не должна содержать пустот. Колонку смачивают 20 куб. см смеси хлористый метилен — ацетон (9:1, по объему), приготовленной по п. 7.7.
Пенфлуфен элюируют с колонки этой же смесью объемом 110 куб. см со скоростью 2 — 3 капли в секунду непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C.
9.3.2 Очистка экстракта на концентрирующем патроне C18 Sep Pak Classic
Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3.1, растворяют в 0,5 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую баню на 1 мин., добавляют 4,5 куб. см воды и вносят на концентрирующий патрон C18 Sep Pak Classic, подготовленный по п. 7.10. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 2 — 3 капли в секунду. Элюат отбрасывают.
Промывают патрон 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (20:80, по объему). Высушивают патрон пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 2 мин. Пенфлуфен элюируют с патрона 10 куб. см ацетонитрила, растворитель упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C. Остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы и анализируют содержание пенфлуфена по п. 9.4.
9.4 Условия хроматографирования
Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны.
Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Eclipse XDB C18, зернение 5 мкм.
Подвижная фаза: ацетонитрил-0,2%-ная ортофосфорная кислота (60:40, по объему).
Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.
Рабочие длины волн: 236 или 254 нм <*>.
<*> Хроматографирование пробы при двух видах волн повышает надежность идентификации.
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
Линейный диапазон детектирования: 2 — 20 нг.
Ориентировочное время выхода пенфлуфена: 7,8 — 8,0 мин.
Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (мЕА x с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию пенфлуфена в хроматографируемом растворе.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, не более чем в 50 раз.
10. Обработка результатов анализа
Содержание пенфлуфена в пробе (X, мг/куб. дм, мг/кг) рассчитывают по формуле:
C x V
C — концентрация пенфлуфена, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — объем (масса) анализируемого образца, куб. см (г).
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2}} \leq r,(1)
X , X - результаты параллельных определений, мг/куб. дм, мг/кг; 1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.
Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta),\text{мг}/\text{дм}^{3},\text{мг}/\text{кг},\text{при вероятности }P = 0,95,
X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/куб. дм, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/куб. дм, мг/кг.
\Delta = \frac{\delta \times X}{100} ,
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание пенфлуфена в пробе воды — менее 0,0005 мг/куб. дм, почвы и клубнях картофеля — менее 0,01 мг/кг» <*>.
<*> Пределы обнаружения пенфлуфена в пробах воды, почвы и клубнях картофеля — 0,0005 мг/куб. дм и 0,01 мг/кг соответственно.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание пенфлуфена в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/куб. см.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
\text{А } = \frac{(\text{Х } - \text{С}) \times 100}{\text{С}} \leq 3,0,
X — концентрация пенфлуфена в пробе при контрольном измерении, мкг/куб. см;
C — известная концентрация градуировочного раствора пенфлуфена, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см;
3,0 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 3,0%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пенфлуфена, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2 Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа
Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок. Величина добавки C должна
д
удовлетворять условию:
C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},
\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/куб. дм, мг/кг.
\Delta = \frac{\delta \times X}{100} ,
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к
_ _ K = X' - X - C , к д
где:
_ _
X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных определений
д
(признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/куб. дм, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом к контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R).
\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2}} \leq R,(3)
X , X - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости 1 2
(разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/куб. дм, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.