МУК 4.1.2984-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств римсульфурона в томатах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)
Примечание
Документ введен в действие с 19 марта 2012 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
19 марта 2012 года
с момента утверждения
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ РИМСУЛЬФУРОНА В ТОМАТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2984-12
1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22.12.2012 № 2).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 марта 2012 г.
3. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство о метрологической аттестации от 25.07.2011 № 01.5.04.015/01.00043/2011.
Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств римсульфурона в томатах в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг.
Название действующего вещества по ИСО: римсульфурон.
Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)-3-(этилсульфонил-2-пиридинсульфонил) мочевина.
Эмпирическая формула: C_{14}H_{17}N_{5}O_{7}S_{2} .
Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 172 — 173 °C, давлением паров 1,5 \times 10^{- 3}\text{м}Pa (25 °C).
Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_{ow}lgP = 0,288 (pH 5), — 1,47 (pH 7).
Растворимость в воде: при 25 °C < 10 мг/л; 7,3 г/л (буферный раствор, pH 7). Хорошо растворим в ацетонитриле, дихлорметане и хлороформе.
Гидролиз (25 °C), DT_{50} : 4,6 дня (pH 5), 7,2 дня (pH 7), 0,3 дня (pH 9).
Группа токсичности по ВОЗ — U; LD_{50} для крыс > 5000 мг/кг.
Послевсходовый системный гербицид, эффективный в борьбе со злаковыми однолетними и многолетними сорняками. Используется для защиты кукурузы, картофеля и томатов.
Гигиенические нормативы для римсульфурона в России: МДУ для римсульфурона в томатах 0,05 мг/кг.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), \sigma_{r} , % | Показатель внутрилабораторной прецизионности, \sigma_{R_{\text{л}}} , % | Показатель воспроизводимости, \sigma_{R} , % | Показатель точности <*> (границы относительной погрешности), \pm \delta , % |
| Томаты | 0,01 — 0,1 | 8 | 9 | 11 | 22 |
| <*> Соответствует расширенной неопределенности U_{\text{отн}.} при коэффициенте охвата k = 2 | |||||
доверительный интервал среднего результата
для n = 20, P = 0,95
2. Метод измерения
Методика основана на определении римсульфурона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из томатов с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на патронах Диапак С16.
Идентификация римсульфурона проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
| Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником | |
| Весы аналитические ВЛА-200 | ГОСТ 24104-01 |
| Весы технические ВЛКТ-500 | ГОСТ 24104-01 |
| Колбы мерные на 10, 100 и 1000 см3 | ГОСТ 23932-90 |
| Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 мм3 и от 1 до 5 см3, вид климатического исполнения УХЛЧ.2 ГОСТ 50444 | |
| Пипетки градуированные объемом 1, 2, 5 и 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| pH-метр универсальный ЭВ-74 | ГОСТ 22261-76 |
| Цилиндры мерные на 50, 100, 500 и 1000 см3 | ГОСТ 23932-90 |
| Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными характеристиками, но не ниже указанных. | |
3.2 Реактивы
| Ацетон, осч | ТУ 6-09-3513-86 |
|---|---|
| Ацетонитрил для ВЭЖХ, сорт 1 или хч | ТУ 6-09-3534-87 |
| Вода бидистиллированная, деионизированная | ГОСТ 6709-79 |
| Гексан, хч | ТУ 2631-003-05807999-98 |
| Кислота ортофосфорная, хч | ГОСТ 6552-80 |
| Метилен хлористый | ТУ 2631-019-44493179-98 |
| Натрий серно-кислый безводный, ч, свежепрокаленный | ГОСТ 4166-76 |
| Римсульфурон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (Sigma-Aldrich) |
Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичной квалификацией, но не ниже указанной.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
4. Требования безопасности
4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
6. Условия измерений
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к определению
7.1 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку (SunFire C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 см3/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 ч.
7.2 Приготовление растворов
7.2.1. Приготовление 50%-го раствора ацетона: в мерную колбу емкостью 1 дм3 помещают 500 мл ацетона и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.2.2. Приготовление 2М раствора ортофосфорной кислоты: 200 г 98%-й (или 225 г 87%-й) кристаллической H_{3}PO_{4} помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в 600 см3 дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.2.3. Приготовление 0,005М раствора ортофосфорной кислоты: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 2,5 см3 2М раствора H_{3}PO_{4} и доводят объем до метки водой для ВЭЖХ.
7.2.4. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 400 см3 ацетонитрила и доводят объем до метки 0,005М раствором ортофосфорной кислоты.
7.2.5. Приготовление элюента: в колбе на 100 см3 смешивают 50 см3 ацетонитрила и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов
Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску римсульфурона (50 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки тем же растворителем.
Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 недели, градуировочные растворы — в течение суток.
При изучении полноты определения для внесения в матрицу используют ацетонитрильные растворы римсульфурона, которые готовят из основного стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/см3 методом последовательного разбавления ацетонитрилом.
7.4 Построение градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация римсульфурона в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации римсульфурона в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:
S — площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
C — аттестованное значение массовой концентрации римсульфурона в градуировочном растворе;
C_{\text{к}} — результат контрольного измерения массовой концентрации римсульфурона в градуировочном растворе;
\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).
7.5 Подготовка патронов Диапак С16
Непосредственно перед употреблением через патрон последовательно пропускают по 2 см3 ацетонитрила и воды. Скорость потока не более 2 см3/мин.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб для анализа проводят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», от 21.08.1979 № 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Требования при заготовках и поставках».
Пробы плодов томатов помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой полиэтиленовой таре.
9. Проведение определения
9.1 Определение римсульфурона в плодах томатов
В коническую колбу емкостью 250 см3 помещают (20 +/- 0,1) г измельченного образца и экстрагируют римсульфурон 50 см3 смеси ацетон-вода (50:50, по объему) на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Объем водного остатка доводят до 100 см3 дистиллированной водой, помещают в делительную воронку объемом 250 см3 и промывают дважды гексаном порциями по 25 см3, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 — 3 мин и отбрасывая после расслоения верхний органический слой.
Водную фазу подкисляют 2М ортофосфорной кислотой до pH 3 и римсульфурон экстрагируют хлористым метиленом дважды по 50 см3, встряхивая воронку каждый раз по 2 — 3 мин. Верхний водный слой отбрасывают. Объединенную органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 см3 хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 2 см3 дистиллированной воды и количественно переносят в откондиционированный патрон (п. 7.5). Фильтрат отбрасывают. Римсульфурон элюируют 3 см3 смеси ацетонитрил-вода в соотношении 50:50, приготовленной по п. 7.2.5. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы и 20 мм3 полученного раствора вводят в хроматограф.
9.2 Условия хроматографирования
Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы Waters с УФ-детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками. Рабочая длина волны 230 нм.
Предколонка Waters SunFire C18 (20 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки. Колонка SunFire C18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA). Температура колонки 30 °C. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,005М раствор ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60. Скорость потока 1 см3/мин. Дозируемый объем 20 мм3. Линейный диапазон детектирования 0,05 — 1,0 мкг/см3.
Время удерживания римсульфурона (11,5 +/- 0,2) мин.
10. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание римсульфурона X (мг/кг) вычисляют по формуле:
S_{x} — площадь пика римсульфурона на хроматограмме испытуемого образца, (AU·c);
K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;
P — навеска анализируемого образца, г;
f — полнота извлечения римсульфурона, приведенная в табл. 2, (%).
Содержание остаточных количеств римсульфурона в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор римсульфурона с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг <*>).»
<*> — 0,01 мг/кг — предел обнаружения римсульфурона в плод томатов.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки C_{\text{д}} должна удовлетворять условию:
\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где
\Delta = \delta \cdot \frac{\overline{X}}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:
\overline{X}\prime , \overline{X} , C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
X_{1} , X_{2} — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.
14. Разработчики
Долженко В.И., Цибульская И.А., Черменская Т.Д., Ковров Н.Г. (ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии, Санкт-Петербург).