МУК 4.1.2845-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 31 марта 2011 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
31 марта 2011 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АЗОКСИСТРОБИНА (ICIA 5504) И ЕГО ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО ИЗОМЕРА (R 230310) В КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
с момента утверждения
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 № 3).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31.03.2011.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Общие положения и область применения
Свидетельство об аттестации методики от 28.09.2010 № 0045.22.09.10.
Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в клубнях картофеля в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.
Название действующего вещества ICIA 5504 по ИЮПАК: Метил(E)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.
Структурная формула ICIA 5504 (не приводится).
Эмпирическая формула: C H № O . 22 17 3 5
Агрегатное состояние: кристаллический порошок.
Цвет, запах: бесцветный, без запаха. -7
Давление паров: 1,1 x 10 мПа (при 20 °C). Коэффициент распределения октанол-вода: K log P = 2,5 (при 20 °C).
ow
Плотность: 1,34 г/куб. см (при 20 °C).
Температура плавления: 116 °C.
Растворимость в воде мг/куб. дм (25 °C): при pH 5,2 — 6,2; pH 7,0 — 6,7; pH 9,2 — 5,9.
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °C): ацетон -86; ацетонитрил — 340; гексан — 0,057; дихлорметан — 400; метанол — 20; толуол — 55; этилацетат — 130; н-октанол — 1,40.
Азоксистробин стабилен в водных растворах при pH 5 — 7 при комнатной температуре, в т.ч. при концентрациях менее 1 мкг/кг.
В почве период полураспада 8 недель (лабораторные условия), 2 недели (полевые условия). Основным путем разложения вещества на поверхности почвы является фотолиз (период полураспада 11 дней) с образованием геометрического Z-изомера.
Краткая токсикологическая характеристика: Азоксистробин относится к веществам малоопасным по острой пероральной (ЛД для крыс более 5000
50
мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД для крыс более 2000 мг/кг), но к 50 опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК для крыс (4 ч) от 698 50 до 962 мг/куб. м). Не обладает генотоксическим, канцерогенным и нейротоксическим действием.
Область применения: Азоксистробин - фунгицид защитного, куративного и искореняющего действия с трансламинарными и системными свойствами. Подавляет прорастание спор и роста мицелия, обладает антиспорулянтной активностью. В дозах 100 - 375 г/га применяется против мучнистой росы, ржавчины, чешуйчатой пятнистости, пятнистости листьев зерновых, ржавчины и корневых гнилей на рисе, милдью виноградной лозы, ржавчины и корневых гнилей на томате и картофеле, настоящей и ложной мучнистой росы тыквенных, корневых гнилей арахиса, цитрусовых, газонных трав. Препарат эффективен
14
против штаммов патогенных грибов, устойчивых к ингибиторам C , — деметилазы, фениламидам, дикарбоксимидам и бензимидазолам.
Применяется в России в качестве фунгицида на томатах, огурцах в дозе 0,4 — 0,5 куб. дм/га, винограде в дозе 0,6 — 0,8 куб. дм/га и зерновых в дозе 0,5 — 1,0 куб. дм/га. Проходит регистрационные испытания в России на посадках картофеля в качестве фунгицида с нормой расхода 3,0 куб. дм/га. В России установлены следующие гигиенические нормативы:
- ДСД — 0,03 мг/кг массы человека;
- ПДК в воде водоемов 0,01 мг/куб. дм;
- МДУ в продукции: томаты, огурцы и виноград — 0,2 мг/кг; клубни картофеля — 0,05 мг/кг.
R 230310 — Z-геометрический изомер Азоксистробина.
Название действующего вещества R 230310 по ИЮПАК: (Z)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.
Структурная формула (не приводится).
R 230310 представляет собой кристаллический порошок желтого цвета.
Физико-химические свойства близки к физико-химическим свойствам Азоксистробина.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
И ЕГО ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО ИЗОМЕРА (R 230310)
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, г, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Азоксистробин (ICIA 5504) | |||||
| Клубни картофеля | 0,01 — 0,1 вкл. | 50 | 4,71 | 13,08 | 15,57 |
| Геометрический изомер Азоксистробина (R 230310) | |||||
| Клубни картофеля | 0,01 — 0,1 вкл. | 50 | 3,73 | 10,36 | 12,33 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТАНДАРТНОЕ
ОТКЛОНЕНИЕ, ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
ДЛЯ АЗОКСИСТРОБИНА (ICIA 5504) И ЕГО ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО
ИЗОМЕРА (R 230310)
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| предел обнаружения, мг/кг | диапазон определяемых концентраций, мг/кг | полнота извлечения вещества, % | стандартное отклонение, S, % | доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| Азоксистробин (ICIA 5504) | |||||
| Клубни картофеля | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 76,3 | 2,89 | 1,35 |
| Геометрический изомер Азоксистробина (R 230310) | |||||
| Клубни картофеля | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 74,3 | 2,02 | 0,95 |
2. Метод измерений
Метод основан на определении Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов клубней картофеля органическим растворителем, очистки экстракта на концентрирующих патронах Диапак С8, Диапак Амин и Диапак С.
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства измерений
Весы аналитические «OHAUS», EP 114 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г, класс точности по ГОСТ 24104-2001 — специальный (I)
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г «ACCULAB» V600, соответствуют классу точности по ГОСТ 24104-2001 — средний (III)
Микрошприц для жидкостной хроматографии, объем 100 куб. мм, фирма «Hamilton», кат. № 80665
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см ГОСТ 29227-91 pH-метр/милливольтметр pH-150 0 — 14 pH; +/- 1999 мВ, номер госрегистрации 10663
Хроматограф жидкостной Waters 515 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации 15311-02
Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см ГОСТ 1770-74
Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Азоксистробин, CAS 131860-33-8, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 99,7%, фирма «Dr. Ehreustorfer GmbH», аккредитованная ИСО-9001-2000
R 230310, CAS 23783-98-4, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 96,0%, фирма «Dr. Ehreustorfer GmbH»,
аккредитованная ИСО-9001-2000 Ацетон, ос.ч. ТУ 6-09-3513-86 Ацетонитрил, ос.ч., УФ-200 нм ТУ 6-09-2167-84
Вода бидистиллированная (бидистиллят), деионизированная или перегнанная над KMnO ГОСТ 6709-72 4
Гелий очищенный, марки "А" ТУ-51-940-80 n-Гексан, х.ч. ТУ 6-09-3818-89
Калий марганцовокислый, ч.д.а. ГОСТ 20490-75
Кальций хлористый, ч. ТУ 6-09-4711-81
Концентрирующие патроны Диапак Амин, Диапак С и Диапак С8 (0,6 г), фирма «БиоХимМак СТ» ТУ 4215-002-05451931-94
Натрий сернокислый безводный, х.ч. ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, х.ч. ГОСТ 4233-77
Этилацетат, ч.д.а. ГОСТ 22300-76
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Алонж прямой с отводом для вакуума (АО-14/23) для работы с концентрирующими патронами Диапак Амин и Диапак С ГОСТ 25336-82
Аппарат для встряхивания проб «SKLO UNION TYP LT1»
Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. № 3120-0250, фирма «NALGENE»
Ванна ультразвуковая «UNITRA» UNIMA OLSZTYN UM-4
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная ГОСТ 5556-81
Воронки делительные на 250 куб. см ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные ГОСТ 25336-82
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480, фирма «Buchi»
Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 куб. см ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 куб. см и 4000 куб. см ТС ТУ 92-891.029-91
Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма «Waters»
Насос диафрагменный FT.19, фирма «KNF Neu Laboport»
Предколонка хроматографическая стальная, Symmetry C 18, длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters»
Сито лабораторное с полотном из латуни или нержавеющей стали с размером ячеек 1 мм ГОСТ 3826-82 и ГОСТ 6613-86
Стаканы стеклянные термостойкие объемом 100 — 500 куб. см ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 куб. см и приемной конической колбой объемом 1000 куб. см
Фильтры бумажные «красная лента» ТУ 6-09-1678-86
Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма «Waters»
Шприц инъекционный однократного применения объемом 10 куб. см ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84)
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению определений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин, Диапак С и Диапак С8 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах Диапак Амин, Диапак С и Диапак С8, построение калибровочных кривых.
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.
7.1.2 Очистка ацетона
Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.
Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.
7.1.3 Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.
7.2. Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.
В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 500 куб. см ацетонитрила и 500 куб. см очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
7.2.2 Приготовление градуировочных растворов
7.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) — 1,0 мг/куб. см.
Взвешивают 50 мг Азоксистробина (ICIA 5504) в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.
7.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией геометрического изомера Азоксистробина (R 230310) — 1,0 мг/куб. см.
Взвешивают 50 мг R 230310 в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 2 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.
7.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 10,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см и помещают в ту же колбу объемом 100 куб. см, доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.
7.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 1,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор № 4 используется для хроматографического исследования и для построения калибровочной кривой.
7.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,5 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор № 5 используется для построения калибровочной кривой.
7.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,2 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор № 6 используется для построения калибровочной кривой.
7.2.2.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,1 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор № 7 используется для построения калибровочной кривой.
7.2.2.8. Стандартные растворы Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) с концентрацией 2,0, 1,0, 0,4 и 0,2 мкг/куб. см для внесения в образцы.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 2,0, 1,0, 0,4 и 0,2 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.
7.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0, 0,5, 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.4. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С8 для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на них
7.4.1 Подготовка концентрирующих патронов
Диапак С8 для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. При работе на патронах Диапак С8 используют очищенную воду.
Патрон Диапак С8 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 10 куб. см воды. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения
Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера
(R 230310) на концентрирующих патронах Диапак С8
Из стандартного раствора Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в ацетонитриле, содержащего по 1 мкг/куб. см каждого соединения, отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см воды, перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Исходный концентратор сначала обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:5, затем тремя порциями по 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Элюат после прохождения каждой порции упаривают досуха. Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие Азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310), полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на концентрирующих патронах Диапак С8 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.
7.5 Подготовка концентрирующих патронов
Диапак Амин и Диапак С для очистки экстрактов и проверка
хроматографического поведения Азоксистробина (ICIA 5504)
и его геометрического изомера (R 230310) на них
7.5.1 Подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин
и Диапак С для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.
Соединяют последовательно патроны Диапак Амин (вверху) и Диапак С (внизу), устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующие патроны промывают 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.5.2 Проверка хроматографического поведения
Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера
(R 230310) на концентрирующих патронах
Диапак Амин и Диапак С
Из стандартного раствора Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в ацетонитриле, содержащего по 1 мкг/куб. см каждого соединения, отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну, перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.
Исходный концентратор обмывают тремя порциями по 5 куб. см смеси гексана с этилацетатом 3:1 и вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310), полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на концентрирующих патронах Диапак Амин и Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.
7.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry С18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 — 4 ч.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» от 21.08.1979 № 2051-79, а также с ГОСТ 27853-88, ГОСТ 13341-77 «Свежие и свежемороженые овощи, картофель, бахчевые, фрукты, ягоды, грибы. Правила приемки и методы отбора проб».
Пробы клубней картофеля хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C.
9. Подготовка проб и выполнение измерений
9.1. Клубни картофеля
9.1.1 Экстракция и очистка полученного экстракта
Образец измельченных клубней картофеля массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем дополнительно на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через фильтр «красная лента» в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см с 5 г сухого хлористого натрия. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем дополнительно на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракты фильтруют и объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с хлористым натрием, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Затем содержимое колбы (без нерастворившейся соли) переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см и выдерживают 5 мин. Выделившуюся нижнюю водную фазу отбрасывают.
К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом 50 куб. см. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
9.1.2 Очистка экстракта фильтрованием
К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну, после чего фильтруют через фильтр «красная лента» в концентратор объемом 100 куб. см. Исходный концентратор обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 5 куб. см каждая, объединяют все смывы в концентраторе объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C.
9.1.3 Очистка экстракта на концентрирующих
патронах Диапак С8
Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора и помещая на 5 с в ультразвуковую ванну, прибавляют 9 куб. см воды, тщательно перемешивают и вносят на предварительно подготовленный патрон, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:5, вносят на патрон, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, вносят на патрон, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C и подвергают дальнейшей очистке на патронах Диапак С и Диапак Амин.
9.1.4 Очистка экстракта на концентрирующих
патронах Диапак С и Диапак Амин
Сухой остаток, полученный по п. 9.1.3, растворяют в 1 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана и вносят на предварительно подготовленные последовательно соединенные патроны Диапак Амин (вверху) и Диапак С (внизу). Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:3, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.
9.2. Условия хроматографирования
Хроматограф жидкостной Waters 515 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации 15311-02 или другой с аналогичными характеристиками.
Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм x 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters».
Предколонка стальная Symmetry С18, 20 мм x 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters».
Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 50:50.
Время удерживания Азоксистробина (ICIA 5504) — 12,98 — 13,65 мин., его геометрического изомера (R 230310) — 10,27 — 10,69 мин.
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
Чувствительность 0,003 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
10. Обработка результатов
Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Millenium 3.05.01.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание Азоксистробина рассчитывают по формуле:
S x A x V
пр
X = ------------- x P, 100 x S x m ст
X — содержание Азоксистробина или R 230310 в пробе, мг/кг;
S — высота (площадь) пика стандарта, мм; ст
S — высота (площадь) пика образца, мм; пр
A — концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г (куб. см);
P — содержание Азоксистробина или R 230310 в аналитическом стандарте, %.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 x |X - X | x 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг; 1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 x сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,
X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг; _
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг» <*>.
<*> 0,05 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг; _
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к
_ _ K = X' - X - C , к д
_ _ X', X, С - среднее арифметическое результатов параллельных определений
д
(признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле: _____________________
/ 2 2 K = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом
к
контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 x |X - X | x 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг; 1 2
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
14. Разработчики
Российский государственный аграрный университет МСХА им. К.А. Тимирязева.
Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов».