МУК 4.1.2764-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение метрибузина в биологических средах экспериментальных животных (почках, печени, головном мозге, семенниках, моче, кале) методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
Актуально на 01.11.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.2764-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение метрибузина в биологических средах экспериментальных животных (почках, печени, головном мозге, семенниках, моче, кале) методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания". МУК 4.1.2764-10. https://bukva.ai/docs/muk-4-1-2764-10
(утв. Роспотребнадзором 17.11.2010)
Примечание
Документ введен в действие с 17 декабря 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
17 ноября 2010 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТРИБУЗИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ (ПОЧКАХ, ПЕЧЕНИ, ГОЛОВНОМ МОЗГЕ, СЕМЕННИКАХ, МОЧЕ, КАЛЕ) МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2764-10
17 декабря 2010 года
1. Методические указания разработаны ФГУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора».
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).
Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций метрибузина в биологических средах экспериментальных животных в диапазонах 0,004 — 0,04 мг/кг (почки, печень, семенники, кал), 0,01 — 0,1 мг/кг (головной мозг) и 0,001 — 0,01 мг/куб. дм (моча).
4-амино-6-трет-бутил-4,5-дигидро-3-метилтио-1,2,4-триазин-5-он (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
Белое кристаллическое вещество со слабым характерным запахом. Температура плавления 126,2 °С. Плотность 1,28 (20 °С). Давление паров:
0,058 мПа (при 20 °С). Коэффициент распределения н-октанол/вода (при pH 5,5 и 20 °С): K log P = 1,6. Растворимость в органических растворителях при ow 20 °С (г/куб. дм): диметилформамид — 1780, циклогексанон — 1000, хлороформ
- 850, ацетон — 820, метанол — 450, дихлорметан — 340, бензол — 220, н-бутанол — 150, этанол — 190, толуол — 87, ксилол — 90, изопропанол — 77, гексан — 1,0. Растворимость в воде при 20 °С: 1,05 г/куб. дм.
Метрибузин при 20 °С стабилен в разбавленных кислотах и щелочах; DT 50 (37 °С) — 6,7 часа (pH 1,2); DT (70 °С) — 569 часов (pH 4); 47 дней (pH 50 7), 191 час (pH 9).
Подвержен быстрой деградации в воде на свету (DT — менее 1 дня). На 50 поверхности почвы при естественном облучении DT — 14 — 15 дней. 50
Метрибузин — избирательный системный гербицид класса 1,2,4-триазинона, ингибирует фотосинтез. В растения проникает через корни и листья.
Препараты на основе метрибузина могут представлять собой стандартные суспензии (с размером частиц более 2 мкм), а также наноформы, образующие водные системы с размером частиц менее 0,1 мкм.
1. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (куб. дм) | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Почки | от 0,004 до 0,008 вкл. | 100 | 4,5 | 13 | 15 |
| свыше 0,008 до 0,04 вкл. | 50 | 4,9 | 14 | 17 | |
| Печень | от 0,004 до 0,008 вкл. | 100 | 5,0 | 14 | 17 |
| свыше 0,008 до 0,04 вкл. | 50 | 5,2 | 15 | 19 | |
| Головной мозг | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 4,5 | 13 | 15 |
| Семенники | от 0,004 до 0,008 вкл. | 100 | 4,9 | 14 | 17 |
| свыше 0,008 до 0,04 вкл. | 50 | 4,8 | 13 | 15 | |
| Моча | от 0,001 до 0,01 вкл. | 100 | 4,9 | 14 | 17 |
| Кал | от 0,004 до 0,008 вкл. | 100 | 3,9 | 11 | 13 |
| свыше 0,008 до 0,04 вкл. | 50 | 4,0 | 11 | 13 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.
| Анализируемый | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | предел обнаружения, мг/кг (куб. дм) | диапазон определяемых концентраций, мг/кг | полнота извлечения вещества, % | стандартное отклонение, S, % | доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
| Почки | 0,004 | 0,004 — 0,04 | 79,8 | 5,5 | 2,9 |
| Печень | 0,004 | 0,004 — 0,04 | 81,3 | 5,0 | 2,7 |
| Головной мозг | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 81,7 | 4,2 | 2,2 |
| Семенники | 0,004 | 0,004 — 0,04 | 81,8 | 4,5 | 2,4 |
| Моча | 0,001 | 0,001 — 0,01 | 81,4 | 4,9 | 2,6 |
| Кал | 0,004 | 0,004 — 0,04 | 83,1 | 3,2 | 1,7 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным (ТИД) и электронозахватным (ЭЗД) детекторами после экстракции из анализируемых проб биологических сред ацетонитрилом, последовательной очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, окислением марганцовокислым калием в щелочной среде, затем на концентрирующих патронах Sep Pak Silica и С18 Sep Pak.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный электронозахватным и термоионным детектором с пределом детектирования соответственно по линдану -14 3,5 — 10 г/с и азоту в азобензоле -14
3,0 х 10 гР/с предназначенный для работы с капиллярной колонкой Номер Госреестра 14516-08
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные 2-100-2, 2-500-2 ГОСТ 1770-74
Микрошприц SGE-Cromatec вместимостью 10 куб. мм Номер Госреестра 39206-08
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100, 250 и 500 куб. см ГОСТ 1770-74
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Метрибузин, государственный стандартный образец с содержанием действующего вещества 99,7%, относительная погрешность аттестованного значения +/- 0,3% ГСО 7713-99
Азот газообразный нулевой, марка А
(99,999%), в баллонах ТУ 6-21-39-96 Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ 6-09-3534-87
Вода деионизованная ГОСТ 6709-72
н-Гексан, для ВЭЖХ ТУ 6-09-06-657-84
Калий гидроокись (гидроксид калия), осч ГОСТ 24363-80
Калий марганцовокислый (перманганат калия), хч ГОСТ 20490-75
Калий углекислый (карбонат калия, поташ), хч, прокаленный ГОСТ 4221-76
Кальций хлористый (хлорид кальция), хч,
насыщенный водный раствор ГОСТ 450-77
Кислота серная концентрированная, хч ГОСТ 4204-77
Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794-80
Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995-77
Натрий сернокислый (сульфат натрия) безводный, хч ГОСТ 4166-76
Натрий углекислый (карбонат натрия), хч ГОСТ 83-79
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77
Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора) ТУ 6-09-4173-85
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), хч ГОСТ 22300-76
Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами) ГОСТ 25336-82
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные или фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ ТУ 2642-001-05015242-07
Воронки делительные вместимостью 250 и 1000 куб. см ГОСТ 9737-93
Воронки стеклянные конусные типа В-36-80 ХС и В-56-80 ХС ГОСТ 25336-82
Генератор водорода, исполнение 6.140 (СКБ «Хроматэк», Россия)
Груша резиновая ТУ 9398-05-0576-9082-2003
Колбы конические (плоскодонные) вместимостью 100 — 150, 200 — 250 и 500 куб. см ГОСТ 23932-90
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100, 150 и 250 куб. см ГОСТ 9737-93
Компрессор (СКБ «Хроматэк», Россия)
Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 25336-82
Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см ГОСТ 25336-82
Патроны для твердофазной экстракции С18 Sep Pak, Classik (Waters, США), масса сорбента 360 мг
Патроны для твердофазной экстракции Sep Pak Silica (Waters, США), объем сорбента 2 куб. см
Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок 30
Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария
Сосуды для гомогенизации тканей стеклянные с плунжером вместимостью 15 куб. см типа BBI-8540802 (фирма «Sartorius AG», Германия)
Стеклянные или полипропиленовые емкости вместимостью 100 куб. см с герметичной крышкой (для хранения биопроб)
Установка для перегонки растворителей с дефлегматором ГОСТ 9737-93 (ИСО 641-75)
Холодильник с морозильной камерой бытовой
Хроматографическая колонка DB-5ms длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм
Хроматографическая колонка капиллярная DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм
Шприцы медицинские с разъемом Льюера вместимостью 5 и 10 куб. см
Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на газовом хроматографе.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.
4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением», ПБ 03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускают специалиста, имеющего квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоившего данную методику и подтвердившего экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak Silica и С18 Sep Pak.
7.1. Очистка органических растворителей
7.1.1 Ацетонитрил
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).
7.1.2 Гексан
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.1.3 Хлористый метилен и этилацетат
Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%
Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в деионизованной воде, доводят водой до метки, перемешивают.
Хлористый метилен (этилацетат) промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.
7.2. Приготовление раствора калия гидроксида с молярной концентрацией 2 моль/куб. дм (2 М раствор)
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают (56 +/- 0,1) г гидроксида калия, растворяют в 250 — 300 куб. см деионизованной воды, доводят водой до метки, перемешивают.
7.3. Приготовление раствора марганцовокислого калия с массовой долей 0,1%
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают (0,5 +/- 0,01) г марганцовокислого калия, доводят водой до метки, перемешивают. Раствор хранят в темном месте.
7.4. Приготовление гексана, насыщенного ацетонитрилом
В коническую колбу вместимостью 500 куб. см с притертой пробкой помещают 250 куб. см гексана, вносят (10 +/- 1) куб. см ацетонитрила, перемешивают в течение 5 мин. Хранят в темном месте.
7.5. Приготовление смесей гексан — этилацетат для очистки экстракта на патроне Sep Pak Silica
7.5.1. Смесь гексан — этилацетат (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 70 куб. см гексана и 30 куб. см этилацетата, перемешивают.
7.5.2. Смесь гексан — этилацетат (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 90 куб. см гексана и 10 куб. см этилацетата, перемешивают.
7.5.3. Смесь гексан — этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 80 куб. см гексана и 20 куб. см этилацетата, перемешивают.
7.6 Приготовление смеси ацетонитрил — вода
(объемное соотношение 3:7) для очистки экстракта
на патроне С18 Sep Pak
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 30 куб. см ацетонитрила и 70 куб. см деионизованной воды, перемешивают.
7.7. Подготовка концентрирующего патрона Sep Pak Silica
Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума.
Концентрирующий патрон промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, последовательно 3 куб. см метанола, 5 куб. см смеси гексан — этилацетат (7:3, по объему), 5 куб. см гексана со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 — 2 капли в секунду. Патрон готовят непосредственно перед использованием. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.
7.8. Подготовка концентрирующего патрона С18 Sep Pak
Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, 5 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 — 2 капли в секунду, затем 10 куб. см деионизованной воды.
Патрон готовят непосредственно перед использованием.
7.9. Приготовление градуировочных растворов
и растворов внесения
7.9.1. Исходный раствор метрибузина для градуировки (массовая концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г метрибузина, растворяют в 50 — 70 куб. см этилацетата, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 2-х месяцев.
Градуировочные растворы № 2 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.
7.9.2. Раствор № 1 метрибузина для градуировки (массовая концентрация 10 мкг/куб. см).
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора метрибузина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.9.1), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.
Раствор хранится в холодильнике не более месяца.
7.9.3. Рабочие растворы № 2 — 5 метрибузина для градуировки и внесения (массовая концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см).
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10 куб. см раствора № 1 метрибузина с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), доводят до метки этилацетатом, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией метрибузина 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в холодильнике не более месяца.
Эти растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено».
7.10. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площадей пиков (мВ х с) от концентрации метрибузина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5 (п. 7.9.3).
В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков (в мВ х с) метрибузина.
По полученным данным строят градуировочную характеристику.
Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значение площадей отличается более чем на 11% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.
8. Отбор и хранение проб
Пробы органов, тканей, кала и мочи отбирают в лабораторных условиях, герметично упаковывают в полипропиленовые или стеклянные емкости с притертыми крышками, замораживают и хранят в морозильной камере при температуре ниже -18 °С.
Непосредственно перед анализом образцы органов, тканей, а также кала тщательно измельчают с использованием гомогенизатора.
9. Выполнение определения
9.1. Экстракция
9.1.1 Печень, почки, семенники, головной мозг, кал
Образец печени, почек, семенников и кала массой 5 г, головного мозга массой 2 г гомогенизируют в сосуде для гомогенизации с порцией ацетонитрила объемом 5 — 7 куб. см. Гомогенизированный образец с порциями ацетонитрила по 10 — 15 куб. см переносят в коническую колбу вместимостью 100 — 150 куб. см (общий объем ацетонитрила с учетом растворителя, взятого для гомогенизации и обмыва сосуда для гомогенизации, — 70 куб. см), дополнительно тщательно перемешивают и помещают на 1 ч в холодильник (4 — 6 °С). Затем надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр, помещенный в конусную воронку, в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см ацетонитрила, предварительно ополоснув растворителем колбу, в которой находилась проба, объединяя фильтрат с основной порцией в делительной воронке. Затем в делительную воронку вносят 20 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу на 100 — 150 куб. см, верхнюю гексановую промывку отбрасывают. Ацетонитрильный раствор возвращают в делительную воронку и операцию промывки повторяют новой порцией гексана, насыщенного ацетонитрилом, объемом 20 куб. см. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, вносят в нее 10 куб. см деионизованной воды, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 35 — 40 °С до объема около 20 куб. см, внимательно следя за процессом, не допуская переброса жидкости при вспенивании, и очищают по п. 9.2.
9.1.2 Моча
Пробу мочи объемом 20 куб. см помещают в коническую колбу вместимостью 100 — 150 куб. см, вносят 50 куб. см ацетонитрила, перемешивают и помещают на 1 час в холодильник (4 — 6 °С). Затем раствор осторожно переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, после полного расслаивания нижний водный слой отделяют и отбрасывают. В делительную воронку вносят 10 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу на 100 — 150 куб. см, верхнюю гексановую промывку отбрасывают. Ацетонитрильный раствор возвращают в делительную воронку и операцию промывки повторяют новой порцией гексана, насыщенного ацетонитрилом, объемом 10 куб. см. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, вносят в нее 10 куб. см деионизованной воды, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 35 — 40 °С до объема около 20 куб. см и очищают по п. 9.2.
9.2. Очистка экстракта
9.2.1 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и окислением
Остаток в колбе, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2, с помощью 80 куб. см деионизованной воды переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, колбу дополнительно обмывают 20 куб. см воды, которую также переносят в воронку. Вносят в воронку 10 куб. см насыщенного раствора натрия хлористого, перемешивают и помещают на 1 час в холодильник или на 15 мин. в морозильную камеру. Затем в воронку вносят 2 куб. см 2 М раствора калия гидроксида и 50 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в новую делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Экстракцию метрибузина повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 20 куб. см. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 — 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.
В делительную воронку, содержащую объединенные дихлорметановые экстракты, вносят 10 куб. см 2 М раствора калия гидроксида и 5 куб. см 0,1%-ного раствора марганцовокислого калия (при анализе печени объем раствора марганцовокислого калия увеличивают до 6 куб. см), интенсивно встряхивают в течение 3-х мин. Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 — 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой (около 1 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусную воронку диаметром 56 мм. Сульфат натрия на фильтре промывают дополнительной порцией дихлорметана объемом 10 куб. см. Верхний водный слой отбрасывают.
Объединенные экстракт и промывку, пропущенные через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °С. Дальнейшую очистку на концентрирующем патроне Sep Pak Silica проводят по п. 9.2.2.
9.2.2 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Sep Pak Silica
Остаток в колбе, полученный после упаривания по п. 9.2.1, растворяют в 5 куб. см гексана, помещая на 30 — 40 с на ультразвуковую баню, и вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Sep Pak Silica (подготовленный по п. 7.7) со скоростью пропускания раствора 1 — 2 капли в секунду. Колбу ополаскивают 5 куб. см гексана, который также наносят на патрон. После нанесения пробы патрон промывают 3 куб. см смеси гексан — этилацетат (9:1, по объему), элюат отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 10 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу, упаривают при температуре не выше 35 °С досуха. Остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, вносят 9 куб. см деионизованной воды, помещают на ультразвуковую баню на 45 — 60 с. Дальнейшую очистку на концентрирующем патроне С18 Sep Pak проводят по п. 9.2.3.
9.2.3 Очистка экстракта на концентрирующем патроне С18 Sep Pak
Раствор в колбе, полученный по п. 9.2.2, вносят с помощью медицинского шприца или разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.8, со скоростью пропускания раствора 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Патрон дополнительно промывают (скорость 2 капли в секунду) 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 3:7 (по объему), также собирая элюат в круглодонную колбу. Объединенный элюат упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, для полного удаления следов влаги вносят в колбу порцию ацетонитрила (5 — 7 куб. см) и вновь упаривают.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата и анализируют содержание метрибузина по п. п. 9.3.1 или 9.3.2.
9.3. Условия хроматографирования
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
9.3.1 Хроматограф газовый, снабженный термоионным детектором.
Колонка капиллярная DB-5ms длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм.
Температура детектора: 350 °С;
Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 100 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 220 °С, выдержка 5 мин., нагрев колонки со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 270 °С (выдержка 2 мин.).
Скорость воздуха 200 куб. см/мин.; водорода 10,5 куб. см/мин.; газа 3 (азот) 30 куб. см/мин.
Скорость газа 1 (азот): 35,544 см/с, давление 120 кПа, поток 1,393 куб. см/мин., деление потока 1:5.
Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.
Ориентировочное время удерживания метрибузина: ~ 12,5 мин.
9.3.2 Газовый хроматограф, снабженный электронозахватным детектором.
Колонка капиллярная DB-1701 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.
Температура детектора: 300 °С;
Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 80 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 230 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 270 °С (выдержка 1 мин.).
Скорость газа 1 (азот): 35,971 куб. см/с, давление 70 кПа, поток 2,015 куб. см/мин.
Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.
Ориентировочное время выхода метрибузина: ~ 16,9 мин.
Линейный диапазон детектирования: 0,01 — 0,1 нг.
Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества (в мВ х с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию метрибузина в хроматографируемом растворе.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с массовой концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют этилацетатом не более чем в 50 раз. При расчете содержания метрибузина учитывают разбавление.
10. Обработка результатов анализа
Содержание метрибузина в пробе (X, мг/кг, мг/куб. дм) рассчитывают по формуле:
C х V
C — концентрация метрибузина, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса (объем) анализируемого образца, г (куб. см).
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг (куб. дм);
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг (куб. дм) при вероятности P = 0,95,
где:
_
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг (куб. дм); ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);
дельта х X
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание метрибузина в пробе печени, почек, семенников, кала менее 0,004 мг/кг; головного мозга — менее 0,01 мг/кг; мочи — менее 0,001 мг/куб. дм» <*>.
<*> 0,004 мг/кг — предел обнаружения в печени, почках, семенниках, кале; 0,01 мг/кг — головном мозге; 0,001 мг/куб. дм — моче.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C >= ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания
компонента в образце с добавкой), мг/кг (куб. дм), при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);
дельта х X
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном определяемых
концентраций, табл. 1), %.
Контрольный параметр процедуры (К ) рассчитывают по формуле: к
_ _ К = X' - X - C , к д _ _ где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг (куб. дм);
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг
1 2
(куб. дм); R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном определяемых
концентраций, табл. 1), %.
14. Разработчики
ФГУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.