МУК 4.1.2673-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дитианона в ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

2 августа 2010 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИТИАНОНА В БОТВЕ И КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2673-10

1 октября 2010 года

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящий документ устанавливает метод измерения массовой концентрации дитианона в ботве и клубнях картофеля в диапазоне концентраций 0,025 — 0,25 мг/кг.

Дитианон.

Название по номенклатуре ИЮПАК: 5,10-дигидро-5,10-диоксо-нафто[2,3-b]-1,4-дитиин-2,3-дикарбонитрил.

Структурная формула (не приводится).

Эмпирическая формула: C H № O S . 14 4 2 2 2

Молекулярная масса: 296,3.

Химически чистое вещество: коричневый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 225 °C. -6

    Давление пара при 25 °C: 2,7 x 10   мПа.
    K   log P = 3,2.

 ow

Растворимость в воде (20 °C, pH 7) — 0,14 мг/л; хлороформе — 12 г/л; ацетоне — 10 г/л; бензоле — 8 г/л; ацетонитриле — 5 г/л. Умеренно растворим в метаноле и дихлорметане. Разлагается как в щелочной среде, так и под действием концентрированных кислот, а также при длительном нагревании; ДТ 50 12,2 часа (pH 7, 25 °C). Чувствителен к воздействию солнечного света. ДТ 50 составляет 19 часов для водного раствора с концентрацией 0,1 мг/мл.

    Краткая  токсикологическая  характеристика. Острая оральная токсичность
ЛД    678  мг/кг  для  крыс и 115 мг/кг для морских свинок. Обладает слабым

50 раздражающим действием на глаза и кожу. При подкожном введении ЛД для 50 крыс составляет > 2000 мг/кг. Ингаляционная токсичность для крыс — 2,1 мг/л воздуха (период наблюдения 4 часа).

Гигиенические нормативы: МДУ для картофеля не установлен.

Область применения препарата: лиственный фунгицид защитного и отчасти целебного действия. Используется для контроля многих заболеваний листьев, включая паршу на фруктовых деревьях; ржавчину и скручивание листьев у абрикосов и персиков, образование пятен на листьях смородины и т.д. Эффективен против возбудителей болезней Stigmana carpophila, Coccomyces hiemalis, manlia, Didimella applanata, Mycosphaerella fragariae и др.

1. Методика определения дитианона в ботве и клубнях картофеля методом ВЭЖХ

1.1. Основные положения

1.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении дитианона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов ботвы или клубней ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз и очистки ацетонитрильного экстракта силикагелем с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния.

Учитывая чувствительность препарата к нагреванию и воздействию УФ-лучей для пробоподготовки выбран экспрессный метод, исключающий нагревание образца или его длительные экспозиции на свету.

1.1.2 Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

ДЛЯ n = 20, P = 0,95

1.1.3 Избирательность метода

Избирательность метода определения дитианона достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

2.1. Реактивы и материалы

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-200нм», сорт 5 или х.ч. ТУ 6-09-3534-87

Натрий уксуснокислый, ч. ГОСТ 199-68

Уксусная кислота, ледяная                                   ГОСТ 61-69
Магний сернокислый 7-водный, х.ч.                           ГОСТ 4523-67

Силикагель, Merck 1.09385.1000

Бумажные фильтры «красная лента» ТУ 6.091678-86

Вода бидистиллированная, деионизированная ГОСТ 6709-79

Дитианон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,6%, BAS 216F

Кислота ортофосфорная, 0,005 М водный раствор, х.ч. ГОСТ 6552-80

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила

и 0,005 М H PO  в соотношении 50:50
           3  4

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

2.2. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или «Breeze» фирмы «Waters» или аналогичный

Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)

Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные ГОСТ 24104-2001

Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2 ТУ 5.375-4261-76

Шприц медицинский с разъемом Льюера ГОСТ 22090

Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см ГОСТ 22292-74

Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см

Аппарат для встряхивания (Chirana)

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2.3. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 «Картофель свежий для переработки на продукты питания». Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остатков в урожае хранят в морозильной камере при -18 °C.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40 °C до объема 1 куб. см и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают в соответствии с типовыми методиками.

2.4.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 часа.

2.4.3 Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Точную навеску дитианона (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,025, 0,050, 0,100, 0,200 и 0,250 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы. Основной и рабочие градуировочные растворы используют свежеприготовленными. При изучении полноты извлечения дитианона из картофеля используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.4.4 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация дитианона в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дитианона в градуировочном растворе.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

                  |C - C |
                        к

                      -------- x 100 <= лямбда      ,
                         C                    контр.

где:

C — аттестованное значение массовой концентрации бифентрина в градуировочном растворе;

C — результат контрольного измерения массовой концентрации бифентрина к в градуировочном растворе;

лямбда — норматив контроля градуировочного коэффициента, %. контр. лямбда = 10% при P = 0,95). контр.

2.4.5 Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5. Проведение определения

2.5.1 Определение дитианона в клубнях картофеля

10 г измельченных клубней картофеля помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 2 куб. см воды, 8 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин. и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 мин. Измеряют объем супернатанта и количественно переносят его в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Прибавляют силикагель и безводный сульфат магния из расчета 50 мг силикагеля и 150 мг сульфата магния на 1 куб. см супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин. и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 мин. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем до метки 0,005 М фосфорной кислотой. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

2.5.2 Определение дитианона в ботве картофеля

10 г измельченной ботвы картофеля помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 10 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Дальнейшую обработку пробы производят по п. 2.5.1.

2.5.3 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 235 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм. Время удерживания дитианона составляет 6,3 +/- 0,1 мин.

3. Обработка результатов анализа

Содержание дитианона в образцах клубней и ботвы картофеля (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                             S  x C x V
                              2

X = ----------, S x P 1

где:

S — площадь пика дитианона в стандартном растворе (мВ x сек.);

 1

S — площадь пика дитианона в анализируемой пробе (мВ x сек.); 2

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P — навеска анализируемого образца, г;

C — концентрация стандартного раствора дитианона, мкг/куб. см.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дитианона 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

                       2 x |X  - X | x 100
                             1    2
                       ------------------- <= r,                        (1)
                            (X  + X )
                              1    2

    X , X  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2

r — значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ). r

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

           _

(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,

где: _

X — среднее арифметическое результатов определений, признанных

ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;

ДЕЛЬТА = дельта x X / 100,

дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,005 мг/кг <*>).»

<*> 0,005 мг/кг — предел обнаружения.

6. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C должна удовлетворять условию: д

                        д         л,X         л,X'

    где  +/-  ДЕЛЬТА     (+/-  ДЕЛЬТА    )  -  характеристика   погрешности
                    л,X              л,X'
(абсолютная     погрешность)     результатов    анализа,    соответствующая
содержанию  компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания

компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг, при этом:

ДЕЛЬТА = +/- 0,84 ДЕЛЬТА, л

где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

ДЕЛЬТА = дельта x X / 100,

дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к

                             K  = X'- X - C ,
                              к            д

    где  X',  X,  C   -  среднее  арифметическое  результатов  параллельных

               д

определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

                          _____________________

                             /     2            2
                       K = \/ДЕЛЬТА     + ДЕЛЬТА   .
                                   л,X'         л,X

    Проводят  сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом

                                                        к

контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

|K | <= K, (2) к

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

                       2 x |X  - X | x 100
                             1    2
                       ------------------- <= R,                        (3)
                            (X  + X )
                              1    2

где:

    X , X  - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
     1   2

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

7. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

8. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

9. Разработчики

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.