МУК 4.1.2595-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имидаклоприда в томатном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 26.03.2010)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 26 марта 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
26 марта 2010 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМИДАКЛОПРИДА В ТОМАТНОМ СОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2595-10
26 марта 2010 года
1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 3 от 03.12.2009).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 26 марта 2010 г.
4. Введены в действие с 26 марта 2010 г.
Настоящие методические указания устанавливают метод измерения массовой концентрации имидаклоприда в томатном соке в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг.
1. Вводная часть
Действующее вещество: имидаклоприд.
Структурная формула (не приводится)
Брутто формула: C H ClN O . 9 10 5 2
1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илидеамин(IUPAC).
1-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин (CA).
Химически чистый имидаклоприд представляет собой бесцветные кристаллы со слабым характерным запахом. -7
Температура плавления 144 °C. Давление паров 4 x 10 мРа (20 °C), -7
9 x 10 мРа (25 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K lg P = 0,57
ow
(21 °C).
Растворимость (г/л) при 20 °C: в воде — 0,61; дихлорметане — 55; изопропаноле — 1,2; толуоле — 0,68; н-гексане < 0,1.
Стабилен к гидролизу при pH 5 — 11.
Острая пероральная токсичность LD для крыс — 450 мг/кг. Острая 50 дермальная токсичность LD (24 часа) для крыс — более 5000 мг/кг. Не 50 ирритант для глаз и кожи (кролики). Острая ингаляционная токсичность LC 50
(4 часа) для крыс - более 5323 мг/куб. м, 69 мг/куб. м воздуха (аэрозоль). LC (96 часов) для рыб - 211 (237) мг/л.
50
Имидаклоприд практически не токсичен для птиц, пчел, дождевых червей, водорослей.
Мутагенной и тератогенной активности в стандартных тестах не обнаружено.
Группа токсичности по ЕРА — II, ВОЗ — II.
Область применения: Имидаклоприд — системный инсектицид нервно-паралитического действия группы неоникотиноидов. Эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Может использоваться для обработки как почвы, так и надземных органов растений.
Гигиенические нормативы: МДУ имидаклоприда в томатах — 0,1 мг/кг.
2. Методика определения имидаклоприда в томатном соке методом ВЭЖХ
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Методика основана на определении имидаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.
2.1.2 Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА
| Объект анализа | Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, % | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Томатный сок | 0,01 — 0,1 | 50 | 4,6 | 12,7 | 14,8 |
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ,
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ ПОЛНОГО
ДИАПАЗОНА КОНЦЕНТРАЦИЙ (n = 16) ПРИВЕДЕНЫ В ТАБЛИЦЕ 2
| Объект анализа | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Сок яблок | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 83,3 | 3,28 | 3,42 |
2.1.3 Избирательность метода
Избирательность метода определения имидаклоприда достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч. ТУ 6-09-3534-87 Бумажные фильтры "красная лента" ТУ 6.091678-86
Вода бидистиллированная, деионизированная ГОСТ 6709-79
Дихлорметан, х.ч. ТУ 6-09-3716-80
Имидаклоприд, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (Sigma-Aldrich)
Натрий сернокислый безводный, свежепрокаленный, ч. ГОСТ 4166-76
Натрия гидроксид, х.ч. ГОСТ 4328-77
Натрия хлорид, ч.д.а. ГОСТ 4233-77
н-Гексан, свежеперегнанный, х.ч. ТУ 2631-003-05807999-98
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил -
0,005М H PO (22:78, по объему)
3 4
Силикагель 60 для колоночной хроматографии (0,040 — 0,063 мм) (Merck, Германия)
Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а. ГОСТ 22300-76
Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (50:50, по объему)
Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (10:90, по объему)
Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.
2.3. Приборы и посуда
Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником
Колонка Symmetry С-18, (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters)
Предколонка Waters Symmetry C-18
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Ванна ультразвуковая «Серьга» ТУ 3.836.008
Ротационный испаритель вакуумный Buchi R-205
pH-метр универсальный ЭВ-74 ГОСТ 22261-76
Насос водоструйный МРТУ 42861-64 Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС ГОСТ 10384-72 Колбы круглодонные на шлифах КШ10 и КШ250 29-32 ТС ГОСТ 10384-72
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Воронки делительные ВД-3-500 ГОСТ 8613-75
Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см ГОСТ 20292-74 Колонки стеклянные (25 x 1) см
Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2.4. Отбор и хранение проб
Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Требования при заготовке, поставке и реализации». Пробы томатного сока хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 2 месяцев, в холодильнике при 0 — 4 °C в герметичной упаковке не более недели.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °C до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с типовыми методиками.
2.5.2 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку (Symmetry C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.
2.5.3 Приготовление растворов
Для приготовления 1М раствора NaOH 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см, растворяют при перемешивании в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки. Для приготовления 0,025М раствора NaOH 25 куб. см 1М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005М H PO в 3 4
соотношении 22:78 по объему, используя мерные цилиндры.
Для приготовления 2М раствора ортофосфорной кислоты 200 г 98%-ной (или 225 г 87%-ной) кристаллической H PO помещают в мерную колбу объемом 3 4 1 куб. дм, растворяют в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0,005М раствора ортофосфорной кислоты 2,5 мл 2М раствора H PO вносят в мерную колбу на 1 л 3 4
и доводят до метки деионизированным бидистиллятом.
Для приготовления элюента № 1 в колбе на 1000 куб. см смешивают 500 куб. см н-гексана и 500 куб. см этилацетата. Для приготовления элюента № 2 в колбе на 1000 куб. см смешивают 100 куб. см н-гексана и 900 куб. см этил-ацетата.
2.5.3.1 Приготовление стандартного и градуировочных растворов
Берут точную навеску имидаклоприда (50 мг), переносят в мерную колбу на
100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки.
(Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/ куб. см). Градуировочные
растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом
последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы
(смесь ацетонитрил: 0,005М H PO (22:78, по объему).
3 4
Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.
При изучении полноты извлечения имидаклоприда используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
2.5.4 Установление градуировочной характеристики
Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация имидаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе (мкг/куб. см).
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
|C - C | x 100 <= лямбда
к контр.
------------------------------, C
C — аттестованное значение массовой концентрации бифентрина в градуировочном растворе;
C — результат контрольного измерения массовой концентрации к бифентрина в градуировочном растворе;
лямбда — норматив контроля градуировочного коэффициента, %. контр. (лямбда = 8% при P = 0,95). контр.
2.5.5 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан — этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 куб. см элюента № 2 и 30 куб. см элюента № 1 со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
2.5.6 Проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонке с силикагелем
В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °C), остаток растворяют в 5 куб. см элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента № 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 120 куб. см элюента № 1, которые отбрасывают, затем 100 куб. см элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.6.3.
Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.3. Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.
Примечание: параметры удерживания имидаклоприда и сопутствующих коэкстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.
2.5.7 Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.
2.6. Проведение определения
2.6.1 Извлечение имидаклоприда из проб томатного сока
Навеску томатного сока (20 г) в мерном цилиндре доводят до 100 куб. см дистиллированной водой и помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см. В воронку добавляют 30 куб. см гексана, встряхивая делительную воронку в течение 1 — 2 минут (верхний органический слой отбрасывают). Промывку гексаном повторяют дважды. Водную фазу экстрагируют трижды дихлорметаном порциями по 30 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 — 3 мин. и собирая нижний органический слой <*>. Объединенный дихлорметановый экстракт промывают в делительной воронке дважды 0,025М раствором NaOH порциями по 25 куб. см, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 мл хлористого метилена. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.2.
<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном — небольшое количество (до 5 куб. см) этилового спирта, а на стадии переэкстракции — насыщенный раствор хлорида натрия (15 — 20 куб. см).
Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.
2.6.2 Очистка экстракта на колонке с силикагелем
Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенного по п. 2.6.2 экстракта, количественно переносят двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 70 куб. см элюента № 1. Элюат отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 80 куб. см элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 куб. см. Раствор выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.3 Условия хроматографирования
Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы Waters с УФ детектором (Waters 2487). Рабочая длина волны 268 нм. Предколонка Sun Fire для защиты аналитической колонки. Колонка Sun Fire (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA). Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005М H PO в соотношении 22:78. 3 4
Скорость потока 1 куб. см/мин. Объем вводимой пробы 20 куб. мм.
Время удерживания имидаклоприда 12,1 +/- 0,2 мин.
Линейный диапазон детектирования 0,1 — 1,0 мкг/куб. см.
2.6.4 Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание имидаклоприда в образцах воды, почвы или растительных материалов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
S x C x V
2
S — площадь пика имидаклоприда в стандартном растворе, мм; 1
S — площадь пика имидаклоприда в анализируемой пробе, мм; 2
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;
P — навеска анализируемого образца, г;
C — концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/куб. см.
Содержание остаточных количеств имидаклоприда в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор имидаклоприда 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придела повторяемости (1):
2 x |X - X | x 100
1 2
(X + X )
1 2
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг; 1 2
r — значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ). r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
4. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,
X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг <*>).»
<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения.
5. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой), мг/кг, при этом: ДЕЛЬТА = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,
л
где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры (К ) рассчитывают по формуле: к
К = X' - X - C , к д где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 3) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
5.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 x |X - X | x 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг; 1 2 R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
6. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.
7. Требования к квалификации оператора
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.