МУК 4.1.2550-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств глифосата в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
Актуально на 01.11.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.2550-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств глифосата в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания". МУК 4.1.2550-09. https://bukva.ai/docs/muk-4-1-2550-09
(утв. Роспотребнадзором 09.09.2009)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 1 декабря 2009 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
9 сентября 2009 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ГЛИФОСАТА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2550-09
1 декабря 2009 года
1. Разработаны ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 июня 2009 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 сентября 2009 г.
4. Введены в действие с 1 декабря 2009 г.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации глифосата в семенах рапса в диапазоне 0,15 — 1,5 мг/кг и в масле рапса в диапазоне 0,10 — 1,0 мг/кг.
Название вещества по ИСО: глифосат.
Название вещества по ИЮПАК: N-(фосфонометил)-глицин.
O
||
Белый порошок без запаха. Температура плавления: 189,5 +/- 0,5 °С. -2
Давление паров при 25 °С: 1,31 х 10 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P < -3,2 (рН 2 - 5, 20 °С). Хорошо растворим в воде
ow
(11,6 г/куб. дм) и практически нерастворим в органических растворителях (ацетон, этанол, ксилол).
Вещество стабильно при нормальных условиях хранения, не гидролизуется в водных растворах при рН 3 — 9.
Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс и мышей составляет соответственно 5600 и 11300
50
мг/кг. Острая дермальная токсичность (LD ) для крыс — 5000 мг/кг; острая 50 ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — > 4,98 мг/куб. дм воздуха 50
(4 ч). LC для рыб > 1000 мг/куб. дм, LC для дафний - 780 мг/куб. дм,
50 50
LC для водорослей - 1,2 - 42 мг/куб. дм.
50
Глифосат малотоксичен для человека, животных, пчел и птиц, не обладает побочными токсическими эффектами.
В России установлены следующие гигиенические нормативы.
ДСД — 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в семенах рапса — 0,3 мг/кг, в масле — 0,1 мг/кг.
Область применения препарата. Глифосат — системный гербицид сплошного действия из группы ингибиторов биосинтеза ароматических аминокислот. Применяется для уничтожения злаковых и широколистных сорняков, в том числе с глубокоукореняющейся корневой системой, в посевах сельскохозяйственных культур, в садах и виноградниках, на пастбищах, откосах оросительных и осушительных каналов, промышленных территориях, а также для борьбы с кустарниками в лесных насаждениях. Помимо этого глифосат обладает способностью вызывать десикацию ряда культур, таких как подсолнечник, гречиха, соя и др.
В России глифосат применяется в качестве довсходового или допосевного гербицида на посевах сельскохозяйственных культур, а также для десикации зерновых культур, льна-долгунца, гороха, подсолнечника и сои с нормой расхода до 1,44 кг д.в. на га.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, Р = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена | от 0,15 до 1,0 вкл. | 25 | 3,1 | 8,7 | 13,4 |
| Масло | от 0,1 до 1,0 вкл. | 25 | 3,2 | 9,0 | 13,9 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
| Анализируемый | Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
| Семена | 0,15 | 0,15 — 1,5 | 81,2 | 5,1 | +/- 4,7 |
| Масло | 0,10 | 0,10 — 1,0 | 82,0 | 5,4 | +/- 5,0 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении глифосата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектором. Контроль глифосата в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из семян и масла рапса подкисленной водой, очистки экстракта хлороформом и на ионообменных смолах Дауэкс 1х8 и Дауэкс 50Wх2, дериватизации глифосата с помощью 9-флуоренилметилхлорформиата в щелочной среде.
Количественное определение глифосата проводится методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора колонки, состава подвижной фазы и условий хроматографирования.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Хроматограф жидкостной фирмы Altex, мод. 322
(США) с флуоресцентным детектором Фирмы Номер Госреестра Shimadzu, мод. RF-5301 (Япония) 19419-05
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 7328
Иономер универсальный ЭВ-74 ГОСТ 22261-76
Колбы мерные вместимостью 100, 1000 куб. см ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2 класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 куб. см ГОСТ 29227
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 5 и 10 куб. см ГОСТ 1770
25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Глифосат, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,8% (Monsanto, США)
Ацетонитрил, ч ТУ-6-09-3534-82 Вода дистиллированная деионизованная ГОСТ 7602-72
Кислота ортофосфорная, хч ГОСТ 6552-86
Кислота хлороводородная, хч ГОСТ 3118-77
Калий фосфорнокислый однозамещенный, хч ГОСТ 4198-75
Натрия гидроксид, хч ГОСТ 4328-77
Натрий тетраборнокислый, хч ГОСТ 4199-76
Эфир диэтиловый, хч ГОСТ 6262-79
9-флуоренилметилхлорформиат (Sigma-Aldrich, Германия)
Анионообменная смола Дауэкс 1х8 _ (100 — 200 меш)/Cl — форма/(Serva, Германия)
Катионообменная смола Дауэкс 50Wх2 +
(100 — 200 меш)/H — форма/(Serva, Германия)
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78 Вакуумный водоструйный насос ГОСТ 10696-75
Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Co. (США)
Воронка делительная вместимостью 250 куб. см ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30 — 37 мм ГОСТ 25336
Дефлегматор елочный ГОСТ 9737
Колба Бунзена вместимостью 500 куб. см ГОСТ 5614
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 куб. см ГОСТ 9737
Колбы плоскодонные вместимостью 250 куб. см
Колонка хроматографическая стеклянная (10 х 250 мм)
Колонка хроматографическая стальная для ВЭЖХ (4 х 150 мм), заполненная Диасорб 130-NH 7 мкм 2
(ЗАО БиоХимМак СТ, РФ) ТУ 4215-001-05451931-94 Мельница электрическая лабораторная ТУ 46-22-236-79
Микрошприцы вместимостью 100 куб. мм (Hamilton, США)
Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 10696
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или
ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi (Швейцария) ТУ 25-11-917-74
Стаканы химические вместимостью 500 и 2000 куб. см ГОСТ 25336
Установка для перегонки растворителей
Фильтры бумажные «красная лента», обеззоленные ТУ 6-09-2678-77 или фильтры из хроматографической бумаги
Центрифуга Т-23 (Janetzki, Германия) или аналогичная
Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими веществами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонок с ионообменными смолами Дауэкс 1х8 и Дауэкс 50Wх2.
7.1. Очистка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетона. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и
поташом (на 1000 куб. см ацетона 10 г KMnO и 2 г K CO ).
4 2 3
7.1.2. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.1.3. Очистка хлороформа. Хлороформ встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворитель промывают водой, после чего сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют.
7.1.4. Очистка диэтилового эфира. Диэтиловый эфир встряхивают со свежеприготовленным раствором железного купороса (30 г сульфата железа, 655 куб. см воды с добавлением 1,5 куб. см концентрированной серной кислоты), затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
7.2. Приготовление 0,5 н раствора соляной кислоты
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, содержащую 200 — 300 куб. см деионизованной воды, вносят 41 куб. см концентрированной HCl, перемешивают, доводят объем до метки деионизованной водой и перемешивают.
Растворы соляной кислоты других концентраций готовят из 0,5 н раствора HCl соответствующим разбавлением деионизованной водой.
7.3. Приготовление 1 М раствора гидроксида натрия
40 г NaOH помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, добавляют 500 — 600 куб. см деионизованной воды, перемешивают до полного растворения вещества, охлаждают раствор до комнатной температуры, доводят объем водой до метки и перемешивают.
7.4. Приготовление 0,1 н раствора калия фосфорнокислого однозамещенного (рН 4,5)
13,56 г KH PO помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, 2 4 добавляют 500 - 600 куб. см деионизованной воды, перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем водой до метки и перемешивают. Кислотность раствора контролируют с помощью иономера. При необходимости доводят рН раствора до 4,5 с помощью 1 М H PO или 1 М NaOH. 3 4
7.5. Приготовление 0,025 М раствора тетраборнокислого натрия (рН 9,0)
950 мг Na B O х 10 H O помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. 2 4 7 2 см, добавляют 50 - 60 куб. см деионизованной воды, перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем водой до метки и перемешивают. Щелочность раствора контролируют с помощью иономера. При необходимости
доводят рН раствора до 9,0 с помощью 0,5 н HCl или 1 М NaOH.
7.6. Приготовление 0,001 М раствора 9-флуоренилметилхлорформиата
31,8 мг 9-флуоренилметилхлорформиата помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 — 60 куб. см ацетона, перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем ацетоном до метки и перемешивают.
7.7. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 350 куб. см ацетонитрила, 650 куб. см 0,1 М раствора KH PO (п. 7.4), перемешивают, 2 4 фильтруют и дегазируют.
7.8. Кондиционирование колонки
Промывают колонку для ВЭЖХ 20 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:1 по объему), а затем подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 7.7) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.
7.9. Приготовление градуировочных растворов глифосата
7.9.1. Исходный раствор глифосата для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 100 мг глифосата, растворяют в 400 — 500 куб. см деионизованной воды, доводят объем водой до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре 2 — 4 °С не более одного месяца.
7.9.2. Раствор глифосата № 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора глифосата с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.9.1), доводят водой объем до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов № 2 — 5.
Для приготовления проб семян с внесением при оценке полноты извлечения глифосата из исследуемых образцов используют водный раствор глифосата с концентрацией 10 мкг/куб. см.
Для приготовления проб масла с внесением при оценке полноты извлечения глифосата из исследуемых образцов используют растворы глифосата в 80%-ном ацетоне с концентрациями 10 и 100 мкг/куб. см.
Градуировочный раствор № 1 и растворы для фортификации хранят в холодильнике при температуре 2 — 4 °С не более одной недели.
7.9.3. Рабочие растворы № 2 — 5 глифосата для градуировки (концентрация 0,01 — 0,10 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 куб. см градуировочного раствора № 1 глифосата с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), доводят объем деионизованной водой до метки, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией глифосата 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см соответственно.
Растворы готовят непосредственно перед использованием.
7.10. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации глифосата в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.
В градуированные пробирки вместимостью 10 куб. см вносят по 1,5 куб. см рабочих стандартных растворов глифосата с концентрациями 0,01; 0,02; 0,05 и 0,10 мкг/куб. см и упаривают их досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1,5 куб. см 0,025 М раствора тетрабората натрия и подвергают дериватизации по п. 9.3.
В инжектор хроматографа вводят по 50 куб. мм полученных растворов флуорогенного производного глифосата и анализируют по п. 9.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации.
7.11 Подготовка анионообменной смолы
Дауэкс 1х8 и колонки
В химический стакан вместимостью 2000 куб. см помещают 100 г _
анионообменной смолы Дауэкс 1х8 (Cl - форма), 1000 куб. см 0,5 н HCl и перемешивают суспензию в течение 10 мин. на магнитной мешалке. После 30-минутного отстаивания декантируют надосадочную жидкость, оставшуюся суспензию смолы фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Смолу на фильтре промывают деионизованной водой до тех пор, пока рН фильтрата не
достигнет рН деионизованной воды.
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 мм вставляют тампон из стекловаты, медленно выливают в колонку (при
_
открытом кране) суспензию: 5 г подготовленного анионита Дауэкс 1х8 (Cl - форма) в 50 куб. см деионизованной воды. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и вводят в колонку 1 куб. см водного раствора
глифосата с концентрацией 10 мкг/куб. см. Колонку последовательно промывают
20 куб. см деионизованной воды, 200 куб. см 0,5 н HCl и 250 куб. см деионизованной воды со скоростью 5 куб. см/мин., после чего она готова к
работе.
7.12 Подготовка катионообменной смолы
Дауэкс 50Wх2 и колонки
В химический стакан вместимостью 2000 куб. см помещают 100 г +
катионообменной смолы Дауэкс 50Wх2 (H - форма), 1000 куб. см 0,25 н HCl и перемешивают суспензию в течение 10 мин. на магнитной мешалке. После 30-минутного отстаивания декантируют надосадочную жидкость, оставшуюся суспензию смолы фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Смолу на фильтре промывают деионизованной водой до тех пор, пока рН фильтрата не
достигнет рН деионизованной воды.
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 мм вставляют тампон из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию: 5 г подготовленного катионита Дауэкс 50Wх2
(H — форма) в 50 куб. см деионизованной воды и дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Затем колонку последовательно промывают 200 куб. см 0,25 н HCl, 200 куб. см деионизованной воды и 50 куб. см 0,03 н HCl со скоростью 5 куб. см/мин., после чего она готова к работе.
7.13 Проверка хроматографического поведения
глифосата на колонке с Дауэкс 1х8
В подготовленную по п. 7.11 колонку с Дауэкс 1х8 вводят 5 куб. см водного раствора глифосата с концентрацией 0,4 мкг/куб. см, подщелоченного 1 М NaOH до рН 11,0. Колонку промывают 200 куб. см деионизованной воды со скоростью 5 куб. см/мин. и элюат отбрасывают. Затем через колонку последовательно пропускают 50 куб. см 0,01 н HCl и 100 куб. см 0,03 н HCl со скоростью 2 куб. см/мин. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С, и эту операцию повторяют трижды с последовательно вносимыми 5 куб. см порциями деионизованной воды для удаления следов кислоты. Остатки растворяют в 1,5 куб. см 0,025 М тетрабората натрия, подвергают дериватизации по п. 9.3 и анализируют на содержание глифосата по п. 9.4.
Фракции, содержащие глифосат, объединяют и вновь анализируют по п. 9.4. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
8. Отбор и хранение проб
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб» и ГОСТ 8988-77 «Масло рапсовое, ТУ».
Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в сухом проветриваемом помещении. Масло хранят в полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 4 — 6 °С. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.
Перед анализом образцы семян размалывают на мельнице.
9. Выполнение определения
9.1. Экстракция глифосата
9.1.1. Семена. Навеску (10 г) размолотых семян рапса помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 125 куб. см 0,1 н HCl и перемешивают в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Суспензию центрифугируют 10 мин. при 5000 g. Надосадочную жидкость декантируют в мерный цилиндр, осадок повторно обрабатывают 50 куб. см 0,1 н HCl, центрифугируют и полученный экстракт объединяют с первым. Отбирают 1/2 объема раствора, эквивалентного 5 г образца, и переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Добавляют 30 куб. см хлороформа и содержимое энергично встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев хлороформную фракцию отбрасывают. Водную фазу подщелачивают 1 М NaOH до рН 11,0 и центрифугируют 5 мин. при 5000 g. Супернатант декантируют в мерный цилиндр и доводят деионизованной водой до объема 100 куб. см. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.
9.1.2. Масло. Навеску (5 г) масла помещают в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, приливают 50 куб. см 0,1 н HCl и энергично встряхивают в течение 1 — 2 мин. Нижний водный слой отделяют, а масло повторно обрабатывают 30 куб. см 0,1 н HCl. Объединенные водные экстракты переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см хлороформа и энергично встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев нижнюю хлороформную фракцию отбрасывают, а водную фазу подщелачивают 1 М NaOH до рН 11,0 и центрифугируют 5 мин. при 5000 g. Супернатант декантируют в мерный цилиндр и доводят деионизованной водой до объема 100 куб. см. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.
9.2. Очистка на ионообменных колонках
Аликвоты экстрактов семян и масла объемом 12 куб. см (из пп. 9.1.1 и 9.1.2) пропускают через колонку с Дауэкс 1х8 (п. 7.11) со скоростью 2 куб. см/мин. Колонку последовательно промывают 200 куб. см воды и 50 куб. см 0,01 н HCl со скоростью 5 куб. см/мин., которые отбрасывают. Глифосат элюируют 60 куб. см 0,03 н HCl со скоростью 2 куб. см/мин. Полученный элюат пропускают через колонку с Дауэкс 50Wх2 (п. 7.12) со скоростью 2 куб. см/мин. Отбрасывают первые 5 куб. см элюата и собирают в грушевидную колбу остальной элюат. Колонку промывают 10 куб. см 0,03 н HCl и элюат объединяют с ранее полученным. Объединенный элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С, и эту операцию повторяют трижды с последовательно вносимыми 5 куб. см порциями деионизованной воды для удаления следов кислоты. Сухой остаток экстракта рапсового масла растворяют в 6 куб. см, а семян в 9 куб. см 0,025 М раствора тетрабората натрия. Отбирают аликвоту раствора объемом 1,5 куб. см, переносят в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой вместимостью 10 куб. см и подвергают дериватизации по п. 9.3.
9.3. Дериватизация
К 1,5 куб. см приготовленного для дериватизации раствора глифосата (п. 7.10) или образца (п. 9.2) прибавляют 1,5 куб. см 0,001 М ацетонового раствора 9-флуоренилметилхлорформиата (п. 7.6) и содержимое хорошо перемешивают. Реакционную смесь выдерживают 20 мин. при комнатной температуре, а затем трижды обрабатывают 2 куб. см порциями диэтилового эфира для удаления избытка флуорогенного реактива. К водному остатку добавляют деионизованной воды до объема 2,5 куб. см. 0,5 куб. см водного раствора переносят в мерную пробирку вместимостью 5 куб. см, прибавляют 4,5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 7.7), перемешивают и анализируют на содержание глифосата по п. 9.4.
9.4. Условия хроматографирования
Жидкостной хроматограф фирмы Altex, мод. 322 (США) с флуоресцентным детектором фирмы Shimadzu, мод. RF-5301 (Япония).
Хроматографическая колонка стальная, 4 х 150 мм, заполненная Диасорб-130-Амин (7 мкм).
Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1 М раствор KH PO , рН 4,5 (35:65 по 2 4
объему).
Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.
Температура колонки: комнатная.
Длина волны: лямбда возбуждения 270 нм; лямбда эмиссии 313 нм. max max
Чувствительность детектора: 4.
Объем вводимой пробы: 50 куб. мм.
Время удерживания глифосата: около 9 мин.
Линейный диапазон детектирования: 0,03 — 1,5 нг.
Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
10. Обработка результатов анализа
Содержание глифосата рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
Н х А х V
1
где:
Х - содержание глифосата, мг/кг;
Н - высота пика образца, мм;
1
Н - высота пика стандарта, мм;
0
А - концентрация стандартного раствора глифосата, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемой части образца, г (для семян и масла - 0,6 г).
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | +/- 100
1 2
--------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
Х +/- ДЕЛЬТА, мг/кг, при вероятности Р = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта х Х
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“»
< 0,15 <*> мг/кг для семян рапса.
< 0,10 <**> мг/кг для масла рапса.
<*> 0,15 мг/кг — предел обнаружения для семян рапса.
<**> 0,10 мг/кг — предел обнаружения для масла рапса.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д пи,Х пи,Х' +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности пи,Х пи,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта х Х
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = Х' - Х - С , к д _ _ где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
________________________
/ 2 2 К = \/ ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. пи,Х' пи,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
14. Разработчики
В МОДЕЛЬНЫХ МАТРИЦАХ (n = 5)
| Матрица | Внесено, мг/кг | Открыто, % | Доверительный интервал среднего, % |
| Семена | 0,15 | 76,2 | +/- 3,5 |
| 0,30 | 78,8 | +/- 3,5 | |
| 0,75 | 83,9 | +/- 3,3 | |
| 1,50 | 85,8 | +/- 3,2 | |
| Масло | 0,10 | 76,2 | +/- 3,6 |
| 0,20 | 80,7 | +/- 3,6 | |
| 0,50 | 83,4 | +/- 3,2 | |
| 1,00 | 87,5 | +/- 2,7 |