МУК 4.1.2462-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в томатах и луке-репке методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 29 апреля 2009 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
2 февраля 2009 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИМЕТОМОРФА В ТОМАТАХ И ЛУКЕ-РЕПКЕ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2462-09
29 апреля 2009 года
1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. № 3).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.
4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.
Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации диметоморфа в томатах и луке-репке в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг.
(E,Z)-4-[3(4-(хлорфенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
C H ClNO . 21 22 4
Смесь (E)- и (Z)-изомеров в соотношении 1:1.
Бесцветное кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления 127 - 148 °С; (E)-изомер 135,7 - 137,5 °С, (Z)-изомер 169,2 - 170,2 °С. -4 -3 Давление паров при 25 °С: (E)-изомер 9,7 х 10 мПа, (Z)-изомер 1,0 х 10
мПа. Растворимость в органических растворителях при 20 — 23 °С (г/куб. дм): ацетон — 88(E), 15(Z); циклогексанон — 27(Z); дихлорметан — 315(Z); диметилформамид — 272(E), 40(Z); гексан — 0,04(E), 0,02(Z); метанол, толуол
- 7(Z). Растворимость в органических растворителях смеси (E)- и (Z)-изомеров (г/куб. дм): гексан — 0,11; метанол — 39; этилацетат — 48,3; толуол — 49,5; ацетон — 100, дихлорметан — 461. Растворимость в воде при 20 °С (мг/куб. дм): 19 (pH 5), 18 (pH 7), 16 (pH 9). Коэффициент распределения
н-октанол - вода (20 °С) KOW log P = 2,63 (E)-изомер; 2,73 (Z)-изомер. Гидролитически и термически стабилен при нормальных условиях. Устойчив более 5 лет в темноте. (E)- и (Z)-изомеры на солнечном свету подвержены
взаимопревращению.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 3500 — 4300 мг/кг, 50 мышей — 3700 — 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс > 50 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK ) для крыс > 4,2 мг/куб. 50 дм (4 ч).
Диметоморф — системный фунгицид для борьбы с заболеваниями, вызываемыми оомицетами, особенно с возбудителями милдью винограда и фитофтороза картофеля и томатов.
МДУ в томатах и луке-репке 0,1 мг/кг.
1. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Томаты | от 0,05 до 0,1 вкл. | 50 | 7,1 | 20 | 23 |
| более 0,1 до 0,5 | 25 | 7,4 | 20 | 23 | |
| Лукрепка | от 0,05 до 0,1 вкл. | 50 | 7,1 | 20 | 23 |
| более 0,1 до 0,5 | 25 | 5,4 | 15 | 18 |
Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
| Анализируемый | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/- % |
| Томаты | 0,05 | 0,05 — 0,025 | 92,56 | 5,8 | 7,2 |
| Лукрепка | 0,05 | 0,05 — 0,025 | 93,05 | 5,1 | 6,3 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором электронного захвата ионов после экстракции из анализируемых проб томатов и лука-репки — ацетоном, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с флорисилом.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы: 0,25 нг.
В предлагаемых условиях метод специфичен.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный детектором электронного захвата ионов с переделом -14
детектирования по Линдану 5 х 10 г/с, Номер Госреестра предназначенный для работы с капиллярной колонкой 14516-95
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 7328
Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770
Микрошприц МШ-10 или Hamilton 701 вместимостью 10 куб. мм (США) ГОСТ 20292
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см ГОСТ 29227
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 10 куб. см ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100, 250, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Диметоморф с содержанием действующего вещества 97,6% (БАСФ, Германия)
Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над KMnO 4
Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794
Натрий сернокислый, безводный, хч ГОСТ 4166
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233
Флорисил для колоночной хроматографии (60 — 100 меш) фирмы «SERVA»
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аквадистиллятор ГОСТ 22340
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78 Бумажные фильтры "красная лента" обеззоленные ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительные вместимостью 500 куб. см ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 — 70 мм ГОСТ 25336
Колбы плоскодонные вместимостью 100, 150 и 250 куб. см ГОСТ 9737
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100 и 250 и 500 куб. см ГОСТ 9737
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 30 см, внутренним диаметром 13 — 15 мм
Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50
Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария
Стаканы химические вместимостью 100 и 400 куб. см ГОСТ 25336
Установка для перегонки растворителей
Хроматографическая колонка капиллярная НР-50 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, раствора внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.
7.1. Очистка органических растворителей
7.1.1 Ацетон. Ацетон перегоняют над небольшими количеством KMnO и
4
прокаленным карбонатом калия.
7.1.2. н-Гексан. Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.
7.1.3. Метилен хлористый. Растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.
7.2. Приготовление 5%-ного раствора хлористого натрия
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 25 г хлористого натрия, растворяют в 300 — 350 куб. см дистиллированной воды, доводя водой до метки, тщательно перемешивают.
7.3. Приготовление смеси гексан-ацетон (8:2, по объему)
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 800 куб. см гексана и 200 куб. см ацетона, тщательно перемешивают.
7.4. Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения
7.4.1. Исходный раствор диметоморфа для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см).
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г диметоморфа, растворяют в 50 — 70 куб. см ацетона, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике (4 — 6 °С) в темноте в течение месяца.
Рабочие градуировочные растворы диметоморфа готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.
7.4.2. Раствор № 1 диметоморфа для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см).
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора диметоморфа с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетоном до метки. Раствор хранится в холодильнике в темноте в течение месяца.
Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения диметоморфа из исследуемых образцов методом «внесено-найдено».
7.4.3. Рабочие растворы № 2 — 5 для градуировки (концентрация 0,25 — 2,5 мкг/куб. см).
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 2,5; 5,0; 10,0 и 25,0 куб. см раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 4.2), доводят до метки смесью гексан-ацетон (8:2, по объему), приготовленной по п. 7.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией диметоморфа 0,25; 0,5; 1,0 и 2,5 мкг/куб. см соответственно. Растворы хранятся в холодильнике (в темноте) в течение 10 дней.
7.5. Установление градуировочных характеристик
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей хроматографических пиков (E)- и (Z)-изомеров (мВ х с) от концентрации диметоморфа в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.
В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
7.6. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см, внутренним диаметром 13 — 15 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию: 5 г флорисила (предварительно дезактивированного 4% по массе деионизованной воды) в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.
7.7. Проверка хроматографического поведения диметоморфа на колонке
В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора № 1 для градуировки с концентрацией диметоморфа 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха. Остаток растворяют в 5 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу ополаскивают 3 куб. см этой же смеси, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 160 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), первые 50 куб. см элюата отбрасывают.
Далее элюат отбирают фракционно (по 10 куб. см), упаривают, остатки растворяют в 4 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), анализируют по п. 9.4.
Фракции, содержащие диметоморф, объединяют и вновь анализируют.
Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Примечание. Проверку хроматографического поведения вещества следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.
8. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие, ТУ», ГОСТ 1723-86 «Лук репчатый, ТУ», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).
Отобранные пробы томатов и лука-репки хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.
9. Выполнение определения
9.1. Экстракция
Образец измельченных томатов или лука-репки массой 50 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см ацетона, гомогенизируют в течение 2 мин. Экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр, декантируя в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой. Экстракцию пробы повторяют новой порцией ацетона объемом 80 куб. см, встряхивая 2 мин. и фильтруя в мерный цилиндр. Остаток на фильтре промывают 20 куб. см ацетона.
Доводят общий объем раствора в цилиндре до 250 куб. см ацетоном, перемешивают. Аликвоту раствора объемом 100 куб. см (соответствующую 20 г анализируемого образца) подвергают очистке по п. 9.2.
9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Аликвоту ацетонового экстракта, полученную по п. 9.1.1 или 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см. Вносят в воронку 50 куб. см дихлорметана, 20 куб. см 5%-ного водного раствора хлористого натрия и 200 мл деионизованной воды, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой фильтруют через безводный сульфат натрия (20 г), помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в колбу для упаривания вместимостью 500 куб. см. Операцию промывки встряхиванием в течение 1 мин. с дихлорметаном повторяют еще 2 раза порциями по 30 куб. см. Нижнюю органическую фазу каждый раз фильтруют через безводный сульфат натрия в ту же круглодонную колбу. Фильтр с сульфатом натрия промывают 20 куб. см дихлорметана. Объединенную органическую фазу упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.
9.3. Очистка экстракта на колонке с флорисилом
Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 5 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают 3 куб. см смеси, которую также наносят на колонку. Промывают колонку со скоростью 1 — 2 капли в секунду 160 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), первые 50 куб. см элюата отбрасывают.
Последующие 110 куб. см элюата собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, остаток в колбе растворяют в 4 куб. см смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), анализируют содержание диметоморфа по п. 9.4.
9.4. Условия хроматографирования
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный детектором электронного захвата ионов
Колонка капиллярная НР-50 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм
Температура испарителя: 300 °С
Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 130 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 25 °С/мин. до температуры 280 °С, выдержка — 5 мин., нагрев колонки со скоростью 50 °С/мин. до температуры 300 °С, выдержка — 10 мин.
Скорость газа 1 (азот): 30 см/с, давление 11,399 кПа, поток 4,0547 куб. см/мин.
Газ 2: деление потока 1: 2,017; сброс 8,179 куб. см/мин.
Хроматографируемый объем: 1 мм
Ориентировочное время выхода диметоморфа: (Z)-изомер — 17 мин. 59 с, (E)-изомер — 18 мин. 41 с
Линейный диапазон детектирования 0,25 — 2,5 нг.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор диметоморфа с концентрацией 2,5 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан-ацетон (8:2, по объему) не более чем в 50 раз.
10. Обработка результатов анализа
Содержание диметоморфа в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:
С х V х К
С — концентрация диметоморфа, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков (E)- и (Z)-изомеров, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г;
К = 2,5 (с учетом объема экстракта, взятого для анализа).
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х и Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
Х
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание диметоморфа в пробе менее 0,05 мг/кг» <*>.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
Х
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном определяемых концентраций, таблица 1), %.
Контрольный параметр процедуры К рассчитывают по формуле: К
_ _ К = Х' - Х - С , К д
_
где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
К
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном определяемых
концентраций, таблица 1), %.
14. Разработчики
ФГУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.