МУК 4.1.2378-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств карфентразон-этила по метаболиту карфентразону в зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса, растительных маслах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 02.07.2008)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 5 сентября 2008 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
2 июля 2008 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАРФЕНТРАЗОН-ЭТИЛА ПО МЕТАБОЛИТУ КАРФЕНТРАЗОНУ В ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ, СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА И РАПСА, РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЛАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2378-08
5 сентября 2008 года
1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 апреля 2008 г. № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 июля 2008 г.
4. Введены в действие с 5 сентября 2008 г.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в зерне кукурузы, семенах подсолнечника, рапса и растительных маслах (кукурузы, подсолнечника, рапса) массовых концентраций карфентразон-этила по метаболиту карфентразону в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.
(R,S)-2-хлор-3-[2-хлор-5-(4-дифторметил-4,5-дигидро-3-метил-5-оксо-1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-фторфенил] пропионовой кислоты этиловый эфир (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
C H Cl F N O . 15 14 2 3 3 3
Химически чистый карфентразон-этил представляет собой вязкую желтую жидкость с легким нефтяным запахом. Температура плавления - 22,1 °С, температура кипения 350 - 355 °С/760 мм рт. ст. Давление паров при 25 °С:
-2
1,6 х 10 мПа. Растворимость в толуоле - 0,9; гексане - 0,03 (г/куб. см, 20 °С); смешивается во всех соотношениях с ацетоном, дихлорметаном, этанолом и этилацетатом. Растворимость в воде - 12 мг/куб. см (при 20 °С), 22 мг/куб. см (при 25 °С); 23 мг/куб. см (при 30 °С). Коэффициент распределения в системе октанол/вода: K log P = 3,36.
ow
Карфентразон-этил в водной среде гидролитически стабилен при pH 5, в нейтральной и щелочной среде подвержен гидролизу: DT 3,6 ч (pH 9), 8,6
50
дней (pH 7). Фотолитически не стабилен: DT — 8 дней. 50
Краткая токсикологическая характеристика:
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 5143 мг/кг; острая 50 дермальная токсичность (LD ) для крыс > 4000 мг/кг; острая ингаляционная 50 токсичность (LK ) для крыс > 5 мг/куб. дм (4 часа). 50
Основным продуктом гидролитического разложения (метаболитом) карфентразон-этила в растениях, воде, почве является карфентразон (кислота).
(R,S)-2-хлор-3-[2-хлор-5-(4-дифторметил-4,5-дигидро-3-метил-5-оксо-1H-1,2,4-триазол-1-ил)-4-фторфенил]пропионовая кислота (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
C H Cl F N O . 13 10 2 3 3 3
Карфентразон-этил — гербицид системного действия из группы триазолинонов, хорошо приникающий в растения через листья, но слабо передвигающийся по растению. Механизм действия связан с ингибированием активности протопорфирингеноксидазы. Высокоэффективен против широкого спектра двудольных сорняков.
МДУ карфентазон-этила в зерне и масле кукурузы, семенах и масле подсолнечника и рапса — 0,02 мг/г.
1. Метрологические характеристики метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности) +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости сигма , % r | Предел повторяемости r, % | Предел воспроизводимости R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Зерно кукурузы | от 0,01 до 0,1 | 50 | 8,0 | 22 | 26 |
| Семена рапса | от 0,01 до 0,1 | 50 | 7,2 | 20 | 24 |
| Семена подсолнечника | от 0,01 до 0,1 | 50 | 7,2 | 20 | 24 |
| Кукурузное масло | от 0,01 до 0,1 | 50 | 7,8 | 22 | 26 |
| Рапсовое масло | от 0,01 до 0,1 | 50 | 7,6 | 21 | 25 |
| Подсолнечное масло | от 0,01 до 0,1 | 50 | 7,5 | 21 | 25 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение S, % | Доверительный интервал среднего результата +/-, % | |
| Зерно кукурузы | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 85,3 | 6,0 | 8,3 |
| Семена рапса | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 83,2 | 5,0 | 6,9 |
| Семена подсолнечника | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 83,4 | 5,6 | 7,8 |
| Кукурузное масло | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 88,6 | 6,4 | 8,9 |
| Рапсовое масло | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 86,2 | 6,0 | 8,3 |
| Подсолнечное масло | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 84,8 | 5,4 | 7,5 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении карфентразон-этила по метаболиту карфентразону с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором (УФ) после его экстракции из анализируемых проб смесью ацетонитрил — вода — уксусная кислота, очистки экстракта перераспределением между несмешивающимися фазами и на колонке с силикагелем.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии 2,4-Д.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым Номер Госреестра детектором с переменной длиной волны 15945-97
(фирмы Perkin-Elmer, США)
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения с ГОСТ 7328 наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см
Пробирки градуированные вместимостью 10 куб. см ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770 вместимостью 25, 50, 100, 200 и 1000 куб. см
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Карфентразон, аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99,3% (фирма ФМС) или Карфентразона натриевая соль с содержанием основного вещества 99,2% (СОП 74-07, НПК «БЛОК-1»)
Силикагель Si 60 для колоночной хроматографии, 0,2 — 0,5 мм (фирмы «Мерк», Германия)
Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ-6-09-4326-76 Вода деионизованная ГОСТ 6702 н-Гексан, хч ТУ-6-09-3375 Изопропиловый спирт (пропанол-2), хч ТУ 6-09-402-75 Калий гидроксид, осч ОСТ 6-01-301
Кислота ортофосфорная, хч, 85% ГОСТ 6552
Кислота уксусная ледяная, хч ГОСТ 61
Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995
Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794
Натрий углекислый кислый (бикарбонат), хч ГОСТ 4201
Натрий сернокислый безводный, хч ГОСТ 4166
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), ч ГОСТ 22300
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78
Аквадистиллятор ГОСТ 22340
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные ТУ 6-09-2678-77 или фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ
Воронки делительные вместимостью ГОСТ 25336 100, 250 и 500 куб. см
Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336
Индикаторная бумага универсальная
Колбы плоскодонные вместимостью ГОСТ 9737 100, 250 и 400 куб. см
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью ГОСТ 9737 10, 100, 250 и 500 куб. см
Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 10696
Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария
Стаканы химические вместимостью 10, 250 и 400 куб. см ГОСТ 25336
Стеклянная колонка длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм
Установка для перегонки растворителей
Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 2,0 мм, содержащая Сферисорб S 5 ODS 2, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов и растворов внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке, отбор проб.
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.1.2 Очистка этилацетата
Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.
7.1.3 Очистка н-гексана и хлористого метилена
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.
7.2. Приготовление смеси растворителей для экстракции
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 900 куб. см ацетонитрила, 100 куб. см дистиллированной воды и 10 куб. см уксусной кислоты, тщательно перемешивают.
7.3. Приготовление 2% раствора уксусной кислоты в этилацетате
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 — 700 куб. см этилацетата, вносят 20 куб. см уксусной кислоты, тщательно перемешивают.
7.4. Приготовление 0,2 № раствора гидроксида калия
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 11,2 г гидроксида калия, растворяют в 600 — 700 куб. см деионизованной воды, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.
7.5. Приготовление 6 № раствора серной кислоты
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 400 — 500 куб. см деионизованной воды, вносят 336 куб. см концентрированной серной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.
7.6. Приготовление 5%-ного раствора бикарбоната натрия
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 50 г бикарбоната натрия, растворяют в 600 — 700 куб. см деионизованной воды, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.
7.7. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 380 куб. см ацетонитрила, 620 куб. см деионизированной воды, 1 куб. см ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
7.8. Кондиционирование хроматографической колонки
Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.7) при скорости подачи растворителя 0,4 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.
7.9. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения
7.9.1. Исходный раствор карфентразона для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,1 г карфентразона (аналитический стандарт в виде кислоты), растворяют в 50 — 70 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают.
В случае использования в качестве аналитического стандартного образца натриевой соли карфентразона проводят выделение свободной кислоты. С этой целью готовят раствор натриевой соли карфентразона в метаноле с концентрацией карфентразона 2,5 мг/куб. см (0,2825 г образца на 100 куб. см раствора). Аликвоту полученного раствора объемом 1 куб. см помещают в коническую колбу вместимостью 200 — 250 куб. см, вносят 100 куб. см деионизованной воды, перемешивают, с помощью 6 № серной кислоты доводят pH раствора до 1 — 2 (контроль по индикаторной бумаге), переносят его в делительную воронку вместимостью 250 куб. см и проводят экстракцию карфентразона хлористым метиленом (трижды порциями по 50 куб. см). Объединенный дихлорметановый экстракт (нижняя фаза) пропускают через слой безводного сульфата натрия, переносят в колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, упаривают досуха. Остаток, растворяя порциями ацетонитрила по 6 — 7 куб. см, переносят в мерную колбу вместимостью 25 куб. см, доводят ацетонитрилом до метки, перемешивают.
Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.
Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.
7.9.2. Раствор № 1 карфентразона для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.9.1), доводят до метки подвижной фазой (приготовленной по п. 7.7), тщательно перемешивают.
Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.
Этот раствор используют для приготовления проб зерна кукурузы, семян рапса и подсолнечника с внесением при оценке полноты извлечения карфентразона из исследуемых образцов, а также контроле качества результатов измерений методом добавок. Для внесения в образцы растительного масла используют раствор с концентрацией 10 мкг/куб. см, приготовленный в изопропаноле.
7.9.3. Рабочие растворы № 2 — 5 карфентразона для градуировки (концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), доводят до метки подвижной фазой, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией карфентразона 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в холодильнике в течение месяца.
7.10. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации карфентразона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
7.11. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 15 — 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1,5 см. После этого колонка готова к работе.
7.12. Проверка хроматографического поведения карфентразона на колонке с силикагелем
В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора карфентразона с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.2), растворитель упаривают досуха, добавляют 3 куб. см этилацетата, помещают на ультразвуковую баню на 30 сек., вносят 2 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 30 сек. и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.11. Промывают колонку последовательно 50 куб. см гексана, 25 куб. см смеси гексан — этилацетат (1:1, по объему) и 50 куб. см этилацетата, элюат отбрасывают.
Затем колонку промывают 70 куб. см 2%-ного раствора уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.3) со скоростью 1 — 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см подвижной фазы, анализируют содержание карфентразона по п. 9.4.
Фракции, содержащие карфентразон, объединяют и вновь анализируют.
Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание: Проверку хроматографического поведения карфентразона следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.
8. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», 10583-76 «Рапс. Требования при заготовках и поставках», 22391-89 «Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках», 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).
Отобранные пробы зерна кукурузы, семян рапса и подсолнечника хранят в упаковке из хлопчатобумажной ткани не более 3-х месяцев. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.
Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в течение 3-х месяцев.
Перед анализом образцы зерна и семян измельчают.
9. Выполнение определения
9.1. Зерно кукурузы
9.1.1 Экстракция
Образец измельченного зерна кукурузы массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см смеси ацетонитрил — вода — уксусная кислота (90:10:1, по объему) и помещают на встряхиватель на 1 час.
Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре дважды промывают смесью ацетонитрил — вода — уксусная кислота (90:10:1, по объему) порциями по 30 куб. см. Объединенные экстракт и промывки переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см и проводят очистку по п. 9.1.2.
9.1.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К экстракту, полученному по п. 9.1.1, помещенному в делительную воронку, добавляют 20 куб. см 0,1 № раствора гидроксида калия, перемешивают и оставляют на 30 мин. Затем в делительную воронку вносят 50 куб. см гексана, интенсивно ее встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний гексановый слой отделяют и отбрасывают. Операцию промывки щелочного раствора повторяют новой порцией гексана объемом 30 куб. см.
Нижний водный слой помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 куб. см, подкисляют с помощью 6 № раствора серной кислоты до pH 2 — 3 (контролируя его значение по универсальной индикаторной бумаге), упаривают до водного остатка (объем 30 — 40 куб. см) при температуре 40 °С, переносят его в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см деионизованной воды (предварительно ополоснув ею колбу), 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Затем вносят в воронку 50 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, переносят в коническую колбу вместимостью 250 куб. см.
Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 30 куб. см хлористого метилена.
Объединенный дихлорметановый экстракт переносят в колбу для упаривания, пропуская через слой (1,5 — 2 см) безводного сульфата натрия, помещенного в конусную химическую воронку на бумажном фильтре. Упаривают досуха и очищают на колонке с силикагелем по п. 9.1.3.
9.1.3 Очистка экстракта на колонке с силикагелем
Остаток, полученный по п. 9.1.2, 9.2.2 и 9.2.3, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 3-х куб. см этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 30 сек., добавляют 2 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 30 сек. Затем раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.11. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 50 куб. см гексана, 25 куб. см смеси гексан — этилацетат (1:1, по объему) и 50 куб. см этилацетата, элюат отбрасывают.
Карфентразон элюируют с колонки 50 куб. см 2%-ной уксусной кислоты в этилацетате со скоростью 1 — 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, для полного удаления следов уксусной кислоты в колбу вносят 4 — 5 куб. см гексана и вновь упаривают. Остаток в колбе растворяют в 2-х куб. см подвижной фазы и анализируют содержание карфентразона по п. 9.4.
9.2. Семена рапса, подсолнечника
9.2.1 Экстракция
Образец измельченных семян рапса и подсолнечника массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см смеси ацетонитрил — вода — уксусная кислота (90:10:1, по объему) и помещают на встряхиватель на 1 час.
Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре дважды промывают смесью ацетонитрил — вода — уксусная кислота (90:10:1, по объему) порциями по 30 куб. см. Объединенные экстракт и промывки переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см и проводят очистку по п. 9.2.2.
9.2.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К экстракту, полученному по п. 9.2.1, помещенному в делительную воронку, добавляют 20 куб. см 0,1 № раствора гидроксида калия, перемешивают и оставляют на 30 мин. Затем в делительную воронку вносят 50 куб. см гексана, интенсивно ее встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний гексановый слой отделяют и отбрасывают. Операцию промывки щелочного раствора повторяют новой порцией гексана объемом 30 куб. см.
Нижний водный слой помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 куб. см, подкисляют с помощью 6 № раствора серной кислоты до pH 2 — 3 (контролируя его значение по универсальной индикаторной бумаге), упаривают до водного остатка (объем 30 — 40 куб. см) при температуре 40 °С, переносят его в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см деионизованной воды (предварительно ополоснув ею колбу), 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Затем вносят в воронку 50 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, переносят в коническую колбу вместимостью 250 куб. см.
Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 30 куб. см хлористого метилена.
Объединенную органическую фазу переносят в новую делительную воронку вместимостью 250 куб. см, вносят 25 куб. см 5%-ного раствора бикарбоната натрия, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. Для облегчения расслаивания образовавшейся эмульсии (в частности при анализе проб подсолнечника) воронку помещают в морозильную камеру на 15 мин. (или холодильник на 1 час). Допустимо перед помещением пробы в холодильник перелить раствор в коническую колбу с пришлифованной пробкой. После полного разделения фаз верхний водный слой отделяют, перенося в коническую колбу вместимостью 250 куб. см.
Операцию экстракции дихлорметанового раствора повторяют, используя 25 куб. см 5%-ного раствора бикарбоната натрия. Для облегчения расслаивания фаз воронку (или коблу) снова помещают в холодильник или морозильную камеру.
Водные фазы объединяют в стакане, фракцию хлористого метилена отбрасывают.
Водный раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, вносят в воронку 25 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют и отбрасывают. Операцию промывки водной фазы повторяют новой порцией гексана объемом 25 куб. см.
Водный слой переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, подкисляют с помощью 6 н раствора серной кислоты до pH 1 — 2 (контролируя его значение по универсальной индикаторной бумаге), вносят в воронку 50 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, фильтруя через слой (1,5 — 2 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химической воронке.
Операцию экстракции водной фазы повторяют, используя 25 куб. см хлористого метилена.
Объединенный в круглодонной колбе экстракт, пропущенный через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.1.3.
9.3. Масло
9.3.1 Экстракция
Образец масла массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 — 250 куб. см, растворяют в 25 куб. см гексана, вносят 100 куб. см смеси ацетонитрил — вода — уксусная кислота (90:10:1, по объему) и интенсивно встряхивают в течение 2-х мин.
Для облегчения расслаивания образовавшейся эмульсии колбу помещают в морозильную камеру на 15 мин. (или холодильник на 1 час). Смесь осторожно переливают в делительную воронку, после полного разделения фаз нижний водно-ацетонитрильный слой отделяют, перенося в новую делительную воронку вместимостью 250 куб. см, и подвергают очистке по п. 9.2.2. Гексановый раствор отбрасывают.
9.3.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К экстракту, полученному по п. 9.3.1, помещенному в делительную воронку, добавляют 15 куб. см 0,1 № раствора гидроксида калия, перемешивают и оставляют на 30 мин. Затем в делительную воронку вносят 50 куб. см гексана, интенсивно ее встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний водно-ацетонитрильный слой отделяют, перенося в коническую колбу. Верхний гексановый слой отбрасывают.
Ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию промывки еще дважды, используя по 25 куб. см гексана.
Нижний водно-ацетонитрильный слой помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, подкисляют с помощью 6 № раствора серной кислоты до pH 2 — 3 (контролируя его значение по универсальной индикаторной бумаге), упаривают до водного остатка (объем 30 — куб. 40 куб. см) при температуре 40 °С, переносят его в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, вносят 100 куб. см деионизованной воды (предварительно ополоснув ею колбу), 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Затем вносят в воронку 50 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин.
После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, фильтруя через слой (1,5 — 2 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химической воронке.
Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 20 куб. см хлористого метилена.
Объединенный в круглодонной колбе экстракт, пропущенный через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.1.3.
9.4. Условия хроматографирования
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
Жидкостный хроматограф «Perkin Elmer» с ультрафиолетовым детектором
Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 2,0 мм, содержащая Сферисорб S 5 ODS 2, зернением 5 мкм
Температура колонки: комнатная
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода — ортофосфорная кислота (380:620:1, по объему)
Скорость потока элюента: 0,4 куб. см/мин.
Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм
Ориентировочное время выхода карфентразона: 9,5 — 9,9 мин.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор карфентразона с концентрацией 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.7).
10. Обработка результатов анализа
Содержание карфентразон-этила в пробе (Х, мг/кг) по основному метаболиту карфентразону рассчитывают по формуле:
А х V х К
А — концентрация карфентразона, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г;
К — коэффициент пересчета содержания карфентразона на карфентразон-этил, равный 1,07 (по соотношению молекулярных масс).
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(Х +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности Р = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание карфентразон-этила в пробе менее 0,01 мг/кг» <*>.
<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С >= ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном определяемых концентраций, таблица 1), %.
Контрольный параметр процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = Х' - Х - С , к д _ _ где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
таблица 1), %.