МУК 4.1.2331-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2008)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 10 апреля 2008 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
15 февраля 2008 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КЛОТИАНИДИНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, БОТВЕ И КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2331-08
10 апреля 2008 года
1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по защите прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. № 3).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 февраля 2008 г.
4. Введены в действие с 10 апреля 2008 г.
5. Введены впервые в качестве дополнения.
1. Вводная часть
Действующее вещество: клотианидин.
Структурная формула (не приводится).
(Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин (IUPAC).
6 8 5 2 Клотианидин представляет собой порошок без цвета и запаха. Температура
-4
плавления 176,8 °С. Давление пара - 1,3 х 10 мПа (25 °С). Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода K lg P = 0,7 (25 °С),
ow
рКа = 11,09 (20 °С).
Растворимость в воде (20 °С) - 0,304 (pH 4), 0,34 (pH 10) г/куб. дм. Растворимость в гептане < 0,00104, в ксилоле 0,028, дихлорметане 1,32,
метаноле 6,26, октаноле 0,938, ацетоне 15,2, этилацетате 2,03 г/л (25 °С).
Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс LD > 5000 мг/кг, ингаляционная токсичность для крыс LC (4 ч) > 50 50 6,1 мг/л. Не мутаген, не онкоген для крыс и мышей, не тератоген для крыс и кроликов. При прямом контакте опасен для пчел, не опасен при использовании
в качестве протравителя и в случае обработок не непосредственно на цветущие культуры.
Область применения: инсектицид из группы неоникотиноидов для борьбы с сосущими и грызущими насекомыми на рисе, кукурузе, рапсе, овощных и фруктовых культурах. Используется для протравливания семян, обработки почвы и вегетирующей культуры.
Гигиенические нормативы для клотианидина в России не установлены.
2. Методика определения клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом ВЭЖХ
2.1. Основные положения
2.1.1 Область применения и принцип метода
Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств клотианидина в воде водоемов в диапазоне концентраций 0,001 — 0,01 мг/кг, в почве — 0,05 — 0,5 мг/кг, в клубнях картофеля — 0,01 — 0,1 мг/кг и в ботве картофеля — 0,02 — 0,2 мг/кг.
Методика основана на определении клотианидина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов ацетоном (ботва и клубни картофеля) или водно-ацетоновой смесью (почва) с последующей очисткой методом твердофазной экстракции.
2.1.2 Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, % | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Вода | 0,001 — 0,01 | 100 | 4,2 | 11,8 | 16,5 |
| Почва | 0,05 — 0,1 | 50 | 5,0 | 14,0 | 19,6 |
| Почва | 0,1 — 0,5 | 25 | 4,8 | 13,4 | 18,7 |
| Ботва | 0,02 — 0,1 | 50 | 5,4 | 15,1 | 21,1 |
| Ботва | 0,1 — 0,2 | 25 | 5,0 | 14,0 | 19,6 |
| Клубни | 0,01 — 0,1 | 50 | 5,9 | 16,5 | 23,1 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
ДЛЯ n = 20, Р = 0,95
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Вода | 0,001 | 0,001 — 0,01 | 87,4 | 4,8 | 4,4 |
| Почва | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 96,5 | 5,2 | 4,7 |
| Ботва | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 81,1 | 5,6 | 5,1 |
| Клубни | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 85,7 | 6,3 | 5,7 |
2.1.3 Избирательность метода
Избирательность метода определения клотианидина достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, «Криохром», сорт 1 или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.
Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.
Вода бидистиллированная или деионизированная, ГОСТ 6709-79.
Клотианидин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.
Кислота трифторуксусная, ч, ТУ 6-09-3877-80, свежеперегнанная; 0,05%-ный водный раствор.
Метанол, хч, ГОСТ 6995-77.
Этилацетат, хч, ГОСТ 22300-76 с изм. № 1, 2, 3.
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,05 М % трифторуксусной кислоты (30:70 или 20:80, по объему).
Патроны для твердофазной экстракции Диапак С16 («БиоХимМак СТ»).
Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем 60 (0,040 — 0,063 mm), Merck.
2.3. Приборы и посуда
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или «Breeze» фирмы «Waters», или аналогичный.
Аналитические колонки ACQUITY UPLC BEH С18 (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) и
ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) или Spherisorb ODS2 (2,1 х 150) мм, 3 мкм (Waters).
Баня ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008, или аналогичная.
Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001, или аналогичные.
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, Buchi R-205, или аналогичный.
Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.
Испаритель одноканальный «ПЭ-2300» для концентрирования экстрактов в токе азота.
Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2, ТУ 5.375-4261-76.
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами).
Шприц медицинский с разъемом Льюера, ГОСТ 22090.
РН-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см.
2.4. Отбор и хранение проб
Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 «Картофель свежий для переработки на продукты питания»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб». Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остаточных количеств пестицидов хранят в морозильной камере при температуре -18 °С.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.
2.5.2 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.
2.5.3 Приготовление растворов
Для приготовления 0,05% раствора трифторуксусной кислоты 0,5 куб. см свежеперегнанной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, доводят объем до метки бидистиллированной или деионизованной водой и перемешивают.
Приготовление стандартного и градуировочных растворов:
Берут точную навеску клотианидина (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы — смесь ацетонитрила и 0,05% трифторуксусной кислоты (20:80, по объему). При изучении полноты извлечения клотианидина используют ацетонитрильные растворы вещества.
Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.
2.5.4 Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация клотианидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клотианидина в градуировочном растворе.
2.5.5 Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.
2.5.6 Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта
2.5.6.1. Кондиционирование патрона, заполненного гексадецилсиликагелем — Диапак С16, осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 2 мл метанола и воды. Элюат отбрасывают.
2.5.6.2. Кондиционирование патрона для дополнительной очистки экстрактов клубней и ботвы, заполненного Силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 2 мл этилацетата.
2.6. Проведение определения
2.6.1 Определение клотианидина в пробах воды
Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 25 куб. см пропускают через кондиционированный концентрирующий патрон, заполненный гексадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 куб. см ацетона. Элюат выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С и сухой остаток растворяют в 0,25 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ. 10 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.2 Определение клотианидина в пробах почвы
Образец почвы массой 10 г, предварительно просеянной через сито, помещают в коническую колбу емкостью 100 куб. см с притертой пробкой, прибавляют 10 куб. см воды и 40 куб. см ацетона. Колбу помещают в ультразвуковую баню и экстрагируют клотианидин в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр «красная лента»), осадок на фильтре промывают 5 куб. см ацетона. Экстракцию повторяют, используя в качестве экстрагента 50 куб. см смеси ацетон — вода (4:1). Фильтрат упаривают на ротационном испарителе (40 °С) до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный по п. 2.5.6 патрон с октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Колбу ополаскивают дважды порциями по 3 мл ацетонитрила и смывы также пропускают через тот же патрон. Фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 куб. см ацетона. Элюат собирают, выпаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С) и сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.3 Определение клотианидина в пробах клубней и ботвы картофеля
Навеску измельченных клубней или нарезанной ботвы картофеля массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 куб. см. Прибавляют 50 куб. см ацетона и экстрагируют клотианидин на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром «красная лента». Экстракцию повторяют с 50 куб. см ацетона, выдерживая в ультразвуковой ванне в течение 15 мин., суспензию фильтруют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Дальнейшую очистку проводят на патроне Диапак С16. Водный остаток пропускают через откондиционированный по п. 2.5.6 патрон, ополаскивают колбу 2 куб. см воды и тоже пропускают через патрон. Объединенный фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 куб. см ацетона в чистую круглодонную колбу объемом 10 куб. см и отдувают ацетон в токе азота. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см этилацетата и выдерживают колбу в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Экстракт для дополнительной очистки вносят в подготовленный концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 2 куб. см этилацетата. Фильтрат и промывку отбрасывают. Клотианидин элюируют 1 куб. см ацетона. Ацетон удаляют из элюата током азота (с помощью испарителя одноканального). Сухой остаток при анализе клубней растворяют в 2 куб. см, а ботвы — в 4 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.4 Условия хроматографирования
Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка 1 — ACQUITY UPLC BEH С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе воды. Колонка 2 — ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе проб почвы, клубней и ботвы картофеля. Температура колонки 30 +/- 1 °С. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05%-ная трифторуксусная кислота в соотношении 30:70 и скорости потока 0,1 куб. см/мин. (колонка 1) и 20:80 и скорости потока 0,15 куб. см/мин. (колонка 2). Рабочая длина волны 270 нм. Объем вводимой пробы 10 мкл. Время удерживания клотианидина 4,4 +/- 0,05 мин. (колонка 1) и 5,4 +/- 0,1 мин. (колонка 2).
Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф «Breeze» фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Рабочая длина волны 270 нм. Аналитическая колонка Spherisorb ODS2 (150 х 2,1) мм, 3 мкм (Waters) для анализа воды, почвы, клубней и ботвы картофеля. Подвижная фаза ацетонитрил — 0,05%-ная трифторуксусная кислота в соотношении 20:80. Скорость потока элюента 0,2 куб. см/мин. Дозируемый объем 20 куб. см.
Время удерживания клотианидина 8,2 +/- 0,1 мин.
3. Обработка результатов анализа
Содержание клотианидина в образцах воды, почвы, клубней и ботвы картофеля (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:
S х С х V
2
где:
S - площадь пика клотианидина в стандартном растворе (мВ х сек.);
1
S - площадь пика клотианидина в анализируемой пробе (мВ х сек.);
2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб.
см; Р — навеска анализируемого образца, г; С — концентрация стандартного раствора клотианидина, мкг/куб. см.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клотианидина 1, мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
5. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности Р = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг.
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,005 мг/кг <*>).»
<*> 0,005 мг/кг — предел обнаружения.
6. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
К = Х' - Х - С , к д где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
6.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
7. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.
8. Требования к квалификации оператора
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.