МУК 4.1.2243-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовых концентраций бенз(а)пирена в воздухе рабочей зоны спектрально-флуоресцентным методом. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 17.08.2007)
Примечание
Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 17 августа 2007 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
17 августа 2007 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ БЕНЗ(А)ПИРЕНА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2243-07
с момента утверждения
1. Подготовлены: ГУ НИИ медицины труда РАМН.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 2 от 21.06.2007).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко.
Введение
Сборник методических указаний «Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны» (выпуск 49) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций вредных веществ их предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочным безопасным уровням воздействия (ОБУВ) и являются обязательными при осуществлении санитарного контроля.
Включенные в данный сборник методические указания по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 ССБТ «Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования», ГОСТ Р 8.563-96 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р ИСО 5725 (части 1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
Методики выполнены с использованием современных методов исследования, метрологически аттестованы и дают возможность контролировать концентрации химических веществ на уровне и ниже их ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны» и ГН 2.2.5.1314-03 «Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны» и дополнениях к ним.
Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для центров Госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств.
1. Область применения
Настоящие Методические указания устанавливают методику количественного химического анализа воздуха рабочей зоны для определения в нем бенз(а)пирена (БП) спектрально-флуоресцентным методом в диапазоне массовых концентраций от 0,000050 до 0,10 мг/куб. м.
2. Характеристика вещества
2.1 Структурная формула (не приводится).
2.2 Эмпирическая формула C H .
20 12
2.3 Молекулярная масса 252.
2.4 Регистрационный номер CAS 50-32-8.
2.5 Физико-химические свойства:
БП — кристаллическое вещество бледно-желтого цвета, t 176,5 °С, пл. t 310 °С при 10 мм рт. ст. Хорошо растворим в углеводородах (бензоле, кип. циклогексане, гексане, н-октане и др.), а также в эфирах и одноосновных спиртах. Нерастворим в воде.
В воздухе находится в виде аэрозолей.
2.6 Токсикологическая характеристика:
Бенз(а)пирен обладает канцерогенным действием и кумулятивным эффектом.
Среднесменная предельно допустимая концентрация (ПДК ) в воздухе с.с. рабочей зоны — 0,00015 мг/куб. м.
3. Метрологические характеристики
ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ P = 0,95
| Диапазон измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в воздухе, C, мг/куб. м | Показатель точности (границы относительной погрешности) при доверительной вероятности 0,95, дельта, % <*> | Границы неисключенной относительной систематической погрешности при доверительной вероятности 0,95, % | Среднеквадратическое отклонение относительной случайной погрешности (СКО повторяемости) измерений массы бенз(а)пирена в экстракте, % |
| 0,000050 до 0,10 | +/- 25 | +/- 15 | 7,5 |
| <*> Соответствуют расширенной неопределенности при коэффициенте охвата 2. | |||
4. Метод измерений
Измерение массовой концентрации БП включает следующие стадии:
- отбор воздушной пробы с улавливанием БП на фильтр АФА-ВП-10;
- экстракцию БП этиловым спиртом или гексаном;
- перевод БП в н-октан;
- количественное определение БП в н-октане спектрально-флуоресцентным методом по квазилинейчатым спектрам, наблюдаемым при температуре жидкого азота;
- вычисление массовой концентрации БП в анализируемом воздухе.
Для избирательного возбуждения свечения БП в замороженном при температуре жидкого азота н-октане используется монохроматическое излучение при длине волны 388 нм. Такое селективное возбуждение в известной степени компенсирует отсутствие предварительной хроматографии проб, что особенно важно в случае наличия в пробе бенз(k)флуорантена (БkФ), поскольку основная аналитическая линия БП — 403 нм, а БkФ — 403,4 нм.
Определению БП мешает БkФ при содержании более чем в десять раз, превышающем содержание БП в пробе. В связи с этим необходима проверочная запись того же участка спектра при тех же режимных параметрах, но при длине волны возбуждения 310 нм (соответствующей максимальному возбуждению БkФ). Появляющийся при этих условиях пик при 403 нм представляет собой практически полностью свечение БkФ. Если интенсивность этого пика превышает интенсивность такого же пика при возбуждении светом длиной волны 388 нм не более чем на 50%, то в этом случае погрешность анализа за счет присутствия в экстракте БkФ при выбранных условиях возбуждения не превысит 2% и этим можно пренебречь. При большей разнице интенсивностей описываемых пиков следует проводить хроматографическое выделение фракции БП (см. Вариант III).
Количественное определение БП в н-октане проводится методом внутреннего стандарта с бенз(g,h,i)периленом (БПЛ) (Вариант I) или методом добавок БП (Вариант II).
При анализе методом внутреннего стандарта регистрируется область спектра флуоресценции от 395 нм до 412 нм, измеряется интенсивность по площади (высоте) аналитических пиков БП — при длине волны 403 нм и БПЛ — при длине волны 406 нм.
При выбранных в методике условиях возбуждения свечение БПЛ в десятки раз слабее свечения БП. Поэтому БПЛ, присутствующий в самих экстрактах, практически не возбуждается и не оказывает влияния на результаты анализа.
При анализе методом добавок регистрируется область спектра флуоресценции при длинах волн от 395 нм до 420 нм, измеряется интенсивность (площадь) двух аналитических пиков БП при длинах волн 403 и 408 нм.
Количественное определение БП по Вариантам I и II без выделения фракции БП апробировано для воздуха рабочей зоны следующих производств: электролитического получения алюминия, электродной продукции, асфальта, пекопропиточных изделий, коксохимии, а также при использовании топливопотребляющих агрегатов и транспортных средств.
В пробах воздуха рабочей зоны других производств могут находиться вещества, мешающие определению БП, поэтому необходимо провести для этих проб апробирование методики.
При записи спектра флуоресценции БП в н-октановом растворе пробы в условиях, указанных в п. 9.4 или 15.2, возможны два случая:
а) наблюдаются пики, по которым можно идентифицировать БП и количественно его определить по данной методике;
б) наблюдаются пики, по которым нельзя идентифицировать БП, тем более количественно его определить.
В этих случаях следует провести количественный анализ БП, предварительно выделив фракцию БП методом тонкослойной хроматографии.
Если в случае а) разница в результатах анализа без хроматографии и с выделением фракции БП не будет превышать +/- 25%, то можно проводить количественное определение БП без его выделения.
В случае б) количественный анализ БП возможен только при выделении фракции БП и дальнейшем определении по первому или второму варианту.
Хроматографическое выделение фракции БП описано в Варианте III.
Нижний предел измерения массовой концентрации БП в октане — 0,001 мкг/куб. см.
Нижний предел измерения массовой концентрации БП в воздухе — 0,00005 мг/куб. м (при отборе 200 куб. дм воздуха).
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Флуоресцентный спектрофотометр F-4500 фирмы «Hitachi» с двумя монохроматорами, имеющий щели возбуждения и эмиссии в диапазоне 1,5 — 2,5 нм, с приставкой для замораживания проб жидким азотом и набором кварцевых кювет- трубочек с внутренним диаметром 5 мм или 3 мм (анализ методом внутреннего стандарта, Вариант I)
Люминесцентный спектрофотометр LS-50B фирмы «Perkin Elmer» с низкотемпературной приставкой и набором кювет-трубочек с внутренним диаметром 2 мм (анализ методом добавок, Вариант II), далее по тексту спектрофлуориметры
Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2 ГОСТ 1770-74
Автоматические пипетки вместимостью 0,05; 0,1; 0,2; 0,25 куб. см или с переменным объемом от 0,1 до 1 куб. см с погрешностью не более 1,0% ТУ 9452-001-33189998-95
Цилиндры с пришлифованными пробками 2(4)-50-2; 2(4)-100-2; 2(4)-200-1 ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1(2,3)-1(2)-2-1; 1(2,3)-1(2)-2-2; 1(2,3)-1(2)-2-5; 1(2,3)-1(2)-2-10 ГОСТ 29227-91
Химические пробирки с притертыми пробками градуированные П-2-5-14/23 ХС, П-2-10-14/23 ХС ГОСТ 1770-74
Секундомер не ниже 3 класса точности ГОСТ 5072-91
Барометр БАММ-1 с погрешностью +/- 0,8 мм рт. ст. ГОСТ 2405-88
Термометр лабораторный ТЛ-2 (0 — 55) °С с ценой деления 1 °С ГОСТ 29224-91
Индивидуальное пробоотборное устройство ПУ-1Эпм ТУ 4215-000-11696625-2003
Весы аналитические с ценой деления +/- 0,1 мг ГОСТ 24104-2001
Установка ультразвуковая, рабочая частота 22
кГц +/- 7% с водяной баней ТУ СУРЗ.836.008 ПС Фильтродержатели ИРА-10 ТУ 95.72.05-77 Фильтры АФА-ВП-10 ТУ 95-743-80 Шланги резиновые диаметром 6 мм ГОСТ 10515-75 Фильтры обеззоленные "синяя лента" ФО-ФС-15 ТУ 2642-001-42624157-98
Бюксы стеклянные СВ 19/9, СВ 24/10 ГОСТ 25336-82
Стаканы стеклянные ВН-1-50 ТС, ВН-1-100 ТС ГОСТ 25336-82
Стеклянные палочки ГОСТ 25336-82
Склянки темного стекла с притертой пробкой вместимостью 100 куб. см
Сосуд Дьюара СДС-6 исп. КВ 6086.000 ТУ 304-14-010-97
Облучатель на длины волн 254 и 365 нм (УФС-254/365) ТУ 4215-004-16943778-99
Набор для тонкослойной хроматографии или патроны Диапак (для Варианта III) ТУ 4215-002-05451931-94
5.2. Реактивы
ГСО БП в гексане № 7515-98 (массовая концентрация в пределах 95 — 105 мкг/куб. см, погрешность не более 2%)
Бенз(g,h,i)перилен с содержанием основного вещества не менее 98% фирмы «Aldrich» (для анализа методом внутреннего стандарта, Вариант I)
Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87
Диэтиловый эфир, ч. ТУ 84-555-76
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Гексан, ч.д.а. ТУ 2631-003-05807999-98
Азот жидкий ГОСТ 9293-74 (для Варианта III):
Бензол, ч.д.а. ГОСТ 5955-75
Оксид алюминия 2-ой степени активности по Брокману ТУ 6-09-3916-75
Применяемые средства измерений должны быть поверены в установленные сроки, иметь клеймо или свидетельство о поверке.
Допускается использование других средств измерений, имеющих аналогичные или лучшие технические и метрологические характеристики.
Допускается использование реактивов аналогичной или более высокой квалификации, изготовленных по другой нормативно-технической документации, в том числе и импортных.
6. Требования безопасности
6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ПОТ Р М-004-97 «Межотраслевые правила по охране труда при использовании химических веществ».
6.2. При проведении анализов с использованием горючих и вредных веществ необходимо соблюдать меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.
6.3. Необходимо соблюдать правила эксплуатации приборов согласно их техническому описанию и инструкции по эксплуатации. Требования электробезопасности при работе с электроустановками необходимо соблюдать по ГОСТ 12.1.019-79.
6.4. Работу с органическими растворами канцерогенных веществ следует проводить в вытяжном шкафу и в резиновых перчатках. Растворы БП должны храниться в закупоренных емкостях. При попадании раствора БП на кожу необходимо срочно промыть ее проточной водой с моющим средством, а затем обработать этот участок кожи этиловым спиртом.
6.5. При работе на промышленной площадке (отбор проб) оператор должен пройти инструктаж по технике безопасности и соблюдать правила техники безопасности, принятые на предприятии.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений на приборе и обработке их результатов допускаются лица, имеющие квалификацию химика-аналитика, прошедшие курс обучения работе на спектрофлуориметре, освоившие метод анализа и изучившие данные МУК.
Оператор, осуществляющий отбор проб, должен иметь опыт работы или пройти стажировку. Приступать к проведению пробоотбора следует после изучения соответствующего раздела МУК.
8. Условия измерений
8.1 Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в следующих условиях:
- атмосферное давление 84 — 106 кПа (630 — 800 мм рт. ст.);
- относительная влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С;
- напряжение в сети 220 +/- 22 В.
8.2. Измерения на спектрофлуориметре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
9. Подготовка к выполнению измерений
Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовку спектрофлуориметра, установление градуировочной характеристики, отбор проб.
9.1. Подготовка прибора
Подготовку спектрофлуориметра проводят в соответствии с Руководством по его эксплуатации.
9.2. Подготовка растворителей
Все растворители, используемые в анализе, проверяют на присутствие флуоресцирующих примесей: контролируют записью спектра флуоресценции БП в условиях анализа на спектрофлуориметре. В используемых для анализа растворителях должны отсутствовать флуоресцирующие примеси.
Вариант I. Измерение массовых концентраций БП методом внутреннего стандарта
9.3. Приготовление исходных и градуировочных растворов БП и БПЛ
9.3.1. Исходный раствор БП с массовой концентрацией 1,00 мкг/куб. см готовят из государственного стандартного образца (ГСО БП в гексане № 7515-98 с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см): 1,0 куб. см раствора ГСО помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят до метки н-октаном, полученный раствор тщательно перемешивают.
9.3.2. Градуировочный раствор с массовой концентрацией БП 0,0100 мкг/куб. см готовят разбавлением 1,0 куб. см исходного раствора в 100 раз н-октаном в мерной колбе вместимостью 100 куб. см.
9.3.3. Для приготовления исходного раствора БПЛ в н-октане с массовой концентрацией 50,0 мкг/куб. см берут навеску БПЛ 10,0 мг с точностью до 0,1 мг и растворяют в мерной колбе вместимостью 200 куб. см при тщательном перемешивании. Раствор выдерживают при комнатной температуре не менее двух часов. Используя УФ-облучатель, пропускающий пучок света с максимумом при длине волны 365 нм, контролируют отсутствие в растворе светящихся кристаллов БПЛ.
9.3.4. Градуировочный раствор БПЛ с массовой концентрацией 0,50 мкг/куб. см готовят разбавлением 1,00 куб. см исходного раствора БПЛ (C = 50,0 мкг/куб. см) в 100 раз н-октаном в мерной колбе вместимостью 100 куб. см.
Исходные и градуировочные растворы БП и БПЛ следует хранить в узкогорлой посуде с хорошо пришлифованной пробкой и заполненной не менее чем на 3/4 объема, в холодильнике при температуре минус 10 — 0 °С. Объем растворов, оставленных на хранение, фиксируют специальной меткой для наблюдения возможного испарения растворителя в процессе хранения.
Срок хранения исходного и градуировочного растворов БП в н-октане 1 год.
Примечание. Растворы БП могут использоваться и после указанного срока, при условии положительных результатов контроля стабильности градуировочной характеристики по п. 13.1, проведенного с использованием этих растворов.
Растворы БПЛ можно хранить в течение нескольких лет, если не наблюдается изменения объема раствора.
9.4. Установление градуировочной характеристики
Градуировочная характеристика выражает зависимость между отношением площадей (высот) аналитических пиков БП и БПЛ в спектре флуоресценции и отношением масс БП и БПЛ в смеси градуировочных растворов БП и БПЛ (далее — градуировочной смеси, ГС).
Градуировочную характеристику устанавливают при внедрении методики, после проведения ремонта прибора, а также в случае получения неудовлетворительного результата при контроле стабильности градуировочной характеристики по п. 13.1, но не реже 1 раза в месяц.
Градуировочную характеристику устанавливают при записи спектров 6 градуировочных смесей с соотношениями масс БП/БПЛ, указанных в табл. № 2.
Каждую градуировочную смесь готовят не менее трех раз. В табл. 2 приведены объемы смешиваемых градуировочных растворов в кюветах-трубочках с внутренним диаметром 3 мм, при использовании кювет-трубочек с диаметром 5 мм увеличивают смешиваемые объемы в 2 раза.
ГРАДУИРОВОЧНЫЕ СМЕСИ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ
ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ
БП МЕТОДОМ ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА
| № град. смесей | Объемы смешиваемых градуировочных растворов, куб. см | Объем н-октана, куб. см | Соотношение масс БП/БПЛ в градуировочной смеси (X) | |
| БП с массовой концентрацией 0,010 мкг/куб. см | БПЛ с массовой концентрацией 0,50 мкг/куб. см | |||
| 1 | 0,10 | 0,20 | - | 0,010 |
| 2 | 0,10 | 0,15 | 0,05 | 0,013 |
| 3 | 0,10 | 0,10 | 0,10 | 0,020 |
| 4 | 0,15 | 0,10 | 0,05 | 0,030 |
| 5 | 0,20 | 0,10 | - | 0,040 |
| 6 | 0,15 | 0,05 | 0,10 | 0,060 |
Градуировочные смеси хорошо перемешивают. При хранении в затемненном месте при комнатной температуре они устойчивы в течение 8 ч.
Условия записи спектров флуоресценции градуировочных смесей:
длина волны возбуждения — 388 нм;
диапазон спектра флуоресценции — от 395 до 412 нм;
скорость сканирования — 15 — 60 нм/мин. (выбирается одно значение в указанном в диапазоне);
щели возбуждения и эмиссии — по 1,5 — 2,5 нм (выбирается одно значение в указанном диапазоне);
напряжение на фотоумножителе — 700 или 750 В (выбирается одно значение согласно рекомендациям Руководства по прибору);
число сканирований для получения усредненного спектра — 3.
Кювету-трубочку с градуировочной смесью медленно в течение 30 с погружают в сосуд Дьюара с жидким азотом, закрепленный в отделении для образца спектрофлуориметра.
Далее производят запись спектра флуоресценции и наблюдают разрешенные аналитические пики при 403 нм (БП) и 406 нм (БПЛ).
Проводят линии основания для аналитических пиков БП (403 нм) и БПЛ (406 нм) и подсчитывают их площадь над линией основания по программе прибора.
Рассчитывают отношение площадей аналитических пиков БП и БПЛ (Y):
S : S = Y. (1) БП БПЛ Для каждой i-ой градуировочной смеси получают три значения Y и
i
рассчитывают среднее значение Y . iср
Значения отношений площадей аналитических пиков БП и БПЛ для i-той градуировочной смеси признают приемлемыми, если разность между наибольшим и наименьшим значениями не превышает установленный норматив (для P = 0,95):
Y - Y
imax imin
------------- х 100 <= 24, (2)
Y
iср
где Y , Y - соответственно максимальное и минимальное значения
imax imin
отношения площадей аналитических пиков БП и БПЛ для i-той градуировочной
смеси.
Градуировочная характеристика представляет собой прямолинейную зависимость, выражаемую уравнением:
где:
X - отношение масс БП и БПЛ в градуировочной смеси (в долях единицы);
Y - отношение площадей аналитических пиков БП и БПЛ (в долях единицы).
Расчет коэффициентов прямой (K, B) проводят с использованием программы 2 прибора или в Excel. Величина достоверности аппроксимации (R ) при построении прямой должна быть не ниже 0,98.
Градуировочную характеристику признают приемлемой при выполнении условия:
|Y - Y |
iср iгх
ТЕТА = ------------- х 100 <= 10, (4)
iгх Y
iгх
где ТЕТА - относительное отклонение среднего значения отношения
iгх
площадей (высот) аналитических пиков БП и БПЛ для i-той градуировочной смеси (Y ) от соответствующей точки на установленной градуировочной
iср
характеристике (Y ), %. iгх
Примечание. Аналогично вышеописанному устанавливают градуировочную характеристику при измерении высот аналитических пиков БП и БПЛ и вычислении их соотношений.
На спектрах флуоресценции проводят линии основания у пиков при 403 и 406 нм; на них опускают вертикальные линии с верхней точки пика до пересечения с линией основания пика. Измеряют высоты и вычисляют их соотношение:
h : h = Y. (5) БП БПЛ
9.5. Отбор проб воздуха
Отбор проб следует производить с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и рекомендаций Руководства Р 2.2.2006-05 (прилож. 9, «Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны», п. 3 контроль за соблюдением среднесменной ПДК).
Воздух аспирируют с объемным расходом 10 куб. дм/мин. через фильтр АФА-ВП-10.
Объем отобранного воздуха для измерения 1/2 ПДК БП составляет 130 куб. дм.
При отборе измеряют расход (по показаниям ротаметра), время, атмосферное давление, температуру воздуха.
Экспонированные фильтры складывают пополам, затем помещают в конверт из кальки или полиэтилена и заворачивают в черную бумагу. До проведения экстракции фильтры могут храниться не более 30 дней при температуре не выше 10 °С и в темном месте.
10. Выполнение измерения
10.1. Экстракция БП
Экстракцию уловленного БП с фильтра проводят с помощью ультразвуковой водяной бани. В качестве экстрагента используют этиловый спирт или гексан.
Фильтр помещают в термостойкий химический стаканчик вместимостью 50 — 100 куб. см, заливают 25 — 30 куб. см экстрагента, прижимая фильтр стеклянной палочкой. Экстракцию проводят трех-четырехкратно (по 15 — 20 мин.) — до исчезновения свечения порции экстракта под УФ-светом. Порции экстрактов после отстаивания аккуратно сливают через фильтр «синяя лента» в узкогорлую посуду с притертой пробкой из стекла или полипропилена, тщательно перемешивают. Расход этилового спирта при экстракции в ультразвуковой водяной бане примерно 100 куб. см.
До проведения анализа экстракты в плотно закрытой посуде можно хранить в темном месте в течение месяца.
10.2. Получение раствора пробы в н-октане
Для записи квазилинейчатого спектра БП необходимо получить раствор пробы в н-октане с содержанием БП в пределах от 0,001 до 0,05 мкг/куб. см.
Перед проведением количественного анализа полученный исходный экстракт пробы просматривают в УФ-свете. При очень слабой флуоресценции весь экстракт испаряют до последних капель при температуре не более 40 °С на водяной бане и добавляют 2 куб. см н-октана.
При наличии выраженной флуоресценции аликвоту исходного спиртового экстракта испаряют до последних капель и добавляют н-октан.
Если использовали в качестве экстрагента гексан, то аликвоту экстракта смешивают с н-октаном. Получению квазилинейчатого спектра БП в н-октане не мешает присутствие гексана в количестве до 1/3 объема раствора. Количество добавляемого к аликвоте н-октана зависит от необходимой степени разбавления исходного экстракта.
10.3. Проведение анализа холостой пробы
Для каждой партии проб проводят анализ холостой пробы. Экстрагируют этиловым спиртом неэкспонированный фильтр из партии, которая использовалась для данной серии анализов. Определяют БП в холостой пробе по Варианту измерений I или II (объем пробы концентрируют до 1 куб. см).
В случае обнаружения в холостой пробе БП выясняют причины его появления (проверяют наличие БП в экстрагентах, чистоту используемой посуды и т.д.) и устраняют их.
10.4. Количественное определение БП
При выбранных в методике параметрах прибора (п. 9.4) записывают спектр флуоресценции БП в н-октановом растворе пробы. Для этого в кювету-трубочку вносят пипеткой или автоматическим дозатором 0,2 — 0,4 куб. см (в зависимости от рабочего объема кюветы-трубочки) н-октанового раствора пробы. В полученном спектре наблюдают два аналитических пика при 403 нм (интенсивный) и 408 нм (слабый), идентифицирующие БП в пробе. (Третий пик БП при 428 нм — средней интенсивности.)
Если в спектре наблюдают пики при 403 нм и при 412 нм, значит в пробе присутствует БkФ в количестве, более чем десятикратно превышающем содержание БП. В этом случае требуется хроматографическое выделение фракции БП.
Готовят смесь н-октанового раствора пробы и градуировочного раствора БПЛ с массовой концентраций 0,50 мкг/куб. см (далее — смесь) непосредственно в кювете-трубочке. Объем смеси составляет 0,3 куб. см для кюветы с внутренним диаметром 3 мм и 0,6 куб. см для кюветы с внутренним диаметром 5 мм.
Возможны следующие соотношения объемов раствора пробы в н-октане (куб. см) и градуировочного раствора БПЛ (куб. см): 0,05/0,25; 0,10/0,20; 0,15/0,15; 0,20/0,10; 0,25/0,05. При использовании трубочки-кюветы с внутренним диаметром 5 мм смешиваемые объемы увеличивают в 2 раза, также возможны другие варианты соотношений.
Пример обнаружения концентрации БП, равной 0,001 мкг/куб. см:
0,001 х 0,25
------------ = 0,01 (первая точка ГХ), 0,50 х 0,05
0,25 — объем градуировочного раствора БПЛ, куб. см;
0,05 — объем раствора пробы в н-октане, куб. см;
0,5 — массовая концентрация БПЛ в градуировочном растворе, мкг/куб. см.
Соотношение смешиваемых растворов выбирают, ориентируясь на интенсивность пиков БП в первичной записи спектра пробы.
Кювету закрывают полипропиленовой пробочкой и, покачивая, перемешивают содержимое. Медленно опустив ее в сосуд Дьюара криоприставки прибора, производят запись спектра в условиях установления градуировочной характеристики.
Спектр флуоресценции анализируемой смеси должен быть аналогичен одному из полученных при установлении градуировочной характеристики. Убедившись, что анализируемая смесь приготовлена удовлетворительно, производят подсчет площадей или интенсивностей аналитических пиков БП (403 нм) и БПЛ (406 нм) с помощью программы спектрофлуориметра.
11. Вычисление результата измерений
11.1. Расчет массы БП в пробе
Массу БП в исходном экстракте (m, мкг) рассчитывают по формуле:
X х V х 0,50 V
БПЛ р.п.
m = --------------- х ----- х V , (6)
V V э
р.п.с. а
где:
X - соотношение масс БП и БПЛ в анализируемой (замороженной) смеси,
найденное по градуировочной характеристике; V — объем градуировочного раствора БПЛ в анализируемой смеси, куб. БПЛ см; 0,50 — массовая концентрация БПЛ в градуировочном растворе, мкг/куб. см; V — объем н-октанового раствора пробы в анализируемой смеси, куб. р.п.с. см; V — объем н-октанового раствора пробы, куб. см; р.п. V — объем аликвоты исходного экстракта, куб. см; а V — объем исходного экстракта, куб. см. э
11.2 Расчет массовой концентрации
БП в воздухе (C, мг/куб. м)
m
где:
m - масса БП в пробе, мкг;
V - объем воздуха, отобранного для анализа (куб. дм), приведенный к
20
стандартным условиям (прилож. 1 — не приводится).
12. Оформление результатов анализа
Результаты измерений представляют в виде:
C +/- ДЕЛЬТА, мг/куб. м, P = 0,95, (8)
где ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мг/куб. м.
ДЕЛЬТА = C х дельта х 0,01, (9)
где дельта — граница относительной погрешности измерений, равная 25% при P = 0,95 (табл. 1).
В случае, если бенз(а)пирена в воздухе рабочей зоны ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: «массовая концентрация бенз(а)пирена в воздухе рабочей зоны менее 0,00005 мг/куб. м (более 0,1 мг/куб. м)».
13. Контроль погрешности
13.1. Периодический контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль проводят в соответствии с планом внутрилабораторного контроля. Рекомендуемая первоначальная частота контроля — один раз в 6 месяцев.
При проведении измерений по Варианту I (метод внутреннего стандарта) для контроля стабильности используют 2 — 3 контрольные смеси, соответствующие градуировочным смесям из табл. 2. Для каждой смеси выполняют замеры, как описано в п. 9.4.
Результаты контроля считают положительными при выполнении для каждой контрольной смеси раствора следующего условия:
|X - X |
гх К
---------- х 100 <= 15, (10)
X
К
где:
X — соотношение масс БП и БПЛ в контрольной смеси (согласно табл. 2); К X — соотношение масс БП и БПЛ в контрольной смеси, найденное по гх градуировочной характеристике.
При превышении норматива измерения приостанавливают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, устраняют их, затем повторяют контрольные измерения или устанавливают новую градуировочную характеристику.
13.2. Контроль повторяемости результатов измерений массы БП в экстракте пробы
Контроль проводят при внедрении (оценки пригодности) методики, а затем в соответствии с планом внутрилабораторного контроля. Рекомендуется проводить контроль после каждого десятого анализа.
Контроль проводится путем параллельного анализа одним оператором исходного экстракта со стадии взятия аликвоты для испарения или разбавления исходного экстракта.
Результат контроля признают удовлетворительным при выполнении условия (для P = 0,95):
2 |m - m |
1 2
----------- х 100 <= r , (11)
m + m m
1 2
где:
m и m - результаты измерений массы БП в экстракте пробы, мкг;
1 2
r - норматив контроля - предел повторяемости результатов измерений
m
массы БП, %.
По результатам аттестации методики принято: r = 21%. m
Если результат контроля признают неудовлетворительным, то выясняют причины (правильность использования мерной посуды, чистота растворителя, стабильность показаний прибора) и устраняют их.
Если и после этого условие (11) не выполняется, переходят к выполнению
двух параллельных измерений массы БП при каждом анализе с проверкой приемлемости результатов параллельных измерений по выражению (11) с нормативом контроля r = 30%. При положительных результатах такой проверки
m
для последующего расчета массовой концентрации БП в воздухе используют среднее значение массы БП.
14. Нормы затрат времени на анализ
Для проведения серии анализов из 5-ти отобранных проб воздуха рабочей зоны потребуется 2 часа.
концентраций БП методом добавок
Условия применения метода добавок
Применение метода добавок для количественного определения БП в н-октановом растворе пробы возможно при соблюдении следующих условий:
а) зависимость между площадью аналитических пиков БП в спектре флуоресценции (S) и массовой концентрацией БП в н-октане (C ) должна быть
БП
линейной, проходящей через начало координат, т.е. S = k C ; БП
б) добавка БП в н-октановый раствор пробы должна увеличивать его массовую концентрацию в 1,5 — 2,5 раза;
в) интервал времени от погружения пробирки до начала записи спектра (согласно описанию низкотемпературной приставки к прибору) должен быть одинаковым для раствора пробы и раствора пробы с добавкой БП.
15. Установление линейной зависимости между площадью аналитических пиков БП в спектре флуоресценции и массовой концентрацией БП в н-октане
15.1. Приготовление исходных и градуировочных растворов БП
Исходный раствор № 1 с массовой концентрацией БП 1,00 мкг/куб. см готовят по п. 9.3.1.
Исходный раствор № 2 с массовой концентрацией БП 0,0500 мкг/куб. см готовят разбавлением 5,0 куб. см исходного раствора (C = 1,00 мкг/куб. см) в 100 раз н-октаном в мерной колбе вместимостью 100 куб. см.
Градуировочный раствор с массовой концентрацией БП 0,0100 мкг/куб. см готовят разбавлением 1,0 куб. см исходного раствора № 1 в 100 раз н-октаном в мерной колбе вместимостью 100 куб. см.
15.2. Установление градуировочной характеристики
Градуировочные растворы БП в н-октане приготавливают согласно табл. 3, используя мерные пробирки с хорошо притертыми пробками вместимостью 10 куб. см. Объемы градуировочного раствора БП в н-октане с концентрацией 0,0100 мкг/куб. см и н-октана отмеряют соответствующими по объему мерными пипетками.
ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ
| № градуировочных растворов | Объем градуировочного раствора БП с массовой конц. 0,0100 мкг/куб. см, куб. см | Объем н-октана, куб. см | Массовая концентрация БП в градуировочном растворе, мкг/куб. см |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,5 | 9,5 | 0,0005 |
| 2 | 1,0 | 9,0 | 0,0010 |
| 3 | 2,0 | 8,0 | 0,0020 |
| 4 | 4,0 | 6,0 | 0,0040 |
| 5 | 5,0 | 5,0 | 0,0050 |
| 6 | 8,0 | 2,0 | 0,0080 |
| 7 | 10,0 | 0 | 0,0100 |
Растворы БП № с 1 по 7 для установления ГХ сохраняются в пробирках с притертыми пробками в течение месяца при температуре ниже 10 °С в темном месте (в холодильнике).
Градуировочная характеристика выражает зависимость между суммарной площадью аналитических пиков БП (403 нм и 406 нм) и массовой концентрацией БП в растворе.
Градуировочную характеристику устанавливают при внедрении методики, после проведения ремонта прибора, а также в случае получения неудовлетворительного результата при контроле стабильности градуировочной характеристики, но не реже 1 раза в три месяца.
Для установления градуировочной характеристики проводят измерения аналитических сигналов для семи градуировочных растворов БП (табл. 3), приготавливая и замеряя каждый раствор не менее двух раз.
Условия записи спектров флуоресценции градуировочных растворов:
длина волны возбуждения — 388 нм;
диапазон спектра флуоресценции — от 395 до 420 нм;
скорость сканирования — 50 — 60 нм/мин. (выбирается одно значение в указанном диапазоне);
щели возбуждения и эмиссии — по 2,5 нм;
напряжение на фотоумножителе — 700 или 750 В (выбирается одно значение согласно рекомендациям Руководства по прибору);
число сканирований для получения усредненного спектра — 2.
В фирменную кювету вносят 0,1 куб. см градуировочного раствора, вставляют в низкотемпературную приставку спектрофлуориметра и производят запись спектра флуоресценции БП.
Наблюдают аналитические пики БП при 403 нм и 408 нм (неразделяемые). Проводят линию основания для этих двух пиков и подсчитывают их площадь над линией основания по программе прибора. Обычно эта линия основания проводится от одного перегиба при 398 нм до другого при 414 нм.
Значения площади аналитических пиков БП для i-того градуировочного раствора признают приемлемыми, если разность между наибольшим и наименьшим значениями не превышает установленный норматив приемлемости (для P = 0,95):
S - S
грimax грimin
----------------- х 100 <= 20, (12)
S
грi
где:
S , S - соответственно максимальное и минимальное значения
грimax грimin
площадей аналитических пиков БП для i-того градуировочного раствора, ед.
счета; S — среднеарифметическое значение площади аналитических пиков БП, грi ед. счета.
Линейная зависимость считается установленной, если градуировочная характеристика выражается уравнением:
где:
S - площадь аналитических пиков БП, ед. счета (среднеарифметическое
значение); C — массовая концентрация БП в градуировочном растворе, мкг/куб. см; БП ед. счета k — градуировочный коэффициент, -----------. мкг/куб. см
Расчет коэффициента k проводят с использованием программы прибора или Excel.
2
Величина достоверности аппроксимации (R ) при построении прямой должна быть не ниже 0,90. Градуировочную характеристику признают приемлемой, если знаки разностей (S - k C ) чередуются и не превышают установленный i БПi
норматив:
100 х |S - k C | / k C <= 20, (14) i БПi БПi
где:
i - номер градуировочного раствора (i = 1, 2,..., n);
C - массовая концентрация БП в i-том градуировочном растворе,
БПi
мкг/куб. см.
16. Отбор проб воздуха
17. Выполнение измерения
17.1 Экстракция БП — по 10.1.
17.2 Получение раствора пробы в н-октане — по п. 10.2.
17.3. Количественное определение БП методом добавок проводят, записывая спектр н-октанового раствора пробы и спектр этого раствора с добавкой БП, вводимой в виде соответствующего градуировочного раствора БП.
17.4 Расчет величины добавки БП
Записывают спектр н-октанового раствора пробы и определяют площадь аналитических пиков БП. По градуировочной характеристике определяют соответствующее этой площади значение массовой концентрации БП в н-октановом растворе пробы (в мкг/куб. см):
C* = S / k, (15) р.п. р.п. где C* - ориентировочное значение массовой концентрации БП в
р.п.
н-октановом растворе пробы, с помощью которого рассчитывают величину добавки.
Подбирают размер добавки, при которой массовая концентрация БП в н-октановом растворе пробы с добавкой (C ) в 1,5 - 2,5 раза
р.п.+доб.
превышает C* . Отбирают 1 куб. см н-октанового раствора пробы в пробирку р.п. с притертой пробкой или бюкс вместимостью 5 куб. см.
При подборе величины добавки БП руководствуются выражением:
(C* х V + V )
р.п. р.п. гр
C = ---------------------, (16)
р.п.+доб. V + V
р.п. гр
где:
V - объем н-октанового раствора пробы, смешиваемый с градуировочным
р.п.
раствором БП, куб. см (V = 1 куб. см); р.п. C — массовая концентрация БП в выбранном градуировочном растворе, гр мкг/куб. см; V — объем градуировочного раствора БП, куб. см. гр
Примечание. При C = 1,5 C* для вычисления V может быть р.п.+доб. р.п. гр
использована формула, выведенная из формулы (16):
0,5C*
р.п.
V = ----------------. (17) гр (C - 1,5C* ) гр р.п. Концентрация градуировочного раствора, используемого для добавки выше 1,5C* , обычно равна 0,050 - 0,010 мкг/куб. см. Объем добавки к 1 куб. см
р.п.
раствора пробы составляет от 0,1 до 0,5 куб. см, измеряют его соответствующим дозатором. Аликвоту пробы и добавку градуировочного раствора БП тщательно перемешивают, в кювету помещают 0,1 куб. см раствора
пробы.
Записывают спектр БП и определяют площадь аналитических пиков БП, как описано в п. 15.2 (она не должна выходить за пределы ГХ).
18. Вычисление результата измерений
Массовую концентрацию БП в октановом растворе пробы (C , мкг/куб. р.п. см) вычисляют по формуле:
C = C х S / S = C / Z, (18) р.п. р.п.+доб. р.п. р.п.+доб. р.п.+доб.
где:
C - массовая концентрация БП в н-октановом растворе пробы с
р.п.+доб.
добавкой, мкг/куб. см; S — площадь аналитических пиков БП в спектре н-октанового раствора р.п. пробы, ед. сч.; S — площадь аналитических пиков БП в спектре н-октанового р.п.+доб. раствора пробы с добавкой, ед. сч.; Z — соотношение площадей аналитических пиков БП в спектрах н-октанового раствора пробы с добавкой и н-октанового раствора пробы (S / р.п.+доб. S ). р.п.
Z = S / S . (19) р.п.+доб. р.п.
Преобразовывают формулу (18), подставляя в нее известные значения:
C х V
гр гр
C = -------------------------.
р.п. Z х (V + V ) - V
р.п. гр р.п.
Содержание БП в пробе (m, мкг) рассчитывают по формуле:
V
р.п.
m = C х ----- х V , р.п. V э
а
где:
V - объем н-октанового раствора пробы, куб. см;
р.п.
V - объем аликвоты исходного экстракта, взятой на анализ, куб. см;
а
V - объем исходного экстракта, куб. см.
э
Массовую концентрацию БП в воздухе (C, мг/куб. м) рассчитывают по п. 11.2.
19. Оформление результатов анализа
См. п. 12.
20. Контроль погрешности
20.1. Периодический контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль проводят в соответствии с планом внутрилабораторного контроля. Рекомендуемая первоначальная частота контроля один раз в 6 месяцев.
При проведении измерений по Варианту II для контроля стабильности используют 2 градуировочных раствора из табл. 3. Для каждого раствора выполняют замеры, как описано в п. 15.2.
Результаты контроля считают положительными при выполнении для каждого измерения следующего условия:
|(S / k) - C |
к кр
---------------- х 100 <= 30, (21)
C
кр
где:
S - площадь аналитических пиков БП, ед. сч.;
к
C - массовая концентрация БП в градуировочном растворе, мкг/куб. см.
кр
При превышении норматива измерения приостанавливают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их, затем повторяют контрольные измерения или устанавливают новую градуировочную характеристику.
20.2. Контроль повторяемости результатов измерений массы БП в экстракте пробы
См. п. 13.2.
21. Нормы затрат времени на анализ
Для проведения серии анализов из 5-ти отобранных проб воздуха рабочей зоны потребуется 3 часа.
Для выделения фракции БП применяют тонкослойную хроматографию в незакрепленном слое оксида алюминия или специальные патроны Диапак.
22. Хроматографическое разделение веществ экстракта пробы методом тонкослойной хроматографии в незакрепленном слое оксида алюминия 2-ой степени активности по Брокману
Стеклянную пластинку (9 на 12 см), предварительно обработанную н-гексаном, устанавливают на специальную подставку, насыпают оксид алюминия фракции с размерами частиц 0,05 — 0,08 мм. С помощью металлического валика адсорбент равномерно раскатывают по пластинке до получения слоя толщиной 0,5 — 1,0 мм.
Исходный экстракт пробы в объеме 0,25 — 0,50 куб. см количественно наносится на пластинку в виде узкой стартовой линии на расстоянии 15 мм от края. Чтобы избежать большого расширения стартовой полосы повторные нанесения делают только после полного улетучивания растворителя из предыдущего нанесения. Для выравнивания стартовой линии после полного нанесения экстракта пластину 2 — 3 раза помещают на несколько секунд в хроматографическую камеру с диэтиловым эфиром или подвижной фазой, дожидаясь каждый раз, пока фронт растворителя продвинется до верхнего края стартовой полосы, после каждого раза пластину подсушивают на воздухе до полного улетучивания растворителя. На расстоянии не менее 15 мм от полосы справа наносят в качестве свидетеля каплю раствора БП с концентрацией 0,05 мкг/куб. см.
Пластинку помещают под углом в 30 град. в герметически закрытую камеру, в которую заранее заливают подвижную фазу. Пластинку в камере устанавливают так, чтобы жидкость на 5 мм не доходила до линии старта. В качестве подвижной фазы используется: гексан — бензол (10:1).
Подвижная фаза пропускается через пластинку трижды: на 1/3 пластинки, на 2/3 пластинки, на всю пластику. Перед каждым последующим прохождением подвижной фазы пластинку подсушивают в тяге. После окончания фракционирования пластину освещают ультрафиолетовым светом и иглой разделяют на зоны, отличающиеся по цвету флуоресценции. Зона БП определяется по свидетелю. Обычно БП содержится в одной зоне, но следует проверить его содержание и в рядом расположенных зонах.
Оксид алюминия анализируемых зон снимают тонкой металлической лопаточкой в стеклянные колонки с расширенной верхней частью и с тампоном из чистой ваты в нижней части или в воронке с пористым фильтром, вставленные в пробирки. Элюирование БП с сорбента проводят диэтиловым эфиром. Контролем для прекращения элюирования является отсутствие флуоресценции у вытекающего растворителя под действием УФ света. Пробирки помещают в водяную баню с температурой не выше 50 °С и испаряют диэтиловый эфир, добавляя 1 куб. см октана, чтобы БП оставался всегда в растворителе. После испарения эфира добавляют еще 1 куб. см октана.
Диапак проводится согласно прилагаемой к ним инструкции
24. Количественное определение БП в полученных фракциях
проводят по Вариантам I или II
25. Нормы затрат времени на анализ
Для проведения серии анализов из 5-ти отобранных проб воздуха рабочей зоны потребуется 6 часов.
Методические указания разработаны:
Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий, г. Екатеринбург, ОАО «Всероссийский алюминиево-магниевый институт», сектор санитарно-промышленного и экологического контроля, ООО «Л и И», лаборатория «САНЭК».