МУК 4.1.2204-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина A в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 20.05.2007)

20 мая 2007 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОБНАРУЖЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА A В ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2204-07

1 августа 2007 года

1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А. Тутельян, д.х.н. К.И. Эллер, к.м.н. И.В. Аксенов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 мая 2007 г. и введены в действие с 1 августа 2007 г.

4. Введены впервые.

Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определения охратоксина A в продовольственном сырье и пищевых продуктах и предназначены для проведения лабораторных исследований учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в организациях, осуществляющих контроль безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Охратоксин A — микотоксин, продуцируемый микроскопическими грибами родов Aspergillus и Penicillium. Основными продуцентами охратоксина A являются A. ochraceus и P. verrucosum.

Охратоксин A ( \text{С}_{20}H_{18}ClNO_{6} ; молекулярная масса 403,8), представляющий собой по химической структуре 5-хлоризокумарин, связанный пептидной связью с L-фенилаланином, хорошо растворим в полярных органических растворителях и водном растворе гидрокарбоната натрия, малорастворим в воде. При фотометрировании раствора охратоксина A в толуол-уксусной кислоте (99:1) максимум поглощения наблюдается при длине волны, равной 333 нм, при этом относительный молярный коэффициент поглощения равен 544 м2/моль.

В экспериментах in vivo показано нефротоксическое, канцерогенное, тератогенное, эмбриотоксическое, нейротоксическое и иммунотоксическое действие охратоксина A. Международное агентство по изучению рака классифицирует охратоксин A как соединение, потенциально канцерогенное для человека (Группа 2B). Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам установлена величина условно переносимого недельного поступления охратоксина A с пищей — 100 нг/кг массы тела.

Охратоксин A выявляется повсеместно в качестве природного загрязнителя продовольственного и кормового зерна, кофе и какао-бобов, винограда и специй.

Метод включает следующие этапы:

• экстракция охратоксина A из пробы смесью ацетонитрил-вода (60:40% об.);
• очистка экстракта на иммуноаффинной колонке;
• определение охратоксина A с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием при длине волны возбуждения (\lambda_{\text{возб}.}) 333 нм и длине волны эмиссии (\lambda_{\text{эмис}.}) 466 нм.

Диапазон определяемых концентраций: 0,0001 — 0,016 мг/кг.

Предел количественного определения: 0,0005 мг/кг.

Таблица

для разных концентраций охратоксина A в пробе

4.1 Средства измерений

4.2 Вспомогательное оборудование

4.3 Реактивы и материалы

5.1 Приготовление стандартных растворов охратоксина A

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина A — 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина A массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см3, приливают 50 см3 смеси толуол — уксусная кислота (98:2% об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (\text{Д}_{333}) . Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

\text{с} = \frac{\text{Д}_{333} \cdot 403,8 \cdot 100}{544} ,\text{нг}/\text{мкл}

Далее 5 см3 стандартного раствора охратоксина A с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол — уксусная кислота (98:2% об.) до объема 100 см3, получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина A с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см3 подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина A содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °C) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °C) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

5.2 Приготовление фосфатного буферного раствора, pH = 7,4

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 10 — 20 см3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения — 1 месяц в холодильнике.

5.3 Приготовление смесей растворителей

Толуол-уксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения — 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил — вода (60:40% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения — 1 месяц в темном прохладном месте.

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят pH смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения — 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол-уксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения — 1 месяц в темном прохладном месте.

6.1 Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

• «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83;
• «Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84;
• «Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88;
• «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70.

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2 Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1 — 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1 Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см3, добавляют 100 см3 смеси ацетонитрил-вода (60:40% об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см3 фильтрата и добавляют 90 см3 фосфатного буферного раствора, pH = 7,4.

6.2.2 Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 — 2 капли в секунду, промывают 20 см3 фосфатного буферного раствора, pH = 7,4. Охратоксин A элюируют 3 см3 смеси метанол-уксусная кислота (98:2% об.).

7.1 Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2 Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза — ацетонитрил — вода (60:40% об.; pH = 3,0); скорость подвижной фазы — 1,5 см3/мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином A, рассчитывают массу охратоксина A во вколе с помощью градуировочного графика.

8. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ

8.1 Построение градуировочной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина A. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина A во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина A в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина A во вколе).

8.2 Оформление результатов

\text{С}_{(\text{охр}.\text{А})} = \frac{m \cdot V_{1} \cdot V_{3}}{M \cdot V_{2} \cdot V_{4} \cdot 1000} , где

\text{С}_{(\text{охр}.\text{А})} — концентрация охратоксина A в пробе, мг/кг;

m — масса охратоксина A, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;

V_{1} — объем раствора для экстракции, см3 (100);

V_{2} — объем экстракта, нанесенный на ИАК, см3 (10);

При высоких уровнях загрязнения охратоксином A пробы необходимо увеличить объем раствора А (V_{3}) с внесением соответствующих изменений в формулу.

За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений:

\overline{X} = (\text{С}_{(\text{охр}.\text{А})1} + \text{С}_{(\text{охр}.\text{А})2})/2,\text{мг}/\text{кг}

Результат анализа представляют в виде (при вероятности P = 0,95):

(\overline{X} \pm \Delta),\text{мг}/\text{кг}, где

\Delta = \delta \cdot \overline{X}/100,\text{мг}/\text{кг}

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

Если содержание охратоксина A в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание охратоксина A в пробе зерна менее 0,0001 мг/кг» <*>

<*> 0,0001 мг/кг — предел обнаружения.

8.3 Проверка приемлемости результатов

параллельных определений

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (табл. 1):

R = 0,01(r,\%) \cdot \overline{X},\text{мг}/\text{кг}

|\text{С}_{(\text{охр}.\text{А})1} - \text{С}_{(\text{охр}.\text{А})2}| \leq R,

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина A, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 — 100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (\text{С}_{(\text{охр}.\text{А})}) и пробы с добавкой (\text{С}(\prime_{\text{охр}.\text{А}})) . Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит одни аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (\text{С}(\prime_{\text{охр}.\text{А}})) , пробы без добавки (\text{С}_{(\text{охр}.\text{А})}) и величиной добавки (\text{С}_{\text{доб}.(\text{охр}.\text{А})}) с нормативом оперативного контроля (K). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при P = 0,95):

|\text{С}(\prime_{\text{охр}.\text{А}}) - \text{С}_{(\text{охр }.\text{А})} - \text{С}_{\text{доб }.(\text{охр }.\text{А})}| \leq K

K = 0,84 \cdot (\Delta^{2}\text{С}(\prime_{\text{охр}.\text{А}}) + \Delta^{2}\text{С}_{(\text{охр }.\text{А})})^{1/2}

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

При выполнении анализов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021.

11. ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ИСПОЛНИТЕЛЯ

К выполнению анализа охратоксина A в зерне и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.

12. УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ