МУК 4.1.2116-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации стирола в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 09.08.2006)

9 августа 2006 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В ПРОБАХ КРОВИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Область применения

Методические указания по определению концентрации стирола в крови предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием стирола в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «ГСОЕИ. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р 1.5-92 «ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика выполнения измерений обеспечивает определение стирола в диапазоне концентраций 0,1 — 5,0 мкг/куб. см с погрешностью, не превышающей 23%, при доверительной вероятности Р = 0,95.

    C H CHCH                                              Мол. масса 103,7.
     6 5    2

Стирол (винилбензол, фенилэтилен) — бесцветная жидкость с резким запахом. Температура кипения: 145 °С, плотность 0,9059. Растворяется в большинстве органических растворителей, растворимость в воде 0,032% по объему (20 °С) [1]. Стирол оказывает общетоксическое, сенсибилизирующее, эмбриотропное, раздражающее действия, отрицательно влияет на ЦНС, обладает кумулятивным эффектом [2].

2. Сущность метода

Методика основана на извлечении стирола из крови экстракцией гексаном и анализе экстракта на жидкостном хроматографе.

Измерение концентрации стирола выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.

Нижний предел измерения — 0,001 мкг.

Определению не мешают фенол, бензол, толуол, этилбензол, ксилолы, карбоновые кислоты.

Длительность анализа, включая пробоподготовку, — 20 мин.

реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

3.1 Средства измерений

Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления и ультрафиолетовым детектором

Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-01

Гири Г -210 ГОСТ 7328-01 2

Микрошприцы МШ-10 ТУ 2.833.106-00

Колбы мерные вместимостью 50 куб. см ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные вместимостью 1, 5, 10 куб. см ГОСТ 29227-91

Редуктор кислородный ТУ 26-05-236-73

Аттестованная смесь стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,00 мг/куб. см ГСО МСО 0056.1998.

3.2 Вспомогательные устройства

Колонка стеклянная длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon SGX C зернением 7 мкм 18

Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон"                    ТУ 9443-001-245.23530-97
Экстрактор ПЭ-8                                    ТУ 3614-001-23050963-97
Дистиллятор                                        ТУ 61-1-721-79
Сушильный шкаф ШСС-80                              ТУ 16.531.743-83

Воронки делительные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 23932-90

Воронка Шотта (пор 16) ГОСТ 25336-82

Бюксы СВ 19/9 ТУ 92-891.029-91

Пробирки центрифужные пропиленовые с завинчивающейся крышкой, производство «Sarstedt», Германия.

3.3 Реактивы

Гексан для хроматографии, осч                            ТУ 6-09-4521-77
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, осч            ТУ 6-09-14-2167-84

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Гидроксид натрия, хч ГОСТ 4328-77

Спирт этиловый ГОСТ Р 51652-2000

Серная кислота ГОСТ 4204-77

Калия дихромат, хч ГОСТ 4220-75

Раствор гепарина в ампулах (5000 ед. в 1 куб. см).

3.4 Материалы

Гелий газообразный ТУ 51-940-80.

3.5 Растворы

Элюент для хроматографии

Раствор гидроксида натрия, 10%-й

Раствор дихромата калия в серной кислоте, 3%-й.

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химреактивов и материалов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным.

4. Требования к безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и меры безопасности, указанные в «Руководстве по правилам эксплуатации прибора».

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и владеющие техникой жидкостно-хроматографического анализа.

6. Условия измерений

6.1 При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

• температура воздуха 15 — 25 °С;
• атмосферное давление 630 — 800 мм рт. ст.;
• влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С.

6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1 Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе двухромовокислого калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.

7.2 Приготовление растворов

7.2.1. Элюент для хроматографии. Смешивают 60 куб. см ацетонитрила с 40 куб. см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 3 — 5 мин. со скоростью 50 — 60 куб. см/мин.

7.2.2. Раствор гидроксида натрия 10%-й. Вносят в мерный стакан с меткой на 100 куб. см 10 г гидроксида натрия, прибавляют 90 куб. см дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана до полного растворения гидроксида натрия. Срок хранения раствора — 30 дней при 4 °С.

7.2.3. Раствор двухромовокислого калия в серной кислоте 3%-й. Растворяют 3,0 г двухромовокислого калия в 53 куб. см концентрированной серной кислоты (плотность 1,84). Использовать свежеприготовленный раствор.

7.3 Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.2.1, со скоростью 0,6 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

7.4 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации стирола в крови, устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят разбавлением аттестованной смеси стирола в этиловом спирте (растворы А, Б).

7.4.1. Приготовление раствора А: 1 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.2. Приготовление раствора Б: 10 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.3. В соответствии с п. 8 проводят анализ образца крови на отсутствие стирола. Объем образца крови для приготовления градуировочных смесей должен быть не менее 12 куб. см. Образец крови с гепарином (из расчета 0,05 куб. см гепарина на 2 куб. см крови) может храниться 2 дня при температуре 4 °С.

7.4.4. Для установления градуировочной характеристики в 2 куб. см крови добавляют 0,05 куб. см раствора гепарина, вносят раствор А или Б в соответствии с табл. 1 и помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Содержимое воронки перемешивают экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме прибора.

Режим работы хроматографа:

    колонка  стеклянная  длиной  150  мм  и  внутренним  диаметром  3,3 мм,
заполненная сорбентом Separon SGX С  ;

                               18

подвижная фаза — ацетонитрил/вода в соотношении 60:40;

скорость подвижной фазы — 0,6 куб. см/мин.;

длина волны УФ-детектора — 254 нм;

время выхода стирола в заданных условиях — 6 мин.

Градуировочную характеристику устанавливают с помощью градуировочного коэффициента, который рассчитывают по формуле:

                             n

                                SUM C  / S
                                i=1  i    i

K = -----------, n

где:
C  - заданная концентрация стирола в градуировочной смеси, мг куб./дм;
 i
S   -  среднее значение трех измерений площади пика, кв. мм или единицы
 i

оптической плотности (е.о.п.); n — количество градуировочных смесей (n = 6).

Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.5 Отбор проб

Отбор проб венозной крови в объеме 4 куб. см производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно вносят 0,1 куб. см раствора гепарина. Срок хранения проб в холодильнике — не более 2-х суток.

8. Выполнение измерений

Проводят два параллельных измерения образца крови: 2 куб. см крови помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Перемешивают содержимое воронки экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме хроматографа, указанном в п. 7.4.4.

Идентификация хроматографического пика стирола проводится путем сопоставления времен удерживания хроматографических пиков в стандартном растворе стирола и в анализируемой пробе.

9. Вычисление результатов измерения

Концентрацию стирола в крови (мг/куб. дм) вычисляют по формуле:

Х = S х K, i

где:
Х - концентрация стирола в анализируемой пробе, мг/куб. дм;
S  - площадь пика стирола на хроматограмме, кв. мм или е.о.п.;
 i
K - градуировочный коэффициент.

    За  результат  измерения принимают среднее арифметическое значение двух
параллельных  определений Х   , Х   ,  расхождение между которыми не должно
                           max   min

превышать значения предела повторяемости r (табл. 2). n _

Результат измерения представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА) мг/куб. дм, где:

                                                   Х   + Х
    _                                          _    max   min

Х - средний результат анализа, мг/куб. дм, Х = -----------;
                                                    2
ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мг/куб. дм, при Р = 0,95, равная:

                                        _
                                сигма х Х

ДЕЛЬТА = ---------, 100

где сигма - относительное значение характеристики погрешности, %.

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений — повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность — осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 «ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95

Таблица 3

ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

10.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствует началу, середине и концу диапазона измерений. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2 Контроль повторяемости

    Относительное    расхождение   между   результатами   двух   измерений,
выполненных  в  соответствии  с  методикой  одним  оператором при измерении
образцов  одной  и  той  же  рабочей пробы  с использованием одних и тех же
средств  измерений  и  реактивов  в течение возможно минимального интервала

времени, не должно превышать значения предела повторяемости r (табл. 2). n

Повторяемость результатов параллельных определений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

                                   r     Х    + Х
                                    n     max    min
                    Х    - Х    <= --- х -----------,
                     max    min    100        2

где:
r  - значение предела повторяемости, %;
 n

    Х   , Х    - максимальный  и  минимальный  результаты двух параллельных
     max   min

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3 Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

                                    R     _    _
                                     _    Х  + Х
                        _    _       Хl    1    2
                       |Х  - Х | <= --- х -------,
                         1    2     100      2

где:
_
Х   -  средний  результат  анализа  рабочей  пробы  из 2-х параллельных
 1

измерений, мг/куб. дм; _ Х — средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 2 измерений, полученный в других условиях, мг/куб. дм; R _ — значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, % (табл. Хl

2).

                                               _    _
    Расхождение  между  результатами измерений Х  и Х , полученных в разных
                                                1    2
условиях, не должно превышать значений показателя   воспроизводимости   R

                                                                     _
                                                                     Хl

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.4 Контроль точности

    Контроль  точности  с использованием метода добавок состоит в сравнении
результата   контрольной  процедуры,  равного  разности  между  результатом
контрольного  измерения  содержания  определяемого  компонента  в  пробе, с
                      _                                     _
известной  добавкой  (Х'),  в  рабочей  пробе  без добавки (Х) и  величиной
добавки   С    (добавка  должна  составлять  не  менее  40%  от  содержания

       д

анализируемого  компонента  в  рабочей  пробе)  с  нормативом  точности  К.
Результаты   контроля   признаются  удовлетворительными,  если  выполняется

условие: _ _

|Х' — Х - С | = K , д k

где:
_

    Х'  - средний результат контрольного измерения содержания определяемого
компонента  в  рабочей  пробе  с  известной  добавкой  из  2-х параллельных

измерений, мг/куб. дм; _ Х — средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мг/куб. дм; С — величина добавки к пробе, мг/куб. дм. д

                       _____________________________

                          /дельта   _ 2    дельта   _  2
             K = 0,84 х \/(------ х Х)  + (------ х Х') .
                             100             100

    Качество   контрольной   процедуры   признают   удовлетворительным  при
выполнении условия: K  <= K.

                 k

При превышении норматива контроля точности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Периодичность контроля воспроизводимости и точности регламентируется в руководстве по качеству лаборатории.

Литература

1. Химическая энциклопедия/Под. ред. Н.С. Зефирова. М.: «Большая российская энциклопедия», 1995. Т. 4.

2. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества: Справочник. М.: «Химия», 1976. Т. 1. С. 113 — 117.