МУК 4.1.2082-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Трибенурон-метила в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Актуально на 31.10.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.2082-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Трибенурон-метила в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии". МУК 4.1.2082-06. https://bukva.ai/docs/muk-4-1-2082-06
(утв. Роспотребнадзором 30.07.2006)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 1 сентября 2006 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
30 июля 2006 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТРИБЕНУРОН-МЕТИЛА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
1 сентября 2006 года
1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в семенах и масле подсолнечника Трибенурон-метила.
Производитель: Дюпон де Немур.
Торговое наименование препарата: Гранстар.
Название действующего вещества по номенклатуре ИСО: Трибенурон-метил.
Название действующего вещества по ИЮПАК: метил 2-[4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил(метил)карбамоилсульфамоил]бензоат.
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C H № O S. 15 17 5 6
Химически чистый Трибенурон-метил представляет собой белый порошок с легким горьковатым запахом.
Температура плавления: 142 °С. -5
Давление паров 5,2 х 10 мПа (при 25 °С). Растворимость в воде 0,05 г/л (pH 5), 2,04 г/л (pH 7), 18,3 г/л (pH 9)
(при 20 °С).
Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С): ацетон - -4 4 4 3,91 х 10 , ацетонитрил - 4,64 х 10 , этилацетат - 1,63 х 10 , метанол -
3
2,59 х 10 ; н-гептан — 20,8 мг/л (при 20 °С).
Трибенурон-метил — слабая кислота с рКа 4,7.
Стабилен при pH 9, гидролизуется при pH 5 с DT менее 1 дня, при pH 7 50
- DT — 15,8 дней при температуре 25 °С. Не наблюдается значительного 50 фотолитического разложения в диапазоне pH 5 — 9 при температуре 25°.
Трибенурон-метил - гербицид листового системного действия, подавляющий развитие двудольных сорняков в посевах злаковых культур, по механизму действия относится к ингибиторам ацетолактатсинтетазы, что приводит к прекращению деления клеток. Проникает в растения через листья, при
попадании на почву активности не проявляет.
Краткая токсикологическая характеристика: Трибенурон-метил относится к малоопасным веществам по острой пероральной токсичности (LD для крыс
50
5000 мг/кг) и острой дермальной токсичности (LD для кроликов > 5000 50 мг/кг), но к умеренно опасным по острой ингаляционной токсичности (LC для 50
крыс) (4 часа) > 5000 мг/куб. м воздуха. Не вызывает покраснения глаз у кроликов; слабо сенсибилизирует кожу гвинейских свиней. Не обладает
генотоксичностью.
В России для Трибенурон-метила установлены следующие гигиенические нормативы:
МДУ в зерне хлебных злаков — не допускается.
Рекомендуемый МДУ в семенах и масле подсолнечника — 0,02 мг/кг.
Зарегистрирован в России под торговым названием Гранстар, СТС. Рекомендован для борьбы с однолетними двудольными, бодяком полевым и однолетними злаковыми сорняками в посевах зерновых, включая пшеницу, ячмень и овес с нормой расхода 10 — 25 г/га. Препарат испытывается в посевах трансгенных сортов подсолнечника, устойчивых к Трибенурон-метилу.
1. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности) +/- дельта, %, Р = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости сигма , % r | Предел повторяемости r, % | Предел воспроизводимости R, % |
| Семена подсолнечника | 0,005 — 0,01 | 100 | 1,6 | 5 | 6 |
| 0,01 — 0,1 | 50 | 2,8 | 8 | 10 | |
| Масло подсолнечника | 0,005 — 0,01 | 100 | 2,0 | 6 | 7 |
| 0,01 — 0,1 | 50 | 2,5 | 7 | 9 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 | ||||
| Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение S, % | Доверительный интервал среднего результата +/-, % | |
| Семена подсолнечника | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 74,9 | 2,8 | 0,95 |
| Масло подсолнечника | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 80,2 | 2,6 | 0,97 |
2. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ
Метод основан на определении Трибенурон-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак С и Диапак С16). При недостаточной чистоте экстракта его очищают дополнительно на патроне Диапак Диол.
Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании подсолнечника.
3. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, РЕАКТИВЫ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА И МАТЕРИАЛЫ
3.1. Средства измерений
Весы аналитические ВЛА-200 — ГОСТ 34104-80Е.
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г — ГОСТ 19491-74.
Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см - ГОСТ 1770-74.
Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50 — 100 куб. мм.
Пипетки мерные на 1,0; 2,0 и 5,0 куб. см - ГОСТ 20292-74.
Потенциометр — pH-метр — 150М — ГОСТ 2261.
Хроматограф жидкостной Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу; № государственной регистрации 15311-02.
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50 и 100 куб. см - ГОСТ 1770.
Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Трибенурон-метил, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 97,7% (фирма Дюпон, США).
Ацетон, о.с.ч. — ТУ 2633-00-4-11291058-94.
Ацетонитрил, о.с.ч., УФ-205 нм — ТУ 6-09-2167-84.
Вода бидистиллированная, деионизированная — ГОСТ 7602-72.
Гексан, х.ч., для спектроскопии — ТУ 6-09-06-657-84.
Калий фосфорнокислый двузамещенный (K HPO ) — ГОСТ 2498-75. 2 4
Калий марганцовокислый, ч.д.а. — ГОСТ 20490-75.
Кальций хлористый, х.ч. — ГОСТ 4161-76.
Кислота ортофосфорная, х.ч. — ГОСТ 6552-80.
Кислота серная концентрированная, ч. — ГОСТ 4204-77.
Кислота уксусная ледяная — ГОСТ 61-75.
Метилен хлористый, х.ч. — ТУ 6-09-2662-77.
Натрия гидрокарбонат, х.ч. - ГОСТ 2156-76.
Натрий сернокислый безводный, х.ч. - ГОСТ 4166-76.
Натрий хлористый, х.ч. — ГОСТ 4233-77.
Концентрирующие патроны Диапак С (0,6 г) — ТУ 4215-002-05451931-94.
Концентрирующие патроны Диапак С16 (0,6 г) — ТУ 4215-002-05451931-94.
Концентрирующие патроны Диапак Диол (0,6 г) — ТУ 4215-002-05451931-94.
3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак С, Диапак Диол и Диапак С16 фирмы БиоХимМак.
Ванна ультразвуковая UM 4, фирма Unitra.
Воронки делительные на 250 и 500 мл — ГОСТ 25336-82Е.
Воронки конические стеклянные диаметром 50 — 60 мм — ГОСТ 25336-82Е.
Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.
Колбы конические плоскодонные на 500 и 1000 куб. см — ГОСТ 9737-70.
Концентраторы грушевидные и круглодонные объемом 50, 100 и 250 куб. см — ГОСТ 10394-75.
Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.
Предколонка хроматографическая стальная Symmetry С18 длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.
Испаритель ротационный Rotavapor R110 Buchi с водяной баней В-480.
Стаканы стеклянные на 100 — 500 куб. см — ГОСТ 25366-80Е.
Установка для перегонки растворителей.
Фильтры бумажные «красная лента», ТУ-6-09-1678-86.
Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма Уотерс, или аналогичные.
Флаконы полипропиленовые объемом 20 куб. см; 250 куб. см.
4. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
5. ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРОВ
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. ПОДГОТОВКА К ОПРЕДЕЛЕНИЮ
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетона.
Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (А. Гордон, Р. Форд, Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 438 — 439).
7.1.2 Очистка ацетонитрила.
7.1.3 Очистка гексана.
Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд, Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 441).
7.1.4 Очистка хлористого метилена.
Хлористый метилен встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают водным раствором карбоната натрия, водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют над оксидом (V) фосфора (А. Гордон, Р. Форд, Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 440)
7.1.5 Очистка бидистиллированной воды.
Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.
7.2. Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1. Приготовление буфера 0,05 М калия фосфорнокислого двузамещенного, pH 9.
В мерную колбу объемом 1000 куб. см помещают 800 куб. см дистиллированной воды и растворяют в ней 8,75 г М калия фосфорнокислого двузамещенного и 100 г натрия хлористого, доводят pH (по pH-метру) до 9, используя 1 М раствор едкого натра, после чего доводят раствор до метки дистиллированной водой.
7.2.2 Приготовление 10%-ного раствора ортофосфорной кислоты.
В мерную колбу объемом 100 куб. см помещают 50 куб. см дистиллированной воды и 10 г концентрированной (85%) ортофосфорной кислоты, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.
7.2.3 Приготовление 0,1%-ной ледяной уксусной кислоты в ацетоне.
В мерную колбу объемом 100 куб. см помещают 50 куб. см ацетона (свежеперегнанного над перманганатом калия) и 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят до метки ацетоном, еще раз перемешивают и используют для анализа.
7.3. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.
7.3.1 Приготовление 0,05%-ного раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу объемом 1,0 куб. дм помещают 500 куб. см очищенной воды и 0,5 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят до метки очищенной водой и еще раз перемешивают.
7.3.2 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.
В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 500 куб. см ацетонитрила и 500 куб. см раствора 0,05%-ной уксусной кислоты в очищенной воде. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
7.4. Приготовление градуировочных растворов
7.4.1. Стандартный раствор с концентрацией Трибенурон-метила 1,0 мг/куб. см.
Взвешивают 100 мг Трибенурон-метила в мерной колбе объемом 100 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор можно хранить в морозильной камере в течение шести месяцев.
7.4.2. Стандартный раствор с концентрацией Трибенурон-метила 10,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора Трибенурон-метила с концентрацией 1,0 мг/куб. см отбирают мерной пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в течение одного месяца.
7.4.3. Стандартные растворы Трибенурон-метила с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для построения калибровочной кривой.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см, и используют эти растворы для хроматографического исследования. Растворы готовят в стеклянных мерных колбах и затем переносят в полипропиленовые герметичные флаконы объемом 20 куб. см. Растворы в полипропиленовых герметичных флаконах можно хранить в холодильнике в течение 5 дней. В стеклянной таре Трибенурон-метил разрушается в течение рабочего дня.
7.4.4. Стандартные растворы Трибенурон-метила с концентрацией 2,0; 1,0; 0,5 и 0,2 мкг/куб. см для внесения в образцы семян и масла подсолнечника.
Для внесения в исследуемые образцы семян и масла подсолнечника готовят растворы Трибенурон-метила в ацетоне. Из раствора Трибенурон-метила в ацетонитриле с концентрацией 10 мкг/куб. см методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие 2,0; 1,0; 0,4; 0,2 мкг/куб. см Трибенурон-метила. Растворы готовят в стеклянных мерных колбах и затем переносят в полипропиленовые герметичные флаконы объемом 20 куб. см. Растворы для внесения в образцы готовят непосредственно перед проведением анализа и не хранят.
7.5. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Трибенурон-метила в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по стандартным растворам с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.
Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и хроматографируют в условиях п. 9.2. Проводят не менее 3 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Трибенурон-метила в растворе в мкг/куб. см.
7.6. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С, Диапак С16 и Диапак Диол для очистки экстрактов
7.6.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.
Патрон Диапак С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 5 куб. см ацетона и 5 куб. см смеси гексан — ацетон в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
7.6.1.1. Проверка хроматографического поведения Трибенурон-метила на концентрирующем патроне Диапак С.
Из стандартного раствора Трибенурон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор 1 добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают, и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.
Концентратор вновь тщательно обмывают 10 куб. см смеси гексан — ацетон в соотношении 9:1 и двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан — ацетон в соотношении 9:1, и смывы последовательно также вносят на патрон, собирая каждую фракцию в чистые концентраторы и хроматографируя их. Затем концентратор обмывают еще двумя порциями по 10 куб. см 0,1%-ной ледяной уксусной кислоты в ацетоне. Элюат после прохождения каждой порции собирают в чистые концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Трибенурон-метил, и объединяют их.
7.6.2. Подготовки концентрирующего патрона Диапак С16 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. При работе на патронах Диапак С16 используют очищенную воду.
Патрон Диапак С16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 1:1. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
7.6.2.1. Проверка хроматографического поведения Трибенурон-метила на концентрирующем патроне Диапак С16.
Из стандартного раствора Трибенурон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 5 куб. см воды. Смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют.
Концентратор вновь обмывают двумя порциями по 5 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 1:1 и каждую порцию раздельно вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в чистые концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Трибенурон-метил, и объединяют их.
7.6.3. Подготовка концентрирующего патрона Диапак Диол для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.
Патрон Диапак С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 5 куб. см ацетона и 5 куб. см смеси гексан — ацетон в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
7.6.3.1. Проверка хроматографического поведения Трибенурон-метила на концентрирующем патроне Диапак Диол.
Из стандартного раствора Трибенурон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор 1 объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают, и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.
Концентратор тщательно обмывают 10 куб. см смеси гексан — ацетон в соотношении 9:1 и двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан — ацетон в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патрон. Затем концентратор обмывают двумя порциями по 10 куб. см гексан — ацетон в соотношении 4:1, порции также последовательно наносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции собирают в чистые концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Трибенурон-метил, и объединяют их.
7.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 — 4 часа.
8. ОТБОР ПРОБ И ХРАНЕНИЕ ПРОБ
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Семена подсолнечника, подсушенные до стандартной влажности, хранят в тканевых мешочках в сухом защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Влажные семена замораживают и хранят в морозильной камере при -14 °С до 1 года. Пробы масла подсолнечника хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 10 суток.
9. ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
9.1. Семена подсолнечника
9.1.1 Экстракция.
Образец измельченных семян подсолнечника массой 20 г помещают в полипропиленовый флакон объемом 250 куб. см, прибавляют 75 куб. см гексана и помещают в ультразвуковую ванну, нагретую до температуры 30 °С, на 10 минут. Затем флакон встряхивают 10 минут на механическом встряхивателе при комнатной температуре, центрифугируют 5 минут при скорости 4000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см, и экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
К маслянистому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 20 куб. см гексана, обмывают стенки концентратора и переносят раствор в делительную воронку объемом 250 куб. см. Концентратор обмывают еще двумя порциями гексана объемом 20 и 10 куб. см и объединяют все смывы в делительной воронке.
Трибенурон-метил экстрагируют из гексанового раствора тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 куб. см. После полного разделения слоев в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
К маслянистому остатку в концентраторе прибавляют 20 куб. см гексана, обмывают стенки концентратора и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 куб. см. Концентратор обмывают еще двумя порциями гексана объемом 20 и 10 куб. см и объединяют все смывы в делительной воронке.
В ту же делительную воронку прибавляют 20 куб. см фосфатного буфера (pH 9) и интенсивно встряхивают 2 минуты. Оставляют делительную воронку на 5 минут при комнатной температуре для лучшего разделения слоев. Затем нижний водный слой с эмульсией помещают в химический стакан объемом 200 куб. см. Из оставшегося гексанового слоя Трибенурон-метил экстрагируют еще двумя порциями фосфатного буфера (pH 9), встряхивая каждый раз делительную воронку 2 минуты, оставляя после встряхивания воронку на 5 минут при комнатной температуре и сливая водную фракцию в химический стакан. Гексан отбрасывают, нижние водные слои с эмульсией объединяют и переносят в чистую делительную воронку.
К водной фракции в делительную воронку прибавляют 100 куб. см гексана, встряхивают содержимое 2 минуты и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем нижний водный слой с небольшим количеством эмульсии собирают в химический стакан объемом 200 куб. см, гексан отбрасывают. Водную фазу с эмульсией возвращают в делительную воронку. Туда же прибавляют 30 куб. см фосфатного буфера, 50 куб. см гексана, интенсивно встряхивают делительную воронку 2 минуты и оставляют при комнатной температуре до полного разделения слоев (приблизительно 10 минут). Нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 куб. см, верхний гексановый слой отбрасывают.
Водный экстракт возвращают в воронку и подкисляют 10%-ной ортофосфорной кислотой до pH 4 (по pH-метру). Подкисление следует проводить как можно быстрее, чтобы минимизировать возможность гидролиза Трибенурон-метила в кислом водном растворе. Трибенурон-метил экстрагируют тремя порциями свежеперегнанного хлористого метилена объемом по 30 куб. см, интенсивно встряхивая каждый раз делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения слоев нижний слой хлористого метилена объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16.
9.1.3.1 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С.
Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают двумя порциями смеси гексан — ацетон в соотношении 9:1 по 10 и 5 куб. см и также вносят на патрон. Элюаты отбрасывают.
Трибенурон-метил элюируют с патрона 10 куб. см 0,1%-ной уксусной кислоты в ацетоне, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.1.3.2 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С16.
Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 5 куб. см воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор обмывают 5 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюаты собирают в концентратор, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.1.3.3 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак Диол.
Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают 10 куб. см смеси гексан — ацетон в соотношении 9:1 и также вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают 10 куб. см смеси гексан — ацетон в соотношении 4:1 и также вносят на патрон. Все элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и аликвоту 20 куб. мм вводят в хроматограф.
После хроматографирования каждой пробы следует промывать колонку не менее 40 минут.
9.2. Масло подсолнечника
9.2.1 Экстракция.
Образец масла подсолнечника массой 20 г помещают в химический стакан объемом 100 мл, прибавляют 40 куб. см гексана, тщательно перемешивают и переносят в сухую делительную воронку объемом 250 куб. см. Затем химический стакан обмывают тремя порциями гексана объемом по 20 куб. см и объединяют с раствором в делительной воронке. Трибенурон-метил экстрагируют из гексанового раствора тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 куб. см. После полного разделения слоев в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
К маслянистому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 20 куб. см гексана, обмывают стенки концентратора и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают еще двумя порциями гексана объемом 20 и 10 куб. см и объединяют все смывы в делительной воронке. В ту же делительную воронку прибавляют 20 куб. см фосфатного буфера (pH 9) и интенсивно встряхивают 2 минуты. Оставляют делительную воронку на 5 минут при комнатной температуре для лучшего разделения слоев. Затем нижний водный слой с эмульсией помещают в химический стакан объемом 200 куб. см.
Из оставшегося гексанового слоя Трибенурон-метил экстрагируют еще двумя порциями фосфатного буфера (pH 9), встряхивая каждый раз делительную воронку 2 минуты и оставляя после встряхивания воронку на 5 минут при комнатной температуре. Гексан отбрасывают, нижние водные слои с эмульсией объединяют и переносят в делительную воронку.
Прибавляют в делительную воронку 100 куб. см гексана, встряхивают содержимое 2 минуты и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем нижний водный слой с небольшим количеством эмульсии собирают в химический стакан объемом 200 куб. см, гексан отбрасывают. Водную фазу с эмульсией возвращают в делительную воронку. Туда же прибавляют 30 куб. см фосфатного буфера, 50 куб. см гексана, интенсивно встряхивают делительную воронку 2 минуты и оставляют при комнатной температуре до полного разделения слоев (приблизительно 10 минут). Нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 куб. см, верхний гексановый слой отбрасывают.
Водный экстракт подкисляют 10%-ной ортофосфорной кислотой до pH 4 (по pH-метру) и возвращают в воронку. (Подкисление следует проводить как можно быстрее, чтобы минимизировать возможность гидролиза Трибенурон-метила в кислом водном растворе.) Трибенурон-метил экстрагируют тремя порциями свежеперегнанного хлористого метилена объемом по 30 куб. см, интенсивно встряхивая каждый раз делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения слоев нижний слой хлористого метилена объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16.
Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 1 куб. см ацетона, добавляют 9 куб. см гексана и очищают на патронах Диапак С, Диапак С16 и Диапак Диол, как указано в п. 9.1.3.1, 9.1.3.2 и 9.1.3.3. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.
После хроматографирования каждых двух проб следует промывать колонку не менее 40 минут.
9.3. Условия хроматографирования
Хроматограф «Waters» или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.
Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.
Предколонка стальная Symmetry RP18, 3,9 мм х 2 см, зернением 5 мкм.
Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05%-ная уксусная кислота в соотношении 1:1.
Время удерживания Трибенурон-метила: 9,1 — 9,6 мин.
Чувствительность 0,005 ед. оптической плотности на шкалу.
Объем вводимой пробы 20 куб. мм.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Содержание Трибенурон-метила рассчитывают по формуле:
Sпр х А х V
Х = ------------- х Р, 100 х Sст х m
Х — содержание Трибенурон-метила в пробе, мг/кг;
Sст — высота (площадь) пика стандарта, мм;
Sпр — высота (площадь) пика образца, мм;
А — концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г;
Р — содержание Трибенурон-метила в аналитическом стандарте, %.
11. ПРОВЕРКА ПРИЕМЛЕМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результат анализа представляют в виде:
_
(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности Р = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,1 мг/кг» <*>.
<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения.
13. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = Х' - Х - С , к д _ _ где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
______________________
/ 2 2 К = \/ ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в
условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
таблица 1), %.
14. РАЗРАБОТЧИКИ
Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева. Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов».