МУК 4.1.2070-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Диквата в клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Роспотребнадзором 05.05.2006)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 1 июля 2006 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
5 мая 2006 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИКВАТА В КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
1 июля 2006 года
1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в картофеле массовой концентрации диквата в диапазоне 0,025 — 0,05 мг/кг.
Дикват — действующее вещество препарата Реглон Супер, ВР (150 г/л), фирма — производитель Сингента АГРО АГ, Швейцария.
1,1'-этилен-2,2'-дипиридилий; 9,10-дигидро-8а,10а-диазонийфенантрен; (ИЮПАК).
Структурная формула не приводится.
Мол. масса 184,2. 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилий используется в виде дибромида: 1,1-этилен-2,2-дипиридилий дибромид (ИЮПАК).
Структурная формула не приводится.
C H N Br 12 12 2 2
Химически чистый дикват дибромид - гигроскопическое белое кристаллическое вещество с температурой разложения 300 °C. Давление паров: менее 0,01 мПа (моногидрат). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = -4,60.
ow
Хорошо растворим в воде (700 г/куб. дм), плохо в спиртах и практически нерастворим в неполярных органических растворителях.
Вещество стабильно в нейтральном и кислом растворах, но легко гидролизуется в щелочной среде. Разлагается под действием УФ-облучения (DT менее недели).
50
Сильно связывается почвами и быстро разрушается почвенными микроорганизмами (DT не адсорбированного диквата менее недели).
50
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 408 мг/кг, для мышей — 50 234 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс > 800 мг/кг. 50 Вызывает раздражение кожи и глаз у кроликов. Мало токсичен для птиц, рыб, пчел, дождевых червей и водорослей.
Дикват дибромид — контактный гербицид сплошного действия. Используется для уничтожения однолетних широколистных сорняков в виноградниках, садах, посевах овощных и декоративных культур, водной растительности в водоемах, а также для предуборочной десикации семенников сахарной свеклы, клевера, сорго, подсолнечника, льна, хлопчатника, рапса, сои, риса, картофеля. Применяется в дозах от 0,4 до 1,0 кг/га.
1. Метрологические характеристики метода (P = 0,95, n = 24)
Предел обнаружения: 0,025 мг/кг.
Диапазон определяемых концентраций: 0,025 — 0,5 мг/кг.
Среднее значение извлечения: 96,3%.
Стандартное отклонение: 3,05%.
Доверительный интервал среднего результата: +/- 3,5%.
(6 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)
| Среда | Внесено диквата, мг/кг | Обнаружено диквата, мг/кг | Полнота извлечения, % |
|---|---|---|---|
| Клубни картофеля | 0,025 0,05 0,25 0,5 | 0,024002 +/- 0,001819 0,048188 +/- 0,004564 0,240644 +/- 0,019999 0,483226 +/- 0,044062 | 96,01 96,38 96,26 92,64 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении вещества с помощью ион-парной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемых проб серной кислотой при кипячении, очистки экстрактов на колонке с катионитом.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым г детектором с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Eimer, США) Номер Госреестра 15945-97
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 7328
Колбы мерные вместимостью 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см ГОСТ 29227
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 5 куб. см ГОСТ 1770
10, 25, 50, 100, 200, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Дикват дибромид (моногидрат) с содержанием д.в. 99,7% (50,9% катионов) (Зенека, Великобритания)
Аммония хлорид, х.ч. ГОСТ 3773
Ацетонитрил для хроматографии, х.ч. ТУ 6-09-4326-76
Вода дистиллированная или деионизованная ГОСТ 6702 н-Гексан, х.ч. ТУ 6-09-3375 Диэтиламин для хроматографии, в ампулах ТУ 6-09-4356-77
Катионообменная смола Дауэкс 50 (50 — 100 меш), Na-форма (фирмы «Серва», Германия) или Дауэкс 50 WX8 (100 — 200 меш.), Na-форма (фирмы «Флука», Швейцария)
Кислота серная концентрированная, х.ч. ГОСТ 4204
Кислота соляная (хлороводородная), х.ч. ГОСТ 3118
Метиловый спирт (метанол), х.ч. ГОСТ 6995
Натрия гидроксид (едкий натр), х.ч. ГОСТ 4236
Натрий хлористый, х.ч. ГОСТ 4233
динатриевая соль (Трилон Б) ГОСТ 10652
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Бумажные фильтры «красная лента», обеззоленные или фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительная вместимостью 250 и 1000 куб. см ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336
Индикаторная бумага универсальная
Колбонагреватель электрический или электрическая плитка ТУ 92-275-76
Колбы плоскодонные вместимостью 100, 250, 400 — 500 куб. см ГОСТ 9737
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 500 и 2000 куб. см ГОСТ 9737
Колонка хроматографическая стеклянная, длиной 25 см, внутренним диаметром 10 мм
Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 10696
Стаканы химические вместимостью 100, 500 и 2000 куб. см ГОСТ 25336
Установка для перегонки растворителей
Холодильник водяной обратный ГОСТ 9737
Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм
Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с катионитом для очистки экстракта.
7.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.2 Приготовление 0,3 М раствора гидроксида натрия
Навеску гидроксида натрия массой 3 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, растворяют в 100 — 150 куб. см дистиллированной воды, доводят водой до метки, перемешивают.
7.3 Приготовление 2,5% раствора хлорида аммония
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 25 г хлорида аммония, растворяют в 600 — 700 куб. см дистиллированной воды, доводят водой до метки, перемешивают.
7.4 Приготовление 5% раствора
этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУ)
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 50 г двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, растворяют в 600 — 700 куб. см дистиллированной воды, доводят водой до метки, перемешивают.
7.5 Приготовление 2 н соляной кислоты
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 куб. см дистиллированной воды, вносят 167 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.
7.6 Подготовка колонки с катионитом
Навеску катионита Дауэкс 50 в натриевой форме <*> массой 3,5 г помещают в стакан вместимостью 100 куб. см, заливают 40 — 25 куб. см воды. Через 30 мин. суспензию переносят в хроматографическую колонку длиной 25 см, внутренним диаметром 10 мм, нижняя часть которой уплотнена тампоном из стекловаты. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, затем колонку последовательно промывают 20 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и 50 куб. см дистиллированной воды со скоростью 3 — 5 куб. см/мин., после чего она готова к работе.
<*> При отсутствии катионита в натриевой форме используют ионообменную + смолу в H -форме, подготовив ее по следующей методике: +
Образец катионита Дауэкс 50 в H -форме помещают в химический стакан, Заливают 5-кратным (по объему) количеством дистиллированной воды и оставляют для набухания на 24 часа. После этого воду декантируют, катионит обрабатывают 2 н водным раствором гидроксида натрия при перемешивании в течение 2 часов. Затем раствор декантируют и смолу многократно промывают водой до нейтральной реакции. Отмытый катионит переносят на воронку
Бюхнера, отфильтровывают и подсушивают до сыпучего состояния.
7.7 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 405 куб. см деионизованной воды, 95 куб. см ацетонитрила, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. В раствор вносят 5 куб. см орто-фосфорной кислоты, 5 куб. см диэтиламина, 0,5 г октансульфоната натрия, перемешивают и помещают на ультразвуковую баню на 2 мин.
7.8 Кондиционирование хроматографической колонки
Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.7) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.
7.9 Приготовление градуировочных растворов
и раствора внесения
7.9.1. Исходный раствор диквата для градуировки (концентрация катиона диквата 1 мг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помешают 0,1965 г диквата дибромида моногидрата (молекулярная масса 362,1, содержание катиона 50,9%), растворяют в 40 — 50 куб. см насыщенного водного раствора хлорида аммония, доводят насыщенным раствором хлорида аммония до метки, тщательно перемешивают.
7.9.2. Раствор диквата № 1 для градуировки и внесения (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора диквата с концентрацией 1 мг/куб. см (п. 7.9.1), разбавляют насыщенным раствором хлористого аммония до метки.
Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения диквата из исследуемых образцов.
7.9.3. Раствор диквата № 2 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см раствора № 1 с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.9.2), разбавляют насыщенным раствором хлористого аммония до метки.
Растворы хранят при комнатной температуре в темноте в течение 12-ти месяцев.
7.9.4. Рабочие растворы № 3 — 7 диквата для градуировки (концентрация 0,05 — 1,0 мкг/куб. см).
В 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 2 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.9.3), доводят до метки насыщенным раствором хлорида аммония, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 3 — 7 с концентрацией диквата 0,05, 0,1, 0,25, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см, соответственно.
Растворы хранят при комнатной температуре в темноте.
7.11 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации диквата в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
8. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 7176-85 «Картофель свежий, продовольственный, заготовляемый и поставляемый. Технические условия», 26545-85 «Картофель свежий продовольственный, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия», 6014-68 «Картофель свежий для переработки. Технические условия».
Отобранные пробы клубней картофеля хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильной камере (при 4 — 6 °C) не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.
Перед анализом образцы клубней картофеля измельчают.
9. Выполнение определения
9.1. Экстракция
Образец измельченных клубней картофеля массой 100 г помещают в круглодонную колбу вместимостью 2000 куб. см, вносят 400 куб. см деионизованной воды. Осторожно приливают 15 куб. см концентрированной серной кислоты. Колбу с подсоединенным к ней обратным холодильником и елочным дефлегматором помещают на электрический колбонагреватель и кипятят ее содержимое в течение 5 час. Реакционную массу охлаждают. На этой стадии можно оставить раствор на ночь. Остывшую суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через фильтр из хроматографической бумаги Ватман 3 ММ (или бумажный фильтр «красная лента» в 2 слоя). Осадок на фильтре промывают двумя порциями дистиллированной воды по 100 куб. см. Переливают фильтрат в химический стакан вместимостью 2 куб. дм, доводят pH до 8 — 9 (по индикаторной бумаге) добавлением твердого гидроксида натрия (20 — 25 г) при постоянном перемешивании. Добавляют 50 куб. см раствора ЭДТУ (приготовленного по п. 7.4), перемешивают, контролируют pH раствора (по индикаторной бумаге), если его значение выходит из диапазона 6 — 7, доводят его значение до указанных показателей, добавляя по каплям растворы ЭДТУ или гидроксида натрия. Снова фильтруют раствор под вакуумом на воронке Бюхнера через фильтр из хроматографической бумаги Ватман 3 ММ (или бумажный фильтр «красная лента» в 2 слоя), промывая стакан и фильтр 100 куб. см дистиллированной воды. Фильтраты объединяют, доводят общий объем раствора до 1 куб. дм и подвергают очистке по п. 9.2.
9.2. Очистка экстракта на колонке с катионитом
Объединенный фильтрат, полученный по п. 9.1 вводят со скоростью 5 куб. см/мин. в хроматографическую колонку, подготовленную по п. 7.6. С этой целью фильтрат переносят в делительную воронку, помещенную над колонкой, устанавливают (регулируя кран) скорость пропускания раствора 5 куб. см/мин. После введения пробы колонку последовательно промывают 25 куб. см воды, 50 куб. см 2 н хлороводородной кислоты, 25 куб. см воды, 100 куб. см 2,5% раствора хлорида аммония и 25 куб. см воды, которые отбрасывают. На этой стадии можно оставить колонку на ночь, при условии, что слой ионообменной смолы покрыт раствором. Дикват элюируют из колонки 50 куб. см насыщенного раствора хлорида аммония со скоростью не более 1 куб. см/мин. в мерную колбу вместимостью 50 куб. см. Раствор перемешивают и анализируют содержание диквата по п. 9.3.
9.3. Условия хроматографирования
Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Perkin-Elmer, США)
Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм
Температура колонки: комнатная
Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (19:81, по объему) + 0,1% (вес/объем) 1-октансульфонат натрия + 1,0% (по объему) диэтиламин + 1,0% (по объему) орто-фосфорная кислота
Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.
Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм
Ориентировочное время выхода диквата: 3,4 — 4 мин.
Линейный диапазон детектирования 1 — 20 нг
Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор диквата с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют насыщенным раствором хлористого аммония.
Примечание: Ежедневно после завершения работы колонку необходимо промывать не менее 30 мин. подвижной фазой метанол-вода (1:9, по объему), затем водой. Не рекомендуется оставлять на ночь в хроматографической системе фазу, содержащую комплекс ион-парных реагентов. Ежедневно перед началом работы до ввода в инжектор градуировочного раствора хроматографируют насыщенный раствор хлорида аммония. Эту операцию рекомендуется также осуществлять в течение рабочего дня после 4 — 5 вводов аналитических образцов или градуировочных растворов.
10. Обработка результатов анализа
Содержание диквата в пробе рассчитывают по формуле:
A x V
X — содержание диквата в пробе, мг/кг;
A — концентрация диквата в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г.
11. Контроль погрешности измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
12. Разработчики
ФГУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора».