МУК 4.1.2023-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств карбосульфана и его основных метаболитов — карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в плодах яблони методом газожидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАРБОСУЛЬФАНА И ЕГО ОСНОВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ — КАРБОФУРАНА И 3-ГИДРОКСИКАРБОФУРАНА В ПЛОДАХ ЯБЛОНИ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

Фирма-производитель: ФМС Европа НВ.

Торговое наименование: Маршал, КЭ.

Действующее вещество: карбосульфан.

Структурная формула (не приводится).

IUPAC: 2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил(дибутиламинотио)метилкарбамат.

Брутто-формула: C H № O S. 20 32 2 3

Мол. масса: 380,5.

Химически чистый препарат — вязкая жидкость от светло-желтого до бурого цвета со слабым фенольным запахом.

Температура кипения: 124 — 128 °С при 0,1 Па. Препарат разлагается при -6 температуре выше 150 °С. Давление паров 0,16 х 10 мм рт. ст. при 20 °С.

Растворимость при 25 °С в воде 0,3 мг/л; хорошо смешивается с большинством органических растворителей — растворимость при 20 °С — более 50% в ксилоле, хлороформе, хлористом метилене, н-гексане, метаноле и ацетоне. Стабилен в этилацетате при 60 °С, нестабилен при метилене, н-гексане, метаноле и ацетоне. Стабилен в этилацетате при 60 °С, нестабилен при pH ниже 7. Период полураспада в водных растворах (при 25 °С): менее 1 часа (pH 4), 22 часа (pH 6), 184 часа (pH 7), 340 часов (pH 8), более 1400 часов (pH 9).

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 250 мг/кг (самцы), 50 185 мг/кг (самки).

Гигиенические нормативы: МДУ для яблок в России не установлен.

В растениях идентифицированы 8 метаболитов, среди которых преобладают карбофуран и 3-гидроксикарбофуран.

Область применения: Карбосульфан — инсектицид и нематоцид системного и контактного действия, рекомендуемый для борьбы с листогрызущими и почвообитающими насекомыми-вредителями цитрусовых, люцерны, кукурузы, сорго, сои, овощных, картофеля и т.д.

Карбофуран

IUPAC: 2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил N-метилкарбамат.

    Брутто-формула: C  H  NO .
                     12 15  3

Мол. масса: 221,3.

Структурная формула (не приводится).

Белое кристаллическое вещество со слабым запахом фенола. Температура плавления — 150 — 152 °С. Давление паров при 33 °С — 2,7 мПа. Растворимость в воде при 25 °С — 700 мг/л. Растворимость в органических растворителях при 25 °С (г/кг): диметилформамид — 270, диметилсульфоксид — 250, ацетон — 150, ацетонитрил — 140, хлористый метилен — 120, этанол — 40.

Карбофуран стабилен в водных растворах при pH 3; с увеличением pH стабильность карбофурана уменьшается: период полураспада при pH 5 — 28 дней, при pH 7 — 21 день, при pH 9 — 0,9 дня.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая оральная токсичность (LD ) для крыс — 9,17 мг/кг, острая 50 дермальная токсичность для крыс более 10700 мг/кг, острая ингаляционная токсичность для крыс — 75 мг/куб. м.

Гигиенические нормативы: МДУ карбофурана для яблок в России не установлен.

3-гидроксикарбофуран

IUPAC: 2,3-дигидро-2,2-диметил-3-гидроксибензофуран-7-ил N-метилкарбамат

Структурная формула (не приводится).

    Брутто-формула: C  H  NO .
                     12 15  4

Мол. масса: 235,3.

Острая оральная токсичность (LD ) для крыс — 18 мг/кг. 50

2. Методика определения карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в плодах яблони методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Определение карбосульфана, карбофурана основано на извлечении смесью органических растворителей для 3-гидроксикарбофурана 0,25 н HCl, очистке экстракта путем перераспределения между несмешивающимися жидкими фазами и на колонке с дезактивированным флорисилом. Количественное определение карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана проводится методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора.

2.1.2 Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов анализируемых проб и сочетанием условий хроматографирования. Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, P = 0,95
карбосульфан	0,05	0,05 — 0,50	83,50	6,55	5,05
карбофуран	0,05	0,05 — 0,50	82,50	6,65	5,15
3-гидроксикарбофуран	0,05	0,05 — 0,50	88,75	7,75	5,20

ПОЛНОТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРБОСУЛЬФАНА В ПЛОДАХ ЯБЛОНИ

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение, +/-	Полнота определения, %
плоды яблони	0,05	0,041	0,0024	81,5
	0,10	0,085	0,0082	85,0
	0,20	0,173	0,0140	86,5
	0,50	0,404	0,0240	80,8
Среднее				83,5

ПОЛНОТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРБОФУРАНА В ПЛОДАХ ЯБЛОНИ

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение, +/-	Полнота определения, %
плоды яблони	0,05	0,038	0,0024	76,5
	0,10	0,084	0,0082	84,2
	0,20	0,169	0,0140	84,4
	0,50	0,425	0,0240	85,0
Среднее				82,5

ПОЛНОТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ 3-ГИДРОКСИКАРБОФУРАНА В ПЛОДАХ ЯБЛОНИ

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение, +/-	Полнота определения, %
плоды яблони	0,05	0,038	0,0024	76,7
	0,10	0,093	0,0082	92,5
	0,20	0,185	0,0140	92,8
	0,50	0,465	0,0240	93,0
Среднее				88,75

2.2. Реактивы, материалы

Карбосульфан, аналитический стандарт с массовой долей основного вещества 90,1%.

Карбофуран, аналитический стандарт с массовой долей основного вещества не менее 99,5%.

3-гидроксикарбофуран, аналитический стандарт с массовой долей основного вещества 98,2%.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25.

Ацетон, ос.ч. 9-5, ТУ 2633-039-4493179-00, или ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-76.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Пропанол, ТУ 6-09-4344-77.

Флорисил для колоночной хроматографии с размером частиц 100 — 200 меш, фирма Мерк, или аналогичный.

Соляная кислота, х.ч., 0,25 н, ГОСТ 3118-77.

Стекловата.

Хлористый метилен, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Фильтры бумажные «синяя лента», диаметр 50 мм, ТУ 6-09-1181-76.

Фильтры бумажные «красная лента», диаметр 100 мм, ТУ 2642-001-42624157-98.

Этиловый эфир уксусной кислоты, х.ч., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Газовый хроматограф серии «Кристалл 2000М» с ТИД.

Колонка кварцевая капиллярная длиной 20 м, внутренним диаметром 0,53 мм с неподвижной фазой НР-1 (толщина слоя 1,5 мкм).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Весы технические ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Микрошприц МШ-10, МШ-10М, ТУ 2-833-106.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные на 1000 мл ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Пробирки градуировочные на 5, 10 мл.

Стаканы химические, ГОСТ 25336-82Е.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 30 см, диаметром 10 мм.

Допускается применение другого оборудования и хроматографических колонок с аналогичными техническими характеристиками, обеспечивающими аналогичное разделение.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 16270-70 «Яблоки свежие ранних сортов созревания» или ГОСТ 21122-75 «Яблоки свежие поздних сортов созревания».

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции, затем промывают водой, после чего сушат над щелочью и перегоняют.

2.5.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа кварцевую капиллярную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре термостата 280 °С в течение 6 — 8 часов.

2.5.3 Приготовление градуировочных растворов

Основные растворы карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана готовят, количественно перенося 100 мг соответствующего аналитического стандарта в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетоне. Из полученного раствора с концентрацией 1 мг/мл готовят рабочие растворы с концентрациями 0,001 мг/мл, 0,002 мг/мл, 0,004 мг/мл, 0,010 мг/мл последовательным разбавлением гексаном.

При определении полноты извлечения смеси карбосульфана и карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в анализируемую матрицу вносят градуировочные растворы смеси карбосульфана и карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в ацетоне. В 100 г измельченной на терке пробы яблок вносят 1 мл градуировочного раствора соответствующей концентрации так, чтобы конечная концентрация анализируемого вещества (или веществ в случае совместного определения) соответствовала 0,05; 0,1; 0,2 и 0,5 мг/кг и в течение 30 минут перемешивают на качалке. Затем ацетон удаляют в токе сухого воздуха.

2.5.4 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика зависимости высоты (площади) пика от концентрации карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана в растворе в хроматограф вводят по 1 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты (площади) пиков и строят график зависимости среднего значения высоты, мм (площади, мв/сек.), пика от концентрации соответствующего компонента в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5 Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

Флорисил прогревают в термостате при 200 °С в течение 16 часов и охлаждают до комнатной температуры, добавляют по весу 3%-ной дистиллированной воды и протряхивают на качалке 1 час. 10 г деактивированного флорисила приготавливают в 50 мл смеси гексан — этилацетат (7:3, по объему). На дно стеклянной колонки помещают стекловату, слой 0,5 см безводного сульфата натрия и заполняют через воронку суспензией подготовленного флорисила при открытом кране колонки и закрывают кран, когда уровень растворителя достигнет верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.

2.5.6 Проверка хроматографического поведения карбосульфана и карбофурана на колонке с флорисилом

Для проверки хроматографического поведения на колонке готовят исходный раствор карбофурана и карбосульфана в смеси гексан:этилацетат (7:3, по объему). Для этого в мерную колбу на 50 мл количественно переносят навески по 10 мг каждого компонента и доводят до метки раствором гексан:этилацетат. Рабочий раствор с концентрацией 1 мкг/мл готовят последовательным разбавлением раствором гексан:этилацетат (7:3, по объему).

В подготовленную по п. 2.5.5 колонку пипеткой вносят 2 мл рабочего раствора и дают впитаться. После этого элюируют карбосульфан и карбофуран, внося в колонку 100 мл смеси гексан:этилацетат (7:3) и отбирая фракции по 10 мл. Каждую фракцию упаривают до объема 0,5 мл в роторном испарителе при температуре не более 30 °С и переносят в градуированную пробирку, используя 1 — 2 мл гексана. Пробу в пробирке упаривают в токе азота на водяной бане при температуре не более 30 °С до объема 1 мл и определяют содержание компонентов в каждой фракции газохроматографическим методом. Рассчитывают количество элюирующей смеси, необходимое для вымывания карбосульфана и карбофурана из колонки.

Примечание: профиль вымывания карбосульфана, карбофурана и 3-гидроксикарбофурана может изменяться при использовании флорисила новой партии или другой марки.

2.5.7 Проверка хроматографического поведения 3-гидроксикарбофурана на колонке с флорисилом

Для проверки хроматографического поведения на колонке готовят исходный раствор 3-гидроксикарбофурана в смеси гексан:этилацетат (9:1, по объему). Для этого в мерную колбу на 50 мл количественно переносят навеску 10 мг 3-гидроксикарбофурана и доводят до метки раствором гексан:этилацетат. Рабочий раствор с концентрацией 1 мкг/мл готовят последовательным разбавлением раствором гексан:этилацетат (9:1, по объему). В подготовленную по п. 2.5.5 колонку вносят 2 мл рабочего раствора 3-гидроксикарбофурана и дают впитаться. Компонент элюируют 100 мл той же смеси, отбирая фракции по 10 мл. Далее поступают так же, как в п. 2.5.6.

2.6. Проведение определения

2.6.1 Экстракция и очистка экстрактов при определении карбосульфана и карбофурана

Плоды яблони размораживают настолько, чтобы можно было вырезать 3 — 4 сегмента из каждого плода. Сегменты быстро натереть на крупной терке, отобрать среднюю пробу 20 г и поместить ее в коническую колбу на 250 мл, добавить 100 мл смеси гексан:пропанол (2:1) и поместить на ультразвуковую установку на 15 мин. Экстракт осторожно слить через промытый фильтр «красная лента» в делительную воронку на 1 л, а пробу снова залить 100 мл экстрагирующей смеси и повторить процедуру. Во второй раз пробу на фильтре промыть 10 — 20 мл смеси гексан:пропанол (2:1). К экстракту в делительной воронке добавить 100 мл насыщенного раствора хлористого натрия и встряхивать в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний слой отбросить, а верхний гексановый слой отобрать в концентратор через складчатый фильтр «синяя лента» с безводным сульфатом натрия. Фильтр промыть гексаном. Объединенную гексановую пробу упарить, сухой остаток количественно перенести с помощью гексана на фильтр «синяя лента» и отфильтровать в градуированную пробирку. Пробу упарить в токе азота досуха и растворить в смеси гексан:этилацетат (7:3, по объему). При необходимости очистить на колонке с флорисилом, как в п. 2.5.6.

2.6.2 Экстракция и очистка экстрактов при определении 3-гидроксикарбофурана

Отобрать среднюю пробу 20 г, как в п. 2.6.1, поместить в колбу на 500 мл, залить 200 мл 0,25 н HCl, поместить на ультразвуковую установку на 15 мин. Экстракт отфильтровать в чистую колбу через промытую стекловату, повторить процедуру со 100 мл 0,5 н HCl. Осадок на фильтре промыть 10 — 15 мл 0,25 н HCl. В объединенную солянокислую фракцию добавить 15 г хлористого натрия и растворить его сколько возможно на ультразвуковой установке в течение 3 — 5 минут. Содержимое колбы перенести в делительную воронку на 1 л и добавить 75 мл хлористого метилена, осторожно перемешать и после полного разделения фаз нижний хлорметиленовый слой отобрать в чистую колбу на 250 мл, пропуская его через безводный сульфат натрия. Повторить процедуру дважды с 50 мл хлористого метилена. Собранный экстракт поместить в морозильную камеру при -18 °С на 4 — 5 часов, после чего отфильтровать его через фильтр «синяя лента» с безводным сульфатом натрия в чистую колбу, выпарить при температуре не выше 30 °С. Остаток количественно перенести на фильтр «синяя лента» с помощью гексана и отфильтровать в градуированную пробирку. Упарить пробу в токе азота при температуре не выше 30 °С до объема 1 мл. Практика показывает, что подготовленная таким образом проба обычно не требует дальнейшей очистки. Однако, при необходимости пробу чистят на колонке с флорисилом по п. 2.5.7. В этом случае упарить пробу в токе азота досуха и растворить в смеси гексан:этилацетат (9:1, по объему).

2.6.3 Условия хроматографирования

2.6.3.1 Условия хроматографирования для определения карбосульфана и карбофурана

Газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с ТИД. Колонка кварцевая капиллярная длиной 20 м, внутренним диаметром 0,53 мм с неподвижной фазой НР-1 (толщина слоя 1,5 мкм).

Температура термостата колонки программируется от 120 °С (30 сек.) до 180 °С со скоростью 10 °С/мин., от 180 °С (10 сек.) до 260 °С со скоростью 20 °С/мин. Температура термостатов испарителя 250 °С, детектора 350 °С.

Скорость газа-носителя 1 (азот) через колонку 10 куб. см/мин., газа-носителя 3 (азот) 30 куб. см/мин.

Сброс газа-носителя 2 (азот) закрыт в течение 10 сек., далее расход 30 куб. см/мин.

Расход водорода 15,5 куб. см/мин.

Расход воздуха 220 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы 1 мкл. Время удерживания карбосульфана — 11 мин. 27 сек., карбофурана — 6 мин. 59 сек.

2.6.3.2 Условия хроматографирования для определения 3-гидроксикарбофурана

Газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с ТИД. Колонка кварцевая капиллярная длиной 20 м, внутренним диаметром 0,53 мм с неподвижной фазой НР-1 (толщина слоя 1,5 мкм).

Температура термостата колонки программируется от 120 °С (30 сек.) до 200 °С со скоростью 15 °С/мин. Температура термостатов детектора 350 °С, испарителя 250 °С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 10 куб. см/мин., газа-носителя 3 (азот) 25 куб. см/мин.

Сброс газа-носителя 2 (азот) закрыт в течение 10 сек., далее расход 30 куб. см/мин.

Расход водорода 15,5 куб. см/мин.

Расход воздуха 220 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы 1 мкл. Время удерживания 3-гидроксикарбофурана 6 мин. 39 — 41 с.

2.6.4 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание карбосульфана в пробе с учетом его основных метаболитов (карбофурана и 3-гидроксикарбофурана) в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                          (X  + X  х K  + X  х K ) х V
                            1    2    1    3    2

X = ----------------------------, P

где:

    X ,   X ,   X    -   концентрации    карбосульфана,    карбофурана    и
     1     2     3

3-гидроксикарбофурана, найденные по градуировочным графикам, мкг/мл; V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см; P — навеска анализируемого образца, г;

    K    и   K    -   коэффициенты   пересчета   содержания  карбофурана  и
     1        2
3-гидроксикарбофурана на эквивалент карбосульфана (K  = 1,72, K  = 1,6).
                                                    1          2

Содержание остаточных количеств определяемого компонента в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 0,5 мг/мл, разбавляют гексаном.

3. Требования техники безопасности

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием газового и жидкостного хроматографов соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

5. Разработчики

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

---