МУК 4.1.1948-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по измерению концентраций Ивермектина в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе населенных мест методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Роспотребнадзором 18.01.2005)
Примечание
Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 18 апреля 2005 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека
Г. Г. Онищенко
18 января 2005 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ИВЕРМЕКТИНА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ И АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
18 апреля 2005 года
1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе массовой концентрации ивермектина в диапазонах 0,04 — 0,4 мг/куб. м (воздух рабочей зоны) и 0,0008 — 0,008 мг/куб. м (атмосферный воздух).
Ивермектин — действующее вещество ветеринарных препаратов БАЙМЕК 1% ИР, фирма-производитель Байер АГ (Германия);
ИВЕРСЕКТ 1% ИР, фирма-производитель «Фармбиомедсервис»;
ИВЕРМЕК 1% ИР, фирма-производитель ЗАО «Нита-Фарм»;
ИВЕРМАК 1% ИР, фирма-производитель ЗАО «Мосагроген».
Ивермектин - смесь компонентов H B и H B . Содержание компонента 2 1a 2 1b H B не менее 80%.
2 1a
Компонент Н В — (2aE,4E,8E)-(5'S,6S,'R,7S,11R,13R,15S,17aR,20R,20aR, 2 1a 20bS)-20,20b-дигидрокси-5',6,8,19-тетраметил-7-[[(3-O-метил-4-O-(3-O-метил- 2,6-дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил)-2,6-дидеокси-альфа-L-арабино- гексапиранозил]-окси]-6'-[(1S)-1-метилпропил]-3',4',5',6,6',7,10,11,14,15, 17a,20,20a-,20b-тетрадекагидроспиро[11,15-метано-2H,13H,17H-фуро[4,3,2pq] [2,6]бензодиокса-циклооктадецен-13,2'-[2H]пиран]-17-он (или 5-O-деметил-22, 23-дигидроавермектин A ). 1a
Компонент Н В — (2aE,4E,8E)-(5'S,6S,'R,7S,11R,13R,15S,17aR,20R,20aR, 2 1b 20bS)-20,20b-дигидрокси-5',6,8,19-тетраметил-6'-(1-метилэтил)-7-[[(3-O- метил-4-O-(3-O-метил-2,6-дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил)-2,6- дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил]-окси]-3',4',5',6,6',7,10,11,14,15, 17a,20,20a-,20b-тетрадекагидроспиро[11,15-метано-2H,-13H,17H-фуро[4,3,2pq] [2,6]бензодиокса-циклооктадецен-13,2'-[2H]пиран]-17-он (или 25-(1- метилэтил)-5-O-деметил)-25-де(1-метилпропил)-22,23-дигидроавермектин A ). 1a
Структурная формула (не приводится).
Компонент R Эмпирическая формула Молекулярная масса H B CH -CH C H O 875 2 1a 2 3 48 74 14 H B CH C H O 861 2 1b 3 47 72 14 Ивермектин - кристаллический порошок, без запаха, цвет от белого до желтовато-белого. Насыпная плотность от 1,1 до 1,3 г/куб. см. Давление
-9
паров: 1,5 х 10 мм рт. ст. (20 °С). Практически нерастворим в воде (около 10 мкг/куб. дм при 21 °С), плохо растворим в алифатических углеводородах и циклогексане. Растворим в этиловом спирте, хорошо растворим в метиленхлориде, метилэтилкетоне, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле. Ивермектин получают путем селективного каталитического восстановления абамектина, который в свою очередь является продуктом жизнедеятельности
почвенных организмов Streptomyces avermitilis.
Температура плавления 150 — 155 °С.
Агрегатное состояние в воздухе — аэрозоль.
Краткая токсикологическая характеристика:
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс: 42,8 — 52,8 мг/кг, для 50 мышей: 11,6 — 87,2 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс > 50
660 мг/кг, для кроликов - 406 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK ) для крыс > 5110 мг/куб. м.
50
Ивермектин используется в качестве антипаразитарного и антигельминтного средства (против нематод, вшей, кровососок, возбудителей саркоптоидозов, личинок овода и других членистоногих) для крупного рогатого скота, овец, свиней путем подкожного введения 1%-ного раствора.
Ориентировочно безопасный уровень воздействия (ОБУВ) ивермектина в воздухе рабочей зоны — 0,04 мг/куб. м, в атмосферном воздухе — 0,001 мг/куб. м.
Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей +/- 25%, при доверительной вероятности 0,95.
Измерения концентраций ивермектина выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с флуориметрическим детектором после превращения вещества во флуорогенное производное.
Концентрирование ивермектина из воздуха осуществляют на бумажные фильтры «синяя лента», экстракцию с фильтра проводят этанолом.
Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы — 0,2 нг.
Определению не мешают компоненты препаративных форм.
3.1 Средства измерений
Жидкостной хроматограф с флуориметрическим детектором с Номер Госреестра переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США) 15945-97 Барометр-анероид М-67 ТУ 2504-1797-75
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см
Пробирки градуированные вместимостью 5 или 10 куб. см ГОСТ 1770
Пробоотборное устройство ОП-442ТЦ (ЗАО «ОПТЭК», ТУ 25-11-1414-78 г. Санкт-Петербург) или аспирационное устройство ЭА-1
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2, цена деления ТУ 215-73Е 1 °С, пределы измерения 0 — 55 °С
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 10, ГОСТ 1770 500 и 1000 куб. см
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Ивермектин с содержанием компонента H B — 83,9%; 2 1a H B — 5,9% (Байер АГ, Германия) 2 1b
Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ-6-09-4326-76
Вода бидистиллированная деионизованная или перегнанная ГОСТ 6709 над KMnO 4
Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995
1-N-метилимидазол, puriss. for DNA synthesis, >= 99%, Fluka
Трифторуксусный ангидрид, purum, >= 98,0% (GC), Fiuka
Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995
Этиловый спирт (этанол) ГОСТ Р 51652
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3 Вспомогательные устройства, материалы
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78 Бумажные фильтры "синяя лента" обеззоленные ТУ 6-09-2678-77
Воронки конусные диаметром 30 — 37 мм ГОСТ 25336
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 куб. см и ГОСТ 9737 250 куб. см
Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм
Пробирки центрифужные ГОСТ 25336
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М ТУ 25-11-917-74 или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария
Стаканы химические вместимостью 100 куб. см ГОСТ 25336
Установка для перегонки растворителей
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Холодильник водяной обратный ГОСТ 9737
Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005.
4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, растворов, реактива для дериватизации, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, отбор проб.
7.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 980 куб. см метанола, добавляют 20 куб. см бидистиллированной или деионизированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
7.3 Кондиционирование хроматографической колонки
Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,7 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.
7.4 Приготовление реактива для дериватизации
Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объеме 1:2. Реактив годен к употреблению в течение рабочего дня.
7.5 Приготовление градуировочных растворов
7.5.1 Исходный раствор ивермектина для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,0111 г ивермектина (содержащего 89,8% действующего вещества: компонента H B - 83,9%; H B - 2 1a 2 1b 5,9%), растворяют в 50 - 70 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в морозильной камере в
течение месяца.
Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.
7.5.2 Раствор № 1 ивермектина для градуировки (концентрация 1 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного градуировочного раствора ивермектина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в морозильной камере в течение 10-ти дней.
Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения ивермектина из исследуемых образцов.
7.5.3. Рабочие растворы № 2 — 5 ивермектина для градуировки (концентрация 0,01 — 0,1 мкг/куб. см)
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см стандартного раствора № 1 с концентрацией 1 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией ивермектина 0,01; 0,02; 0,05 и 0,10 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в морозильной камере не более недели.
7.6 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х сек.) от содержания ивермектина в растворе (мкг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам флуорогенного производного ивермектина для градуировки.
Для построения градуировочной характеристики в градуированные пробирки вместимостью 5 куб. см вносят по 1 куб. см каждого из 4-х рабочих растворов ивермектина № 2 — 5, прибавляют по 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 — 5 °С, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (п. 7.4), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 7.6.1. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
7.6.1 Условия хроматографирования
Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм
Температура колонки: комнатная
Подвижная фаза: метанол — вода (98:2 по объему)
Скорость потока элюента: 1,7 куб. см/мин.
Длина волны: возбуждение 364 нм
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм
Ориентировочное время выхода флуорогенного производного ивермектина: около 11 мин.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор ивермектина с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом.
7.7 Отбор проб
7.7.1 Воздух рабочей зоны
Отбор проб проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны». В течение 15 минут последовательно отбирают 5 проб, для чего воздух аспирируют в течение 3-х минут с объемным расходом 2 — 4 куб. дм/мин. через бумажный фильтр «синяя лента», помещенный в фильтродержатель.
Для измерения ивермектина на уровне 0,5 ОБУВ для воздуха рабочей зоны необходимо отобрать 7,5 куб. дм воздуха. Срок хранения отобранных проб, помещенных в полиэтиленовые пакеты, в морозильной камере при температуре не выше -10 °С — 5 дней.
7.7.2 Атмосферный воздух
Отбор проб проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «ОПА. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ в воздухе населенных мест». Воздух с объемным расходом 2 — 4 куб. дм/мин. аспирируют через бумажный фильтр «синяя лента», помещенный в фильтродержатель.
Для измерения концентрации ивермектина на уровне 0,8 ОБУВ для атмосферного воздуха необходимо отобрать 12,5 куб. дм воздуха. Срок хранения отобранных проб, помещенных в полиэтиленовые пакеты, в морозильной камере при температуре не выше -10 °С — 5 дней.
8.1 Экстракция
8.1.1 Воздух рабочей зоны
Фильтр с отобранной пробой переносят в химический стакан вместимостью 100 куб. см, заливают 10 куб. см этанола, помещают на встряхиватель на 10 минут. Растворитель сливают в мерный цилиндр вместимостью 50 куб. см, отжимая фильтр стеклянной палочкой. Фильтр еще дважды обрабатывают новыми порциями этанола объемом 10 куб. см.
Объединенный экстракт доводят этанолом до объема 30 куб. см, перемешивают, отбирают аликвоту объемом 1 куб. см, переносят в грушевидную колбу и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха, остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и подвергают дериватизации по п. 8.2.
8.1.2 Атмосферный воздух
Фильтр с отобранной пробой переносят в химический стакан вместимостью 100 куб. см, заливают 10 куб. см этанола, помещают на встряхиватель на 10 минут. Растворитель сливают, фильтр еще дважды обрабатывают новыми порциями этанола объемом 10 куб. см.
Объединенный экстракт упаривают в грушевидной колбе на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха, остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и подвергают дериватизации по п. 8.2.
8.2 Дериватизация
К ацетонитрильному раствору прибавляют 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 — 5 °С, помещая колбу в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (п. 7.4), перемешивают, выдерживают 1 час при комнатной температуре и анализируют в условиях хроматографирования, указанных в п. 7.6.1.
Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площадь пика, с помощью градуировочного графика определяют концентрацию ивермектина в хроматографируемом растворе.
Перед анализом опытной пробы проводят хроматографирование холостой (контрольной) пробы — дериватизированного экстракта неэкспонированного фильтра.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор ивермектина с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом.
Массовую концентрацию ивермектина в пробе воздуха Х, мг/куб. м, рассчитывают по формуле:
где:
С - концентрация ивермектина в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади
хроматографического пика, мкг/куб. см; W — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
К - коэффициент пересчета, учитывающий объем экстракта с фильтра, используемый для анализа, равный 6 (для воздуха рабочей зоны), 1 (для
атмосферного воздуха); V — объем пробы воздуха, отобранный для анализа, приведенный к 20
стандартным (давление 760 мм рт. ст., температура 20 °С) при исследовании воздуха рабочей зоны или нормальным условиям (давление 760 мм рт. ст.,
температура 0 °С) при исследовании атмосферного воздуха.
V = R х Р х u t / (273 + Т), 20
Т — температура воздуха при отборе пробы (на входе в аспиратор), град. С;
Р — атмосферное давление при отборе пробы, мм рт. ст.;
u — расход воздуха при отборе пробы, куб. дм/мин.;
t — длительность отбора пробы, мин.;
R — коэффициент, равный 0,386 для воздуха рабочей зоны и 0,357 для атмосферного воздуха.
Примечание: Идентификация и расчет концентрации ивермектина в пробах могут быть проведены с помощью программ обработки хроматографических данных с применением компьютера, включенного в аналитическую систему.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, г. Мытищи Московской обл.