МУК 4.1.1947-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств дифлубензурона в яблоках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Роспотребнадзором 18.01.2005)
Примечание
Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 18 апреля 2005 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека
Г. Г. Онищенко
18 января 2005 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИФЛУБЕНЗУРОНА В ЯБЛОКАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
18 апреля 2005 года
1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
1. Вводная часть
Фирма-производитель: ЗАО Фирма «Август».
Торговое наименование: Герольд, ВСК.
Действующее вещество: дифлубензурон.
Структурная формула (не приводится).
1-(4-хлорфенил)-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина (IUPAC).
N-{[(4-хлорфенил)амино]карбонил}-2,6-дифторбензамид (С.А.).
Брутто формула: C H ClF N O . 14 9 2 2 2
Бесцветное кристаллическое вещество (технический — кристаллы от белых до желтых).
Температура плавления: 228 °С (техн.: 210 — 230 °С). -4
Давление паров при 25 °С: 1,2 х 10 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 3,89.
ow
Растворимость (г/л) при 20 °С: н-гексан — 0,063; толуол — 0,29; дихлорметан — 1,8; метанол — 1,1; вода — 0,08 мг/л (при pH 7 и 25 °С).
Вещество стабильно в кислых средах (20 °С, pH 5 — 7, DT > 150 дней), 50 разлагается в щелочных растворах (при pH 9 DT 42 дня). 50
Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность (LD ) для мышей и крыс - более 4640 мг/кг; острая дермальная
50
токсичность (LD ) для кроликов — более 2000 мг/кг, для крыс — более 10000 50 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — более 2,88 мг/л. 50 Токсичен для пчел. CK для рыб 130 — 150 мг/л при экспозиции 96 часов. 50
Мутагенный и онкогенный эффекты при использовании препарата не наблюдались.
Гигиенические нормативы для дифлубензурона в России:
ОДК в почве — 0,2 мг/кг; ПДК в воде водоемов — 0,01 мг/л; ОБУВ в воздухе рабочей зоны — 3,0 мг/куб. м; МДУ для яблок — 0,1 мг/кг.
Область применения препарата: Несистемный регулятор роста насекомых с контактным и кишечным действием. Используется для уничтожения широкого диапазона насекомых-вредителей, питающихся листьями лесных и плодовых деревьев, а также плодами. Эффективен против яблонной плодожорки, листоверток и др.
2. Методика определения дифлубензурона в яблоках методом ВЭЖХ
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Методика основана на определении дифлубензурона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.
2.1.2 Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА
| Объект анализа | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24) | Относительное стандартное отклонение S, % | Доверительный интервал среднего, n = 24, P = 0,95 |
|---|---|---|---|---|---|
| Яблоки | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 89,7 | 6,24 | 5,47 |
(N = 5 ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)
| Среда | Внесено, мг/кг | Найдено, мг/кг | Стандартное отклонение S, +/- | Полнота определения, % |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Яблоки | 0,01 | 0,00887 | -4 7,21 х 10 | 88,7 |
| 0,02 | 0,01788 | -3 1,15 х 10 | 89,4 | |
| 0,05 | 0,04475 | -3 2,55 х 10 | 89,5 | |
| 0,1 | 0,0912 | -3 6,91 х 10 | 91,2 | |
| Среднее | 89,7 |
2.1.3 Избирательность метода
Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.
Бикарбонат натрия, х.ч., ГОСТ 4201-79.
Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.
Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-72.
Дифлубензурон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.
Дихлорметан, х.ч., ТУ 2631-019-44493179-98.
Диэтиловый эфир, ч., ОСТ 84-2006-88.
Железо (II) сернокислое, х.ч., ГОСТ 4148-78.
Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.
Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.
Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.
Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или х.ч., ГОСТ 6552-80.
Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.
Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.
Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.
Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.
н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (56:44, по объему).
Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 — 0,063 mm) (Merck, Германия).
Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.
Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан — диэтиловый эфир (80:20, по объему).
Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан — диэтиловый эфир (55:45, по объему).
2.3. Приборы и посуда
Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный.
Колонка Symmetry-C18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.
Предколонка Waters Symmetry C-18.
Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.
Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.
Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.
Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.
Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.
Колонки стеклянные (25 х 1) см.
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.79, № 2051-79. Пробы яблок хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С, перед проведением анализа пробы гомогенизируют в гомогенизаторе.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 55 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты). Затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO и 2 г K CO ). 4 2 3
Ацетонитрил (х.ч.) сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.
2.5.2 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.
2.5.3 Приготовление растворов
Для приготовления 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты 2 г 98% (или 2,25 г 87%) кристаллической H PO помещают в мерную колбу объемом 1 л, 3 4 растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0,1 М раствора NaHCO 9,3 г
3
кристаллического бикарбоната натрия помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют при перемешивании в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем
раствора до метки. Для получения 60%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 600 мл ацетона с 400 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 560 мл ацетонитрила с 440 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента N 1 в
колбе на 1000 мл смешивают 800 мл н-гексана и 200 мл диэтилового эфира. Для приготовления элюента № 2 в колбе на 1000 мл смешивают 550 мл н-гексана и 450 мл диэтилового эфира.
2.5.4 Приготовление стандартного и градуировочных растворов
Берут точную навеску дифлубензурона (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил — бидистиллированная вода (56:44, по объему). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.
2.5.5 Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация дифлубензурона в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе (мкг/мл).
2.5.6 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан — диэтиловый эфир (80:20, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан — диэтиловый эфир (55:45, по объему) и 30 мл смеси гексан — диэтиловый эфир (80:20, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
2.5.7 Проверка хроматографического поведения дифлубензурона на колонке с силикагелем
В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора дифлубензурона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента № 1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 60 мл элюента № 1, затем 60 мл элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 2.6.3.
Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.3. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.
Примечание: профиль вымывания дифлубензурона может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.
2.5.8 Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.
2.6. Проведение определения
2.6.1 Определение дифлубензурона в яблоках
Навеску массой 20 г гомогенизированных в гомогенизаторе яблок помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют дифлубензурон 40 мл 60%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 мл. Объединенный экстракт концентрируют на роторном испарителе при температуре 40 °С до объема ~50 мл.
Дифлубензурон переэкстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2 — 3 мин. Верхний водный слой отбрасывают <*>. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке дважды 0,1 М раствором бикарбоната натрия порциями по 30 мл и один раз 50 мл 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты, встряхивая воронку в течение 2 — 3 минут (при всех промывках верхний водный слой отбрасывают). Органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.2.
2.6.2 Очистка на колонке с силикагелем
Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.1 экстрактов яблок, количественно переносят тремя порциями (по 3 мл) смеси гексан — диэтиловый эфир (80:20, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 60 мл элюента № 1, который отбрасывают. Дифлубензурон элюируют 60 мл элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.3 Условия хроматографирования
Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.
Колонка Symmetry-C18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.
Температура колонки 30 +/- 1 °С.
Предколонка Waters Symmetry C-18 для защиты аналитической колонки.
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода в соотношении 56:44 (по объему).
Скорость потока элюента: 1 мл/мин.
Время удерживания дифлубензурона 11,6 +/- 0,2 мин.
Линейный диапазон детектирования 0,1 — 2,00 мкг/мл.
2.6.4 Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание дифлубензурона в образце яблок (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
S х C х V
2
где:
S - площадь пика дифлубензурона в стандартном растворе, кв. мм;
1
S - площадь пика дифлубензурона в анализируемой пробе, кв. мм;
2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
P - навеска анализируемого образца, г;
C - концентрация стандартного раствора дифлубензурона, мкг/мл.
Содержание остаточных количеств дифлубензурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлубензурона 2 мкг/мл, разбавляют.
3. Контроль погрешности измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.
4. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции «Основные правила безопасной работы в химической лаборатории», общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.