МУК 4.1.1875-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации клозантела в органах и тканях животных, плазме и молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Минздравом России 07.03.2004)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 1 мая 2004 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
7 марта 2004 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛОЗАНТЕЛА В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ, ПЛАЗМЕ И МОЛОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.1875-04
Дата введения с 1 мая 2004 года
1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
1. Область применения
Методические указания по определению массовой концентрации клозантела в продуктах питания животного происхождения предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции органами и учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими контроль качества пищевых продуктов в соответствии с санитарными правилами и нормами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.560-96», аккредитованными в установленном порядке.
2. Общие положения
Клозантел — противопаразитарный препарат обладает широким спектром активности против экто- и эндопаразитов. Действует на зрелые и личиночные стадии развития паразитов.
Проявляет ярко выраженную активность против трематод желудочно-кишечного тракта, нематод, личинок оводов, чесоточных клещей у крупного и мелкого рогатого скота. Клозантел обладает также высокой эффективностью при фасциолезе.
На основе клозантела и его натриевой соли производится ряд ветеринарных препаратов.
Настоящие Методические указания устанавливают хроматографическую методику количественного анализа продуктов питания животного происхождения на содержание клозантела с нижним пределом измерения 0,1 мг/кг.
3. Физико-химические свойства, токсикологическая характеристика и гигиенические нормативы
C H Cl J N O Мол. масса: 663,08. 22 14 2 2 2
Клозантел, относящийся к классу производных салициланилидов, представляет собой порошок белого или желтоватого цвета, не растворяется в воде, слабо растворяется в низших спиртах, хлороформе, растворяется в диметилсульфоксиде, диметилформалиде, диметилацетамиде, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле. Натриевая соль клозантела — клозантела натрий дигидрат растворяется в низших спиртах.
Температура плавления (Т ) — 217,8 °С. пл
Структурная формула (не приводится).
Клозантел относится к умеренно опасным веществам 3 класса опасности: ЛД при пероральном введении белым крысам составляет 2300 мг/кг. В
50 терапевтической (10 мг/кг) и повышенных дозах препарат не обладает эмбриотоксическими, тератогенными, мутагенными и аллергенным свойствами.
4. Погрешность измерения
Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью, не превышающей 22% при доверительной вероятности — 0,95.
5. Метод измерений
Измерения массовой концентрации клозантела основаны на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением УФ-детектора на колонке с обращенной фазой после экстракции его органическими растворителями из органов и тканей животных, плазмы с последующей очисткой экстрактов. Детектирование ведут при длине волны 237 нм.
Чувствительность метода составляет 0,1 мкг в пробе, нанесенной на колонку.
6. Средства измерения, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы
6.1 Средства измерения
- аналитический хроматограф Waters или аналогичный с УФ-детектором, инжектором с объемом дозирующей петли — 0,05 куб. см, с компьютерной системой обработки хроматографических данных (или с интегратором);
- весы аналитические 2-го класса точности, ГОСТ 24104-88;
- весы микроаналитические, точность взвешивания до 4-го десятичного знака, Chan (США) или аналогичные;
- автоматические пипетки, ТУ 64-1-3329-81;
- колбы мерные вместимостью 100 мл, ГОСТ 1770-74;
- цилиндры градуированные вместимостью 100 мл, ГОСТ 1770-74;
- шприц Гамильтона (Швейцария).
6.2 Вспомогательные устройства
- центрифуга, центрифужные полиэтиленовые пробирки вместимостью 50 и 15 мл;
- ультразвуковой диспергатор УЗДН-1М или аналогичный;
- миксер или гомогенизатор;
- холодильник;
- колонка аналитическая Диасорб-130-С16Т, 250 х 4 мм, с размером частиц 6 мкм (фирма «БиоХимМак», Россия) или аналогичная;
- аппарат для упаривания — Vortex, Evaporater и др.;
- роторный испаритель с колбами;
- сушильный шкаф;
- патроны Cil (фирма «БиоХимМак», Россия);
- сцинтиляционные флаконы («Сигма», каталог 2001 — 2002 гг. N ____).
6.3 Реактивы
- ацетонитрил хроматографически чистый, ТУ ИРЕА 22-66, или импортный;
- гексан;
- спирт бутиловый третичный;
- спирт этиловый, ГОСТ 5964-84;
- спирт метиловый, ГОСТ 6995-67;
- хлороформ;
- стандартный образец — клозантела натрия дигидрат, поставляемый НБЦ «Фармбиомед», содержание действующего вещества указано на этикетке.
7. Требования безопасности
7.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.
7.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.
7.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
8. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы на жидкостном хроматографе.
9. Условия намерений
9.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 10) °С, атмосферном давлении 84 — 106 кПа и влажности воздуха не более 80%.
9.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
9.3. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
10. Подготовка к выполнению измерения
10.1 Приготовление растворов
10.1.1 Стандартный раствор дигидрата клозантела натрия
Готовят основной раствор клозантела натрия дигидрата в метиловом спирте таким образом, чтобы в 100 куб. см раствора содержалось 4 мг клозантела. Раствор хранению не подлежит.
Из основного раствора следующие разведения градуировочных растворов: в стеклянные пробирки объемом 5 куб. см вносят 1,0; 0,5; 0,1; 0,02 и 0,01 куб. см основного раствора и доводят объем до 1 куб. см метиловым спиртом.
10.1.2. Раствор элюента готовят путем смешивания метилового спирта с ортофосфорной кислотой 0,01 М в соотношении 9:1.
10.2 Подготовка прибора
Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.
10.3 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, включающую взаимосвязь величины хроматографического сигнала от массы анализируемого вещества в хроматографируемом объеме пробы, устанавливают по методу абсолютной калибровки с использованием серии подготовленных градуировочных растворов, содержащих 40; 20; 10; 4; 0,8 и 0,4 мкг клозантела/куб. см. На аналитическую колонку наносят по 0,05 куб. см подготовленных растворов.
Подвижная фаза — метиловый спирт:ортофосфорная кислота 0,01 М в соотношении 9:1.
Скорость потока — 1 куб. см/мин.; давление 120 — 160 бар.
Чувствительность детектора — 0,05.
На хроматограмме отмечают пик со временем удерживания 7 мин.
По результатам анализа калибровочных образцов строят калибровочный график — на оси абсцисс откладывают количество клозантела, нанесенного колонку, на оси ординат — площадь пика.
10.4 Отбор проб
Отбор проб для анализа ведут в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения количеств пестицидов» № 2051-79 от 21.08.79 (Москва).
В день забоя животных пробы органов и тканей берут по 200 — 500 г, помещают в целлофановые пакеты (для каждого органа свой пакет). Пакеты снабжают этикетками, на которых указывают: дату забоя животного, название органа.
Пробы для анализа хранят в морозильнике при температуре от -18 °С до -20 °С (допускается хранение до 2-х месяцев).
Кровь отбирают в пробирки с гепарином и центрифугируют. Супернатант хранят в морозильнике при температуре -20 °С.
10.5 Подготовка проб к определению
10.5.1 Экстракция и очистка экстрактов
1 куб. см плазмы помещают в сцинтилляционный флакон, туда же добавляют 2 куб. см ацетонитрила и 4 куб. см хлороформа. Пробы встряхивают на вортексе 10 мин., затем центрифугируют при 1000 х g в течение 15 мин. Органическую фазу переносят в сцинтилляционный флакон объемом 20 куб. см и упаривают досуха в вакуумном сушильном шкафу при температуре 50 °С. Экстракцию плазмы проводят дважды. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды промывают 0,5 куб. см гексана. Гексановые экстракты отбрасывают, а ацетонитрильный раствор упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см метанола и обрабатывают ультразвуком в течение 1 минуты.
Раствор используют для хроматографии.
Полученные пробы ткани выдерживают в морозильной камере при Т = -18 °С в течение 1 суток. Затем медленно оттаивают при Т = 4 °С в течение 12 часов. Пробы вновь замораживают при Т = -18 °С на 1 — 2 часа, оттаивают при комнатной температуре.
Навеску 5,0 г измельчают в гомогенизаторе (или острыми ножницами) и помещают в сцинтилляционный флакон, добавляют 6 куб. см ацетонитрила, пробы обрабатывают на ультразвуковой бане в течение 5 минут. Затем встряхивают на вортексе 10 минут и центрифугируют 1000 х g в течение 15 минут. Экстракт переносят в сцинтилляционный флакон объемом 20 куб. см, остаток повторно экстрагируют 4 куб. см ацетонитрила и упаривают досуха в вакуумном сушильном шкафу при температуре 45 °С (при упаривании добавляют небольшое количество третичного бутилового спирта для избежания вскипания, для удаления остатков воды добавляют небольшое количество ацетонитрила). Сухой остаток растворяют в 4 куб. см ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды промывают 3 куб. см гексана. Гексановые экстракты отбрасывают, а ацетонитрильный раствор упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила. Обрабатывают ультразвуком в течение 1 минуты. Раствор используют для хроматографии.
Экстракты из печени перед хроматографированием подвергают очистке на патронах C1 следующим образом: патрон C1 уравновешивают 5 куб. см ацетонитрила. На патрон наносят образец экстракта из печени объемом 1 куб. см и элюируется 5 куб. см ацетонитрила. Элюат упаривают досуха при температуре 45 °С. Сухой остаток растворяют 1 куб. см ацетонитрила. Раствор используют для хроматографии.
11. Выполнение измерений
Анализ включает не более 10 испытуемых образцов. Перед началом и в конце работы проводят анализ стандартного образца, чтобы убедиться в стабильности работы системы.
Объем наносимой на колонку пробы для всех объектов составляет 0,05 куб. см.
Условия проведения процесса хроматографирования описаны в разделе для стандартного образца.
12. Обработка результатов
Для обработки результатов хроматографирования используется программа «Мультихром». На хроматограммах исследуемых образцов определяют площадь пиков, по времени удерживания соответствующих пикам стандарта клозантела.
По калибровочному графику находят содержание клозантела в объеме инжектируемой пробы испытуемого образца.
Содержание клозантела в образце рассчитывают по формуле:
Скп.и V
3
V V К
1 3
где:
Скп. - концентрация клозантела в образце, мкг/куб. см;
Скп.и - содержание клозантела в объеме инжектируемой пробы образца
определяют по графику, мкг; V — объем пробы, нанесенной на колонку, куб. см (0,05 куб. см); 1 V — объем пробы, подготовленной для ВЭЖХ, куб. см (1 куб. см); 2 V — объем пробы плазмы, взятой для экстракции; 3 К — коэффициент, учитывающий степень извлечения клозантела (получен при постановке модельных опытов с внесением известных количеств клозантела, К = 0,8).
Разработчики: ООО НБЦ «Фармбиомед», Москва.