МУК 4.1.1874-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации ивермектина в органах и тканях, плазме и молоке животных, обработанных препаратом иверсект, методом флуоресцентной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Минздравом России 07.03.2004)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ИВЕРМЕКТИНА В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ, ПЛАЗМЕ И МОЛОКЕ ЖИВОТНЫХ, ОБРАБОТАННЫХ ПРЕПАРАТОМ ИВЕРСЕКТ, МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.1874-04

с 1 мая 2004 года

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1. Область применения

Методические указания по определению массовой концентрации ивермектина в продуктах питания животного происхождения предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции органами и учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими контроль качества пищевых продуктов в соответствии с санитарными правилами и нормами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.560-96», аккредитованными в установленном порядке.

2. Общие положения

Ивермектин — действующее вещество противопаразитарного препарата иверсекта — обладает широким спектром активности против экто- и эндопаразитов. Действует на зрелые и личиночные стадии развития паразитов.

Настоящие Методические указания устанавливают хроматографическую методику количественного анализа продуктов питания животного происхождения на содержание ивермектина с нижним пределом измерения 0,002 мг/кг.

3. Физико-химические свойства, токсикологическая характеристика

Ивермектин — смесь двух гомологов: гидрированного авермектина В (не менее 80%) и гидрированного 1а авермектина В (не более 20%). 1в

    Эмпирическая формула для Н В   - C  H  O  .
                              2 1а    48 72 14
    Эмпирическая формула для H B   - C  H  O  .
                              2 1в    47 70 14
    Молекулярная масса H B   - 872;

                    2 1а

Молекулярная масса H B — 858. 2 1в

Ивермектин — белый, кристаллический принадлежит к классу 16-членных макролидов, содержит два остатка сахаров; хорошо растворяется в большинстве органических растворителей, не растворяется в воде, гексане, гептане.

Токсикологическая характеристика: ивермектин относится к соединениям 2-го класса опасности.

Формула (не приводится).

    X =--C  H ===C  H --.
          22 2    23 2
    In H B  :R=C H .
        2 1а    2 5
    In H B  :R=CH .
        2 1в     3

4. Погрешность измерения

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью, не превышающей 10%, при доверительной вероятности — 0,95.

5. Метод измерений

Измерения массовой концентрации ивермектина основаны на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением флуоресцентного детектора на колонке с обращенной фазой после экстракции его органическими растворителями из органов и тканей животных, плазмы и молока с последующей очисткой экстрактов и получением флуоресцирующих производных путем обработки трифторуксусным ангидридом в растворе ацетонитрила в присутствии 1-метил-имидазола. Детектирование ведут по интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно.

Чувствительность метода составляет 0,71 нг в пробе, нанесенной на колонку.

6. Средства измерения, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы

6.1 Средства измерения:

• аналитический хроматограф, Waters или аналогичный, с флуоресцентным детектором, инжектором с объемом дозирующей петли — 0,050 мл, с компьютерной системой обработки хроматографических данных (или с интегратором);
• весы аналитические 2-го класса точности, ГОСТ 24104-88;
• весы микроаналитические, точность взвешивания до 4-го десятичного знака, Chan (США) или аналогичные;
• автоматические пипетки, ТУ 64-1-3329-81;
• колбы мерные вместимостью 100 мл, ГОСТ 1770-74;
• цилиндры градуированные вместимостью 100 мл, ГОСТ 1770-74;
• шприц Гамильтона (Швейцария).

6.2 Вспомогательные устройства:

• центрифуга;
• ультразвуковой диспергатор УЗДН-1М или аналогичный;
• миксер или гомогенизатор;
• холодильник;
• колонка аналитическая Диасорб-130-С16Т 250 х 4 с размером частиц 6 мкм (фирма БиоХимМак, Россия) или аналогичная;
• аппарат для упаривания — Vortex, Evaporater и др.;
• роторный испаритель с колбами;
• сушильный шкаф;
• сцинтиляционные флаконы («Сигма», каталог 2001 — 2002 N...).

6.3 Реактивы:

• спирт этиловый, ГОСТ 5964-84;
• спирт метиловый, ГОСТ 6995-67;
• ацетонитрил хроматографически чистый, ТУ ИРЕА 22-66 или импортный;
• 1-метилимидазол импортный, фирма МЕРК;
• трифторуксусный ангидрид импортный, фирма МЕРК;
• ацетон, ч.д.а., ГОСТ 1770-74;
• гексан, ч., ТУ 6-09-33-75-78;
• изооктан импортный;
• стандартный образец ивермектина, поставляемый ФГУ ВГНКИ.

7. Требования безопасности

7.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

7.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

7.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

8. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы на жидкостном хроматографе.

9. Условия измерений

9.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 10) °С, атмосферном давлении 84 — 106 кПа и влажности воздуха не более 80%.

9.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

10. Подготовка к выполнению измерения

10.1 Приготовление растворов

10.1.1. Стандартный раствор ивермектина с концентрацией 200 мкг/мл — раствор № 1 — готовят путем растворения точной навески стандартного образца в метиловом спирте. Раствор хранится в течение 2 месяцев в холодильнике. Рабочий стандартный раствор с концентрацией 2 мкг/мл — раствор № 2 — готовят путем разведения раствора № 1 метиловым спиртом. Раствор хранят 2 недели в холодильнике.

10.1.2. Раствор элюента готовят путем смешивания метилового спирта с водой в соотношении 98:2.

10.2 Подготовка прибора

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.

10.3 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, включающую взаимосвязь величины хроматографического сигнала от массы анализируемого вещества в хроматографируемом объеме пробы, устанавливают по методу абсолютной калибровки с использованием серии градуировочных растворов, которые готовят согласно таблице 1 в пробирках с притертыми пробками.

Номер стандарта	Стандартный раствор № 2	Этиловый спирт, мкл	Содержание ивермектина, нг/мл	Количество в-ва, наносимого на колонку, нг
0	0	1000	-	-
1	10	990	20	0,71
2	20	980	40	1,43
3	30	970	60	2,14
4	40	960	80	2,86
5	50	950	100	3,57

Проведение дериватизации

Из приготовленных растворов отбирают по 1 мл, переносят в чистые стеклянные пробирки и упаривают досуха на Vortex'e при температуре +40 — +50°.

В пробирки с сухим остатком вносят по 0,5 мл ацетонитрила. Пробирки энергично встряхивают и обрабатывают ультразвуком в течение 30 с. Процедуру повторяют дважды, чтобы полностью перевести в раствор авермектины, адсорбированные на стенках пробирки. Пробирки помещают в холодильник на 10 — 15 мин.

Примечание: необходимо следить, чтобы в образцы перед проведением дериватизации не попала влага.

В пробирки с подготовленным ацетонитрильным раствором после растворения вносят с помощью градуированной микропипетки или микрошприца 0,05 мл 1-метилимидазола. Пробирки закрывают, тщательно перемешивают содержимое в течение 5 — 10 с, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и помещают в холодильник при 0 °С на 10 — 15 мин.

Готовят реакционную смесь из трифторуксусного ангидрида и ацетонитрила в соотношении 1:2 и помещают ее в холодильник при 0 °С на 10 — 15 мин.

Примечание: пользуются только свежеприготовленной реакционной смесью.

После охлаждения в пробирки с образцами вносят по 0,15 мл охлажденной смеси трифторуксусного ангидрида с ацетонитрилом. Пробирки закрывают, перемешивают содержимое и выдерживают в холодильнике в течение 1 часа.

На аналитическую колонку наносят по 0,05 мл подготовленных дериватизированных стандартных образцов, содержащих 0,71; 1,43; 2,14; 2,86; 3,57 ng ивермектина.

Подвижная фаза — метиловый спирт — вода 98:2.

Скорость потока — 0,8 куб. см/мин. Давление — 120 — 160 атм.

Детектирование ведут по интенсивности флуоресцентности при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно.

Калибровочную кривую строят на сумме площадей двух компонентов стандарта. Полную градуировку проводят не реже одного раза в месяц. Для ежедневной градуировки используют только два раствора с концентрацией ивермектина 20 и 60 нг/мл.

10.4 Подготовка проб к определению

10.4.1 Экстракция и очистка экстрактов

Органы и ткани

Пробу ткани, хранившуюся в холодильнике, размораживают, мелко измельчают в гомогенизаторе (или острыми ножницами). Навеску измельченной ткани — 5 г — помещают в плоскодонную колбу с пришлифованной пробкой емкостью 100 мл, куда добавляют 30 мл этилацетата.

    Экстракцию  проводят  в  течение 24 часов, после чего экстракт отделяют
центрифугированием  и  переносят  его  через  фильтр  с  безводным Na SO  в
                                                                     2  4
круглодонную  колбу.  К  остатку  добавляют  еще  20 - 30 мл  этилацетата и
проводят  вторую  экстракцию  в течение 1 часа (при встряхивании). Экстракт
отделяют  центрифугированием  и через фильтр с безводным Na SO  переносят в
                                                           2  4
круглодонную  колбу  с  первым  экстрактом. Экстракты упаривают на роторном
испарителе  при температуре +30 - +35 °С досуха, остаток растворяют в 10 мл
сухого  ацетонитрила.  Растворение  ведут  в  ультразвуковой  бане. Раствор
переносят  в  делительную  воронку.  Колбу,  где  находился  сухой остаток,

обмывают 5 мл ацетонитрила, который также переносят в делительную воронку.

Ацетонитрильный раствор 4 раза промывают гексаном, беря на каждую промывку по 5 — 8 мл гексана. Гексановые экстракты отбрасывают.

Примечание: экстракцию гексаном можно проводить в пробирках со шлифом, отбирая гексановый экстракт пипеткой.

Измеряют объем ацетонитрильного раствора, промытого гексаном, и делят его на равные части. Одну из них помещают в холодильник на случай возникновения необходимости в повторении анализа. Вторую часть раствора помещают в центрифужную пробирку и упаривают на Vortex'e в токе азота досуха (допускается упаривание ацетонитрильного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С). Сухой остаток используют для проведения дериватизации.

Плазма. 1,0 мл плазмы крови помещают в гомогенизатор (Super-Mixer), туда же добавляют 3 мл смеси этиловый спирт:вода в соотношении 1:1. Обработку ведут при 4500 об./мин. в течение 10 мин. Из полученной эмульсии аверсектин экстрагируют этилацетатом 3 раза порциями по 8 мл. Экстракцию ведут в центрифужных пробирках при встряхивании с последующим центрифугированием. Этилацетатные экстракты (верхний слой) отбирают пипеткой и переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 мл. Этилацетат отгоняют в вакууме на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С. Остаток растворяют в 4 куб. см ацетонитрила (растворение ведут на ультразвуковой бане). Раствор переносят в широкую пробирку с притертой пробкой. Колбу, в которой производилась отгонка этилацетата, обмывают 2 мл ацетонитрила и промывку также переносят в пробирку. Ацетонитрильный раствор 3 — 5 раз промывают 3 — 4 мл гексана. Гексановые экстракты (верхний слой) отбирают пипеткой и отбрасывают, а ацетонитрильный раствор, промытый гексаном, делят на две равные части. Одну часть хранят в холодильнике, а вторую часть помещают в центрифужную пробирку; упаривают в токе азота в системе Vortex досуха (допускается упаривание ацетонитрильных растворов на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С). Сухой остаток используют для проведения дериватизации.

Молоко. 1,0 мл молока помещают в гомогенизатор (Super-Mixer), туда же добавляют 5 мл смеси ацетон:вода в соотношении 1:1 и обрабатывают в течение 5 мин. при 4500 об./мин. Из полученной эмульсии аверсектин экстрагируют изооктаном. Экстракцию проводят дважды, беря на каждую экстракцию по 5 мл изооктана. Экстракцию ведут при встряхивании и последующем центрифугировании. Экстракты объединяют и упаривают на роторном испарителе досуха. Остаток растворяют в 8 мл ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды экстрагируют пятью мл гексана (промывку гексаном можно проводить в пробирках со шлифами, отбирая каждый раз пипеткой верхний слой). Гексановые экстракты отбрасывают. Ацетонитрильный раствор делят на две равные части. Одну из них хранят в холодильнике для повторного анализа (в случае необходимости), вторую часть помещают в центрифужную пробирку и упаривают в токе азота в системе Vortex досуха (допускается упаривание на роторном испарителе). Сухой остаток используют для проведения дериватизации.

10.4.2 Проведение дериватизации

В пробирки с сухими остатками вносят по 0,5 мл ацетонитрила и растворяют остатки с помощью ультразвука. Дериватизацию исследуемых проб проводят так, как это описано для стандартных образцов.

┌─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
<pre class="legal-pre">│    Примечание: дериватизацию авермектинов исследуемого образца          │
│(образцов) проводят одновременно с дериватизацией рабочих стандартов.    │
│Допускается хранение дериватизированных проб в холодильнике в течение    │
│одних суток.                                                             │</pre>
└─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

11. Выполнение измерений

Анализ включает не более 10 испытуемых образцов. Перед началом и в конце работы проводят анализ стандартного образца, чтобы убедиться в стабильности работы системы.

Объем наносимой на колонку пробы для всех объектов составляет 0,05 мл.

Условия проведения процесса хроматографирования описаны в разделе для стандартного образца.

12. Обработка результатов

Для обработки результатов хроматографирования используется программа «Мультихром». На хроматограммах исследуемых образцов определяют площадь пиков, по времени удерживания соответствующих пикам стандарта ивермектина.

По калибровочному графику находят содержание ивермектина в объеме инжектируемой пробы испытуемого образца.

Содержание ивермектина в образце рассчитывают по формуле:

                                     С     V
                                      кп.и  2
                              С    = --------,
                               кп.   V  V  К
                                      1  3

где:
С   - концентрация ивермектина в образце, мкг/мл;
 кп
С      -  содержание  ивермектина в объеме инжектируемой пробы  образца
 кп.и

определяют по графику, мкг/0,05 мл; V — объем пробы, нанесенной на колонку, мл (0,05 мл); 1 V — объем пробы, подготовленной для ВЭЖХ, мл (0,75 мл); 2 V — объем (вес) пробы, взятой для экстракции; 3

    К  - коэффициент,  учитывающий степень извлечения ивермектина. (Получен
при   постановке  модельных   опытов  с   внесением   известных   количеств

ивермектина, К = 0,8.)

13. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол N ___ количественного химического анализа

1. <a id="p100125"></a>Дата проведения анализа ___________________

2. <a id="p100126"></a>Место отбора пробы ________________________

3. <a id="p100127"></a>Название лаборатории ______________________

4. <a id="p100128"></a>Юридический адрес организации _____________

Результаты химического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый компонент	Концентрация, мг/кг	Погрешность измерения, %

Ответственный исполнитель: Научный руководитель:

14. Контроль погрешности методики

Значения полученных метрологических характеристик погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2 в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе С, которую определяют как среднеарифметическое результатов параллельных определений.

Диапазон определяемых концентраций	Наименование матрологической характеристики
аверсектина С, мг/кг	Характеристика погрешности, мг/кг; Р = 0,95	Норматив оперативного контроля воспроизводимости D, мг/кг; Р = 0,95, m = 2
Мышцы 0,002 до 0,024	0,095С + 0,00029	0,095С + 0,00047
Жир 0,002 до 0,24	0,10С + 0,00026	0,11С + 0,00043
Печень 0,002 до 0,024	0,065С + 0,00042	0,034С + 0,00075
Почки 0,002 до 0,024	0,084С + 0,00011	0,064С + 0,00024
Молоко 0,002 до 0,024	0,062С + 0,00036	0,006С + 0,00082

---