МУК 4.1.1807-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств флудиоксонила в ботве и корнеплодах сахарной свеклы, зеленом горошке и зерне гороха методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 18.12.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУДИОКСОНИЛА В БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, ЗЕЛЕНОМ ГОРОШКЕ И ЗЕРНЕ ГОРОХА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (проф. Т.В. Юдина), Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (гл. специалист А.П. Веселов), под редакцией член-корр. РАМН В.В. Ракитского.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (прот. № 20 от 2 декабря 2003 г.).

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 18 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

1. ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Фирма-производитель: Сингента Кроп Протекши АГ (Швейцария).

Торговое название: МАКСИМ, ЦЕЛЕСТ, САПФИР.

Действующее вещество: флудиоксонил.

4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-пиррол-3-карбонитрил (ИЮПАК).

4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-1Н-пиррол-3-карбонитрил (С.А.).

Структурная формула не приводится.

Эмпирическая формула: C H F № O . 12 6 2 2 2

Молекулярная масса: 248,2.

Белое кристаллическое вещество без запаха.

Температура плавления: 199,8 °С.

Плотность при 20 °С: 1,54 кг/куб. дм. -4

    Давление паров при 25 °С: 3,9 х 10   мПа.
    Коэффициент   распределения  н-октанол/вода: К   log  Р = 4,12

                                              ow

(25 °С).

Растворимость (г/л) при 25 °С: ацетон — 190, этанол — 44, н-октанол — 20, толуол — 2,7; растворимость в воде и гексане соответственно 1,8 и 7,8 мг/л.

Вещество не гидролизуется при температуре до 70 °С и в диапазоне рН от 5 до 9.

В условиях природного освещения флудиоксонил деградирует с периодом полуисчезновения 9 — 10 дней.

    В   биологически   активных   почвах   в   аэробных   условиях
флудиоксонил  быстро  разлагается  или переходит в прочносвязанное
состояние: DT   = 10 - 25 дней.

         50

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс и мышей > 5000 50 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс > 2000 мг/кг; 50 острая ингаляционная токсичность (LC ) для крыс > 2,6 мг/куб. м 50

воздуха.  Флудиоксонил   не  оказывает  раздражающего  действия на
слизистые   оболочки  глаз   и   кожу   кроликов  и   не  обладает

тератогенным, мутагенным и онкогенным эффектами.

Фунгицид практически нетоксичен для птиц, рыб, пчел, диких животных, дождевых червей, дафний и водорослей.

Гигиенические нормативы для флудиоксонила в России: ОБУВ в воздухе рабочей зоны — 1,0 мг/куб. м; ПДК в воде водоемов — 0,1 мг/куб. м (органолепт.); ОДК в почве — 0,2 мг/кг; МДУ в зерне хлебных злаков и кукурузы, картофеле — 0,02 мг/кг.

Область применения препарата

Флудиоксонил — контактный фунгицид широкого спектра действия. Высокоэффективен против снежной плесени, твердой головни, гельминтоспориозной и фузариозной корневых гнилей на зерновых злаках, а также ризоктониоза, склеротиниоза, серой гнили и альтернариоза на винограде, косточковых плодовых, овощных и декоративных культурах.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Максим, КС (25 г флудиоксонила в 1 л препарата) в качестве фунгицида на посевах сахарной свеклы и гороха при предпосевной обработке семян с нормой расхода до 10 л/т.

2. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУДИОКСОНИЛА В БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, ЗЕЛЕНОМ ГОРОШКЕ И ЗЕРНЕ ГОРОХА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Метод основан на определении флудиоксонила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектором на обращенной фазе после его извлечения из ботвы, корнеплодов, зеленого горошка и зерна водным ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением действующего вещества в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2 Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания сахарной свеклы и гороха.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Таблица

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МЕТОДА

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Относительное отклонение, DS, %	Доверительный интервал среднего, %
Зеленый горошек	0,02	0,02 — 0,2	84,0	5,0	2,2	+/- 5,0
Зерно гороха	0,02	0,02 — 0,2	82,0	5,5	2,4	+/- 5,5
Ботва	0,02	0,02 — 0,2	83,1	3,8	1,7	+/- 3,8
Корнеплоды	0,02	0,02 — 0,2	82,3	4,3	1,9	+/- 4,0

2.2. Реактивы, растворы, материалы

Флудиоксонил, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,8% (Сиба, Швейцария).

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Железо (П) сернокислое, х.ч., ГОСТ 4148-78.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий углекислый, ГОСТ 83-63.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Этилацетат, ГОСТ 22300-76.

Эфир диэтиловый, ГОСТ 6265-74.

Смесь н-гексана и диэтилового эфира в объемном соотношении 4:1.

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (8:2, по объему).

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (50:50, по объему).

Силикагель 60 (0,06 — 0,2 мм) для колоночной хроматографии, I степени активности по Брокману (Мерк, ФРГ) или аналогичный.

Стекловата.

Целит 535 (2 — 15 мкм) (Серва, Германия) или аналогичный.

Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 6-09-1678-77.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Кромасил 100 — С18 или Диасорб 130 — С10 CN (АО БиоХимМак; РФ 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ).

Шприц для ввода образцов в жидкостной хроматограф.

Аппарат для встряхивания АВУ, ТУ 64-1-1081-83.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74.

Ротационный испаритель, тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная.

Прибор для перегонки при атмосферном давлении.

Сушильный шкаф.

Сито с диаметром отверстий 1 мм.

Баня водяная, ТУ 46-22-603-75.

Вакуумный водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147-73.

Воронки делительные вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные вместимостью 50, 100 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы грушевидные вместимостью 50, 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колонка хроматографическая, стеклянная, длиной 25 см и диаметром 10 мм.

Цилиндры мерные вместимостью 10, 50, 100 и 500 мл, ГОСТ 1770-74.

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74Е.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы ботвы и корнеплодов свеклы и зеленый горошек хранят при температуре 0 — 4 °С в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживаются и хранятся при температуре -18 °С. Отобранные пробы зерна гороха высушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Перед анализом ботву и зеленый горошек измельчают ножницами, корнеплоды измельчают на терке, а зерно размалывают на мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора углекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 55 мл воды с добавлением 1,54 г концентрированной серной кислоты), затем эфир последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Отмеряют 500 мл ацетонитрила, переносят в мерную колбу емкостью 1000 мл, добавляют 500 мл дистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

2.5.3 Кондиционирование колонки

Промывают колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил — вода (50:50, по объему) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включают детектор и дожидаются стабилизации базовой линии (5 — 15 минут).

2.5.4 Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор флудиоксонила с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г вещества, содержащего 99,8% д.в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °С не более 3 месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора флудиоксонила соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Растворы хранят в холодильнике не более недели.

2.5.5 Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора флудиоксонила с концентрацией 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации флудиоксонила в растворе в мкг/мл.

2.5.6 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,0 см вставляют тампон из стекловаты и медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля I степени активности по Брокману в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего слоя сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 0,5 см. Колонку промывают 20 мл смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7 Проверка хроматографического поведения флудиоксонила на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора флудиоксонила с концентрацией 100 мкг/мл, отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл элюента № 1 и наносят на подготовленную колонку. Промывают колонку 80 мл элюента № 1 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 2.7.

Фракции, содержащие флудиоксонил, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания флудиоксонила может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1 Экстракция флудиоксонила

2.6.1.1. Ботва, зеленый горошек, корнеплоды. Навеску (25 г) измельченного растительного материала помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, добавляют 125 мл 80%-ного водного ацетонитрила и гомогенизируют в течение 5 минут при 8000 об./мин. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 мл. Остаток на фильтре промывают 50 мл 80%-ного ацетонитрила. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту (30 — 35 мл), эквивалентную 5 г растительного материала. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.2. Зерно. Навеску (10 г) размолотого зерна гороха помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 75 мл 80%-ного водного ацетонитрила и перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают 30 мл 80%-ного ацетонитрила. Из объединенного экстракта отбирают половину объема раствора (около 50 мл), эквивалентную 5 г зерна. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2 Очистка экстрактов

Аликвоты растительных экстрактов (из пп. 2.6.1.1 и 2.6.1.2) переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, добавляют 20 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. Гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильную фракцию упаривают до водной фазы (5 — 10 мл) на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный раствор переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, добавляют 20 мл бидистиллированной воды и 20 мл смеси гексан — диэтиловый эфир (4:1, по объему) и встряхивают в течение 1 минуты. Собирают верхний слой (фаза гексан — эфир), содержащий флудиоксонил, и водную фазу повторно обрабатывают 20 мл смеси гександиэтиловый эфир. Объединенный гексан-эфирный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

2.6.3 Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 растительных экстрактов, количественно переносят тремя 1-мл порциями элюента № 1 (смесь гексан — этилацетат, 8:2) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Флудиоксонил элюируют 80 мл смеси гексан — этилацетат (8:2), отбрасывая первые 40 мл элюента и собирая последующие 40 мл в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Полученный раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток экстрактов растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 2.7.

2.7. Условия хроматографирования

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США).

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Kromasil 100 — С18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (50:50, по объему).

Скорость потока элюента: 0,7 мл/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Время удерживания флудиоксонила — около 9 мин.

Линейный диапазон детектирования — 2,5 — 25 нг.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб-130-С10 CN.

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (51:49).

Время удерживания флудиоксонила: около 8 мин.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание флудиоксонила рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                         Н  х А х V
                          1

Х = ----------, Н х m 0

где:
Х - содержание флудиоксонила в пробе, мг/кг;
Н  - высота пика стандарта, мм;
 0
H  - высота пика образца, мм;
 1
А - концентрация стандартного раствора флудиоксонила, мкг/мл;
V  - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,

мл; m — масса анализируемой части образца, г (для всех объектов — 5 г).

3. ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

4. КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5. РАЗРАБОТЧИКИ

Талалакина Т.Н., науч. сотр.; Макеев А.М., зав. лаб., канд. биол. наук.

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел.: 592-92-20.

---