МУК 4.1.1803-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств ипродиона в зеленой массе, семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 18.12.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИПРОДИОНА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (проф. Т.В. Юдина), Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (гл. специалист А.П. Веселов), под редакцией член-корр. РАМН В.В. Ракитского.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (прот. № 20 от 2 декабря 2003 г.).

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 18 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

Фирма-регистрант: Авентис.

Торговое наименование: Ровраль.

Действующее вещество: ипродион (ISO).

Структурная формула (не приводится).

3-(3,5-дихлорфенил)-N-изопропил-2,4-диоксоимидазолин-1-карбоксамид (IUPAC).

    Брутто формула: C  H  O N Cl .
                     13 13 3 3  2

Мол. масса: 330,17.

Химически чистый препарат — белое кристаллическое вещество без запаха.

Температура плавления: 134 °С. Давление паров при 25 °С: -4

5 х 10   мПа.
    Коэффициент    распределения    н-октанол/вода:    К   log Р =

                                                    ow

= 3,0 (рН 3 и 5).

Растворимость (г/л) при 20 °С: гексан — 0,59, толуол — 150, дихлорметан — 450, н-октанол — 10, ацетонитрил — 168, этилацетат — 225, ацетон — 342; в воде — 13 мг/л (20 °С).

Вещество относительно стабильно в кислых средах, гидролизуется в щелочных средах (ДТ < 1 час при рН 9). Класс токсичности по 50 ВОЗ — III.

МДУ в продукции (мг/кг): подсолнечник (семена и масло) — н.д.

Область применения: контактный фунгицид, используется на подсолнечнике, рапсе, рисе, хлопке, овощных, плодовых, ягодных и зерновых культурах.

2. Методика определения ипродиона в зеленой массе, семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на извлечении ипродиона из растений, семян и масла подсолнечника водно-ацетоновым раствором с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем. Количественное определение проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора.

2.1.2 Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов анализируемых проб и сочетанием условий хроматографирования.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0,95
Зеленая масса	0,02	0,02 — 0,4	84,5	5,8	5,1
Семена	0,02	0,02 — 0,2	85,1	5,1	4,5
Масло	0,02	0,02 — 0,2	78,6	6,6	5,8

Таблица 2

ПОДСОЛНЕЧНИКА (N = 5 ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение, S, мг/кг	Доверительный интервал, (Р = 0,95, n = 6), %	Полнота определения, %
1	2	3	4	5	6
Зеленая масса	0,02	0,0165	0,0017	6,8	82,5
	0,04	0,0327	0,0023	4,6	81,8
	0,1	0,0819	0,0054	4,3	81,9
	0,4	0,3672	0,0172	3,4	91,8
Среднее					84,5
Семена	0,02	0,0181	0,0010	4,0	90,5
	0,04	0,0324	0,0017	3,4	81,0
	0,1	0,0861	0,0051	4,1	86,1
	0,2	0,1658	0,0063	2,5	82,9
Среднее					85,1
Масло	0,02	0,0158	0,0036	7,2	79,0
	0,04	0,0318	0,0034	6,5	79,2
	0,1	0,8010	0,0085	5,8	80,1
	0,2	0,1522	0,0380	3,8	76,1
Среднее					78,6

2.2. Реактивы и материалы

Аналитический стандарт ипродиона 99,5%.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры «белая лента», ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Диэтиловый эфир, ч., ОСТ 84-2006-88.

Железо (II) сернокислое, х.ч., ГОСТ 4148-78.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, х.ч., ГОСТ 6552-80.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (57:43, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 — 0,063 mm) (Merck, Германия) или Флорисил 150 — 250 мю m (Merck, Германия).

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (90:10, по объему).

Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (75:25, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный.

Колонка Symmetry — С18 (230 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Предколонка Waters Symmetry С-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Хроматографическая стеклянная колонка длиной 300 мм, диаметром 10 мм.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных материалов хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Для длительного хранения пробы семян подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение 6 месяцев. Перед анализом пробы семян подсолнечника измельчают на лабораторной мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

    Органические  растворители перед началом работы очищают, сушат
и  перегоняют  в  соответствии  с общепринятыми методиками. Гексан

встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты

до  прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают
водой,  2%-ным  раствором  гидроксида  натрия и снова водой, после
чего  его  сушат  над  гидроксидом  натрия  и  перегоняют.  Ацетон
перегоняют  над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г
KMnO   и   2  г  K CO ).  Ацетонитрил (х.ч.) сушат над пентоксидом
    4             2  3
фосфора  и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют

над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.

2.5.3 Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г

98% (или 0,57 г 87%) кристаллической H PO  помещают в мерную колбу
                                      3  4
объемом  1 л, растворяют  в 600 мл дистиллированной воды и доводят

объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления подвижной

фазы  смешивают  570  мл  ацетонитрила  с 430 мл 0,005 М раствором
ортофосфорной  кислоты  в  колбе  на 1000 мл, смесь фильтруют, при
необходимости   дегазируют.  Смесь  растворителей  ацетон - гексан
50:10 (по  объему)  готовят  смешиванием  500 мл ацетона  и 100 мл
н-гексана в  колбе объемом 1000 мл. Для приготовления элюента  N 1
в колбе на 100 мл смешивают 90 мл н-гексана и 10  мл  этилацетата.
Для приготовления элюента N 2 в  колбе  на  100 мл смешивают 75 мл

н-гексана и 25 мл этилацетата.

2.5.4 Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску ипродиона (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота (57:43, по объему). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение недели, градуировочные растворы — в течение рабочего дня.

Растворы ипродиона для внесения в образец при определении полноты извлечения готовят растворением навески ипродиона (10 мг) в 200 мл гексана с последующим разбавлением гексаном в 50 и 100 раз в мерных колбах на 50 и 100 мл.

2.5.5 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация ипродиона в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации ипродиона в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан — этилацетат (10:90, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан — этилацетат (25:75, по объему) и 30 мл смеси гексан — этилацетат (10:90, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7 Проверка хроматографического поведения ипродиона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора ипродиона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента № 1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента № 1, который отбрасывают, затем 60 мл элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание ипродиона по п. 2.6.4 в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание ипродиона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания ипродиона может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8 Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1 Экстракция ипродиона из зеленой массы и семян подсолнечника

Навеску измельченных растений или семян подсолнечника массой 10 г помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают 50 мл смеси растворителей ацетон — вода (в соотношении 1:1) и экстрагируют ипродион в ультразвуковой ванне 10 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр (белая лента). Экстракцию повторяют с 50 мл той же смеси. Объединенный фильтрат упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40° до полного удаления ацетона.

Экстракт переносят в делительную воронку, добавляют 30 мл хлористого метилена и встряхивают в течение 5 минут. После расслоения нижний метиленхлоридный слой собирают, водный раствор экстрагируют в делительной воронке еще дважды по 30 мл хлористого метилена. Объединенные экстракты сушат, пропуская через слой безводного сернокислого натрия (5 г), и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Далее проводят очистку на колонке по п. 2.6.3.

2.6.2 Экстракция ипродиона из масла подсолнечника

Навеску масла, массой 10 г растворяют в 60 мл смеси растворителей ацетон — гексан (50:10, по объему), раствор помещают в делительную воронку объемом 250 мл, затем аккуратно (без взбалтывания!) приливают 40 мл дистиллированной воды. После расслоения отделяют нижний водно-ацетоновый слой от гексанового. К гексановому раствору масла добавляют 50 мл ацетона, встряхивают, затем аккуратно приливают 40 мл дистиллированной воды — экстракцию повторяют дважды. Объединенный водно-ацетоновый экстракт помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С на 1 час, после чего фильтруют через слой минеральной ваты <*> и упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона (объема 100 — 120 мл).

---

<*> Во избежание нагревания охлажденный экстракт в процессе фильтрации следует подливать в воронку небольшими (10 — 15 мл) порциями.

Водный экстракт переносят в делительную воронку, добавляют 30 мл хлористого метилена и встряхивают смесь в течение 5 минут. После полного расслоения <**> нижний метиленхлоридный слой собирают, водный раствор экстрагируют в делительной воронке еще дважды порциями по 30 мл хлористого метилена. Объединенные экстракты сушат, пропуская через слой безводного сернокислого натрия (5 г) и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Далее проводят очистку на колонке по п. 2.6.3.

---

<**> При образовании сравнительно стойкой эмульсии для ускорения расслоения можно добавить несколько мл этилового спирта или насыщенного раствора хлористого натрия.

2.6.3 Очистка экстрактов

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по пп. 2.6.1 и 2.6.2 экстрактов зеленой массы, семян и масла подсолнечника, количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан — этилацетат (90:10, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 50 мл элюента № 1, которые отбрасывают. Ипродион элюируют 60 мл элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry — С18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Температура колонки 30 °С.

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 57:43 (по объему). Скорость потока элюента: 1 мл/мин. Рабочая длина волны 225 нм.

Объем вводимой пробы 20 мкл. Линейный диапазон детектирования 0,1 — 5,00 мкг/мл.

Время удерживания ипродиона 11,5 +/- 0,2 мин.

2.6.5 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание ипродиона в образце зеленой массы, семян или масла подсолнечника (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

                         S  х С х V
                          2

Х = ----------, S х Р 1

где:
S  - площадь пика ипродиона в стандартном растворе, кв. мм;
 1
S  - площадь пика ипродиона в анализируемой пробе, кв. мм;
 2
V   -  объем  пробы,  подготовленной  для  хроматографического

анализа, мл; Р — навеска анализируемого образца, г; С — концентрация стандартного раствора ипродиона, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств ипродиона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор ипродиона 5 мкг/мл, разбавляют.

3. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции «Основные правила безопасной работы в химической лаборатории», общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5. Разработчики

Юзихин О.С., Черменская Т.Д., Цибульская И.А., Долженко В.И.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений. Санкт-Петербург.

---