МУК 1.2.3834-22. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Методические указания по идентификации металлосодержащих наночастиц в органах, тканях и биологических средах лабораторных животных. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 30.12.2022)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 30 декабря 2022 года

1.2 ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ МЕТАЛЛОСОДЕРЖАЩИХ НАНОЧАСТИЦ В ОРГАНАХ, ТКАНЯХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 1.2.3834-22

1. Разработаны ФБУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Роспотребнадзора (д.м.н. М.П. Сутункова, И.Г. Шеломенцев, Д.Р. Шаихова, д.б.н. Э.А. Минигалиева) при участии ООО «Сайтегра» (к.х.н. И.В. Чистяков).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 декабря 2022 г.

3. Введены впервые.

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок выполнения работ по подготовке образцов, полученных в токсикологическом эксперименте, и их анализ с целью получения данных о миграции металлосодержащих наночастиц (далее — НЧ) в органы, ткани, биологические среды лабораторных животных для исследования оценки безопасности НЧ.

1.2. МУК предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими, научно-исследовательскими и иными организациями, занимающимися вопросами оценки безопасности наноматериалов.

1.3 МУК носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. Для токсиколого-гигиенических исследований важным этапом является выявление и идентификация НЧ в органах — мишенях в особенности в органах, богатых клетками ретикулоэндотелиальной системы (в селезенке и печени).

2.2. МУК основаны на исследовании образцов органов/тканей/биологических сред лабораторных животных методом просвечивающей растровой электронной микроскопии (далее — ПРЭМ) с применением энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (далее — ЭДРС).

2.3. Данный метод является универсальным для всех типов органов/тканей лабораторных животных.

2.4. При идентификации НЧ в биологических средах, объектом исследования выступают клетки, являющиеся одним из основных компонентов данной биосреды.

2.5. Мероприятия по проведению детекции НЧ методом электронной микроскопии (далее — ЭМ) и ЭДРС: отбор проб, их упаковка, маркировка и транспортирование в лабораторию, проводящую исследования, подготовка материала для исследования <1>.

<1> МУ 1.2.2741-10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных» (далее — МУ 1.2.2741-10); МР 1.2.2641-10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах» (далее — МР 1.2.2641-10).

III. Принцип метода

3.1. Использование экспериментальных моделей на животных для выявления и идентификации локализации НЧ зависит от способа воздействия на организм животных, который может соответствовать условиям возможной экспозиции человека:

• пероральный (и отчасти транскутанной) — при загрязнении НЧ водоемов;
• ингаляционный, интраназальный, интратрахеальный — при загрязнении воздуха рабочих помещений или атмосферного воздуха;
• внутривенный — предназначен для исследований в диагностических или лечебных целях.

3.2. После окончания экспериментального периода проводятся исследования по определению локализации НЧ методом ПРЭМ. Данный метод реализуется за счет облучения тонкого образца сфокусированным электронным пучком и детектирования прошедших электронов. Положение зонда (сфокусированного пучка электронов) меняется отклоняющими катушками оптической системы таким образом, чтобы траектория зонда проходила по параллельным линиям, образующим прямоугольную область сканирования. Физический размер зонда определяется размером источника электронов и свойствами оптической системы микроскопа.

Размер площади сканирования обратно пропорционален увеличению и может меняться в широких пределах от единиц миллиметров до десятков нанометров. Таким образом, становится возможным получение информации на различных масштабах, что существенно облегчает проведение исследований.

3.3. Изображение в ПРЭМ светлого поля образуется за счет способности различных веществ материалов по-разному рассеивать электроны. При равномерной толщине объекта участки, содержащие более тяжелые элементы, рассеивают электронный пучок сильнее, чем участки, содержащие более легкие элементы. Это приводит к тому, что детектором прошедших электронов, расположенным на оптической оси ниже образца, выдается более высокий уровень сигнала при облучении легких участков.

Методом ПРЭМ светлого поля визуализируются электронно-контрастные участки тонкого образца, которые при соблюдении правильной пробоподготовки, классифицируются как содержащие более тяжелые элементы.

3.4. Для более точной идентификации электронно-контрастных участков, часто применяется методика ПРЭМ-ЭДРС, которая представляет собой комбинацию метода ПРЭМ и метода ЭДРС.

ЭДРС — метод определения качественного и количественного состава образцов за счет детектирования и анализа спектра рентгеновской флуоресценции. Спектры рентгеновской флуоресценции для каждого элемента индивидуальны, не зависят от степени окисления. Анализ возможен для любых элементов от Be до U, а также их комбинаций.

3.4.1. Возбуждение рентгеновской флуоресценции в методах РЭМ-ЭДРС и ПРЭМ-ЭДРС происходит за счет энергии первичного электронного пучка, которым исследуется образец в электронном микроскопе. За счет высокой локальности возбуждения и отсутствия груши рассеяния методом ПРЭМ-ЭДРС идентифицируется элементный состав НЧ.

3.4.2. Обработка полученных спектров алгоритмами расчета состава позволяет, в зависимости от пробоподготовки, типа объекта и условий съемки, получать данные о составе с различной погрешностью. Количественное определение состава возможно для гладких однородных образцов при использовании набора стандартов для калибровки.

3.4.3. Для наиболее часто встречающихся реальных образцов количественный анализ состава затруднен из-за ряда факторов, поэтому для быстрого отнесения обнаруженных частиц к той или иной группе по признаку состава используется полуколичественный анализ состава методом ЭДРС.

3.4.4 Таким образом, совместное использование методов ПРЭМ и ЭДРС позволяет:

• обнаружить отдельные НЧ и их скопления в срезах органов/тканей/биологических сред;
• идентифицировать элементный состав обнаруженных НЧ;
• оценить характеристики НЧ, обнаруженных в срезах органов/тканей/биологических сред (размер и форма).

IV. Приборы, оборудование, реактивы и расходные материалы

4.1. При выполнении измерений и подготовки проб применяют приборы, оборудование, реактивы и расходные материалы, приведенные в таблицах 1 - 4.

Характеристики и требования к приборам, оборудованию, инвентарю, реактивам и расходным материалам соответствуют методическим документам <2>.

<2> МУ 1.2.2741-10; МР 1.2.2641-10.

Таблица 1

Приборы

Таблица 2

Оборудование и инвентарь

Таблица 3

Реактивы

Таблица 4

Расходные материалы

4.1.1 Приготовление химических реактивов.

4.1.1.1. Приготовление химических растворов проводится в соответствии с методическими документами <3>.

<3> Пункт 5.1.3.3 МР 1.2.2641-10.

4.1.1.2. Для приготовления растворов рекомендуется использовать в качестве буфера — тригидрат какодилата натрия.

Примечание: на всех этапах фиксации и дофиксации должен использоваться буфер одного типа — фосфатно-солевой буфер (далее — PBS) или натрий-какодилатный буфер (далее — BSA).

4.1.1.3 Приготовление маточных растворов.

4.1.1.3.1 Приготовление 10 Н раствора NaOH.

Для приготовления 100 см3 10 Н раствора NaOH в стеклянный стакан, содержащий 50 см3 дистиллированной воды, внести 40 г NaOH. NaOH растворить при перемешивании на водяной/ледяной ванне. После его полного растворения объем раствора довести до 100 см3 дистиллированной водой.

4.1.1.3.2 Приготовление 1 М раствора HCl.

Для приготовления 1 М раствора HCl в мерную колбу объемом 100 см3 внести 8 см3 концентрированной HCl и довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой.

4.1.1.3.3 Приготовление 0,2 М раствора PBS, pH 7,2 — 7,4.

Для приготовления 0,2 М раствора PBS в мерную колбу объемом 1000 см3 внести навески: 6,2 г KH₂PO₄ x H₂O; 33,64 г K₂HPO₄ x 2H₂O; 17,4 г KCl, растворить в 500 см3 дистиллированной воды. После полного растворения довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой. Измеряется pH. До необходимого pH довести добавлением 1 М HCl или 1 Н NaOH.

4.1.1.3.4 Приготовление 0,2 М раствора BSA, pH 7,2 — 7,4.

Для приготовления 0,2 М раствора BSA в мерную колбу объемом 100 см3 внести 4,28 г сухого Na-какодилата растворить в 50 — 70 см3 дистиллированной воды. После полного растворения довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой. Измеряется pH. До необходимого pH довести добавлением 1 М HCl или 1 Н NaOH.

4.1.1.4 Приготовление рабочих растворов.

4.1.1.4.1 Приготовление 1 Н раствора NaOH.

Для приготовления 100 см3 1 Н раствора NaOH к 10 см3 10 Н раствора NaOH добавить 90 см3 дистиллированной воды.

4.1.1.4.2 Приготовление раствора 0,1 М HCl.

Для приготовления 100 см3 0,1 М раствора HCl к 10 см3 1 М раствора HCl добавить 90 см3 дистиллированной воды.

4.1.1.4.3 Приготовление 0,1 М раствора PBS.

Для приготовления 100 см3 0,1 М раствора PBS к 50 см3 0,2 М раствора PBS добавить 50 см3 дистиллированной воды.

4.1.1.4.4 Приготовление 0,1 М раствора BSA.

Для приготовления 100 см3 0,1 М раствора BSA к 50 см3 0,2 М раствора BSA добавить 50 см3 дистиллированной воды.

4.1.1.4.5. Приготовление раствора для фиксации: 2,5% глутаровый альдегид на фосфатно-солевом буфере.

Для приготовления 100 см3 раствора для фиксации в мерную колбу внести 50 см3 0,2 М раствора PBS, 10 см3 коммерческого препарата глутарового альдегида (25% водный раствор) и 5 см3 коммерческого препарата формалина (40% водный раствор). На pH-метре доводят pH буфера до 6,9 добавлением 1 М HCl или 1 Н NaOH. Далее довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой.

4.1.1.4.6. Приготовление раствора для фиксации: 2,5% глутаровый альдегид на BSA.

Для приготовления 100 см3 раствора в мерную колбу внести 50 см3 0,2 М раствора BSA, 10 см3 коммерческого препарата глутарового альдегида (25% водный раствор) и 5 см3 коммерческого препарата формалина (40% водный раствор). На pH-метре доводят pH буфера до 6,9 добавлением 1 М HCl или 1 Н NaOH. Далее довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой.

4.1.1.4.7 Приготовление 50%-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1000 см3, содержащую 479 см3 дистиллированной воды, внести 521 см3 96%-го коммерческого этилового спирта.

4.1.1.4.8 Приготовление 60%-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1000 см3, содержащую 375 см3 дистиллированной воды, внести 625 см3 96%-го коммерческого этилового спирта.

4.1.1.4.9 Приготовление 80%-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1000 см3, содержащую 167 см3 дистиллированной воды, внести 833 см3 96%-го коммерческого этилового спирта.

4.1.1.4.10 Приготовление смеси эпоксидных смол.

Приготовление эпоксидных смол производить согласно инструкции производителя.

4.1.1.4.11 Приготовление смеси эпоксидных смол и ацетона 1:3.

Для приготовления смеси в колбу объемом 100 см3 внести 25 см3 смеси эпоксидных смол и прилить 75 см3 ацетона. Тщательно перемешать.

4.1.1.4.12 Приготовление смеси эпоксидных смол и ацетона 1:1.

Для приготовления смеси в колбу объемом 100 см3 внести 50 см3 смеси эпоксидных смол и прилить 50 см3 ацетона. Тщательно перемешивают.

4.1.1.4.13 Приготовление смеси эпоксидных смол и ацетона 3:1.

Для приготовления смеси в колбу объемом 100 см3 внести 75 см3 смеси эпоксидных смол и прилить 25 см3 ацетона. Тщательно перемешивают.

4.1.1.4.14 Приготовление 0,3%-го раствора формвара в дихлорэтане.

Для приготовления 100 см3 раствора 30 см3 коммерческого 1%-го раствора формвара внести в мерную колбу с притертой крышкой. Туда же прилить 70 см3 1,2-дихлорэтана. Тщательно перемешать. Раствор хранить в темноте в плотно укупоренной посуде.

4.1.1.4.15. Приготовление красителя: 4%-го раствора толуидинового синего на 1%-м тетраборате натрия.

Для приготовления 100 см3 красителя навеску 4 г порошка толуидинового синего и 1 г тетрабората натрия поместить в плотно закрывающуюся посуду. Прилить 100 см3 дистиллированной воды. Интенсивно перемешивать в течение 30 минут вручную, на шейкере или вортексе. Перед применением выдержать не менее суток. Хранить в темноте. Перед использованием перемешивать и отфильтровать через микрофильтр 0,22 мкм.

4.1.2. Подготовка оборудования, приборов и сопутствующих инструментов для отбора и подготовки проб к анализу.

4.1.2.1. Подготовка оборудования, приборов и сопутствующих инструментов для подготовки проб к анализу производится согласно инструкциям производителя.

4.1.2.2. Подготовка сеток/блендов для ультратонких срезов проводится в соответствии с методическими документами <4>.

<4> Пункт 5.1.5.4 МР 1.2.2641-10.

4.1.2.3 Приготовление пленки:

4.1.2.3.1. дистиллированная вода фильтруется через мембранный фильтр (нейлон или PES) с размером пор не более 0,22 мкм и наливается в широкую емкость до образования выпуклого мениска. При появлении пыли на поверхности воды произвести смену воды с трехразовой промывкой емкости отфильтрованной дистиллированной водой;

4.1.2.3.2. чистое предметное стекло опустить в емкость с 0,3%-м раствором формвара, вынуть, поставить стекло ребром на фильтровальную бумагу для удаления излишков раствора и высушить;

4.1.2.3.3. процарапать препаровальной иглой прямоугольник по краю стекла;

4.1.2.3.4. коротко подышать на стекло с формваровой пленкой и медленно погрузить его в емкость с водой. В процессе погружения формваровая пленка отделится от стекла;

4.1.2.3.5. вымытые бленды помещаются на поверхность пленки с помощью пинцета;

4.1.2.3.6. поверх пленки с блендами/сетками настилают кусочек парафильма;

4.1.2.3.7. пленку вместе с парафильмом аккуратно снимают с поверхности воды и помещают в чашку Петри (пленкой вверх) для последующего высушивания;

4.1.2.3.8. бленды/сетки сушатся не менее 24 часов при комнатной температуре в закрытой чашке Петри.

4.1.2.4. Материал, из которого изготовлены бленды/сетки, не должен содержать идентифицируемый элемент.

4.2 Принципиальная схема алгоритма отбора образцов/проб.

4.2.1. Пробоотбор и анализ проб осуществляется согласно план-дизайну эксперимента и рис. 1.

Рис. 1. Принципиальная схема алгоритма отбора и анализа проб

4.2.2. У каждого животного (не менее 3) из исследуемых групп отбираются образцы органов/тканей или биологических сред. У крупных однородных по несколько образцов из разных участков (например, печень, мышцы). У неоднородных, например, головной мозг, сердце или почки, из заранее определенных план-дизайном участков.

4.2.3. Органы, ткани, биологические среды, содержащие в себе элементы, входящие в химический состав изучаемых НЧ, в качестве важных компонентов (например, печень или кровь в исследованиях железосодержащих НЧ) не отбираются и не подлежат анализу по данной методике.

4.2.4. Образцы делятся на 3 и более пробы (повторности) и фиксируются согласно п. 4.3.

4.2.5 Пробы подготавливаются к анализу согласно п. 4.4.

4.2.6. Пробы обследуются методом ЭМ с применением ЭДРС согласно п. 5.2 - 5.3.

4.2.7 Заключение, согласно гл. VI.

4.3. Отбор, транспортировка, хранение и фиксация проб органов, тканей и биологических сред.

4.3.1. Порядок отбор проб и транспортирования в лабораторию, проводящую исследования, а также их фиксация и хранение осуществляются в соответствии с методическими документами <5>.

<5> Пункты 4.6.12, 4.6.13, 4.7.4, 4.7.5 главы IV, глава V МУ 1.2.2741-10; пункт 5.1.5 МР 1.2.2641-10.

4.3.2. Отношение объема фиксатора к фиксируемому образцу должно быть не менее 10:1. Пробы от каждого образца помещают в отдельную маркированную пробирку. Пробы, направляемые в лабораторию, снабжают этикеткой и актом отбора проб, в котором указывают место, время отбора, объект, органы, подписи лиц, отбиравших пробу. Возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4 °C при регулярном контроле pH. Нельзя допускать замораживание образцов.

4.3.3. Для приготовления срезов тканей/органов для детекции НЧ методом ЭМ и ЭДРС разрезают полученные образцы тканей/органов острой бритвой на кусочки размером 1 * 1 * 1 мм (не менее 3 проб от одного образца ткани/органа), которые пинцетом переносят в пробирки с фиксатором (п. 4.1.2.4.5 или 4.1.2.4.6).

4.3.4. Кровь собирают асептически с использованием одноразовых инструментов в стерильную пробирку (1,5 — 2 см3) с антикоагулянтом ЭДТА (гепарин использовать нельзя). Клеточный осадок получают центрифугированием цельной крови в течение 10 мин при 2000 g сразу после отбора. Убирают плазму, оставляя клеточный осадок. В пробирку приливают фиксатор (п. 4.1.2.4.5 или 4.1.2.4.6). Клеточный осадок ресуспендируют в фиксаторе.

4.3.5. С пробами и актами отбора проб так же предоставляют сопроводительные документы с характеристиками вводимых НЧ: наименование вводимых НЧ, размер и форма.

4.4 Подготовка проб к анализу.

4.4.1. Пробоподготовка проб для детекции НЧ методом ЭМ и ЭДРС, включающую в себя отмывку, дегидратацию, инфильтрацию и полимеризацию смол, проводится в соответствии с методическими документами <6>, (см. табл. 5).

<5> Пункты 4.6.12, 4.6.13, 4.7.4, 4.7.5 главы IV, глава V МУ 1.2.2741-10; пункт 5.1.5 МР 1.2.2641-10.

Таблица 5

Подготовка проб органов, тканей и биологических сред для детекции НЧ методом ЭМ и ЭДРС

4.4.2. Клетки крови предварительно осаждаются и спрессовываются центрифугированием в течение 20 мин при 2000 g. Далее пробоподготовка и анализ проводятся аналогично органам и тканям.

4.4.3. Полученные блоки закрепляют в специальном держателе. Острой бритвой под бинокулярным микроскопом снимается излишек смолы в 5 направлениях от пробы и затачивают в виде усеченной пирамиды.

4.4.4. Для подтверждения наличия пробы в плоскости среза изготовляются полутонкие срезы толщиной 0,3 — 1,0 мкм и перемещаются на предметное стекло. Срезы окрашиваются 4% раствором толуидинового синего на 1%-м тетраборате натрия в течение 15 секунд на плитке при температуре плюс 60 °C. После чего краситель смывается дистиллированной водой.

4.4.5. На ультрамикротоме с помощью алмазного или стеклянного ножа получают ультратонкие срезы толщиной 50 — 100 нм (не менее 5 шт.). Срезы переносят на бленды или сетки, покрытые формваровой пленкой и высушивают не менее 1 ч на воздухе.

4.4.6. При использовании РЭМ в режиме детектирования прошедших электронов в качестве оборудования для визуализации, рекомендуется напыление пленки углерода толщиной 2 — 5 нм на срез (сетку/бленд) для снятия заряда с поверхности и стабилизации изображения. Нанесенный слой не оказывает влияния на определение характеристик НЧ, так как является электронно- и рентгенопрозрачным в условиях съемки.

V. Методика проведения анализа проб

5.1. Подготовка оборудования, приборов и сопутствующих инструментов для анализа.

5.1.1. Характеристики оборудования, приборов и сопутствующих инструментов.

5.1.1.1 Характеристика микроскопа.

5.1.1.1.1 РЭМ для проведения исследования должен иметь следующие характеристики:

• разрешение не должно превышать 2 нм (необходимо проведение анализа ЭДРС для НЧ);
• необходимо наличие приставок ПРЭМ и ЭДРС;
• фиксатор блендов/сеток не должен содержать идентифицируемый элемент;
• желательно наличие холодной ловушки;
• в случае использования безоконного ЭДРС детектора необходимо наличие шлюза для замены образца для уменьшения времени простоя.

5.1.1.2 Характеристики ЭДРС приставки.

5.1.1.2.1. Приставка ЭДРС для проведения исследования должна иметь площадь не менее 60 мм2.

5.1.2 Подготовка приборов к анализу.

5.1.2.1. Подготовка электронного микроскопа перед исследованием должна осуществляться квалифицированным оператором в соответствии с инструкцией пользователя.

5.1.2.2. В зависимости от минимального размера анализируемых частиц, необходимо выбирать увеличение ЭМФ и разрешение в пикселах так, чтобы было возможно определить одновременно и форму, и размер НЧ.

5.1.2.3. Принимается, что для корректной обработки информации о форме частиц необходимо получить изображение частицы с количеством пикселов не менее пяти пикселов на частицу по каждому измерению. Таким образом, выбор увеличения проводят при помощи таблицы 6, полученной в предположении, что увеличение микроскопа рассчитывается для стандартного размера изображения 127 x 95 мм.

Таблица 6

Зависимость размера пикселя от увеличения, разрешения изображения и ширины поля зрения (при L = 127 мм)

5.1.2.4 При заданном увеличении M, ширина поля зрения составит:

l = \frac{L}{M} (1)

где: L — ширина изображения, мм;

l — ширина поля зрения, мм;

M — увеличение электронного микроскопа, крат.

5.1.2.5 Тогда при разрешении 1280 x 960 пикселей, размер пикселя Dп составит:

D_{\text{п}} = \frac{l}{N_{\text{п}}} (2)

где: Nп — количество пикселей, шт.

5.2 Порядок анализа проб.

5.2.1. Общий обзор срезов для обнаружения и идентификации скоплений НЧ.

5.2.1.1. Перед проведением анализа необходимо убедиться, что данные ЭДРС для области без наличия электронно-контрастного материала не показывают наличия искомых элементов.

5.2.1.2. После настройки микроскопа в режиме ПРЭМ проводят предварительный просмотр образца с небольшим увеличением (10000 — 25000 x). Цель такого просмотра — выявить наличие областей скопления электронно-плотного материала, сделать предварительную оценку размера выявляемых НЧ и идентифицировать их элементный состав.

5.2.1.3. Области неоднородного скопления электронно-контрастного материала подвергают анализу с учетом выполнения условия, приведенного в п. 5.1.2.3. От разных участков образца в пределах каждой обнаруженной области захватывают 3 — 5 изображений, в которых должны быть представлены основные (по форме, размеру) типы обнаруженных электронно-контрастных включений. Если таких областей больше 6, то по выбору оператора анализируют 6 областей неоднородного скопления электронно-контрастного материала. ЭМФ НЧ необходимо сохранять в файл, обращая внимание на то, чтобы на изображениях была масштабная метка.

5.2.1.4. Измерение ЭМФ в режиме ПРЭМ дополняют данными ЭДРС в соответствии с инструкцией пользователя приставки. Данные ЭДРС используются для подтверждения элементного состава НЧ. Если набор элементов НЧ содержит в составе элементы вводимых НЧ, данная НЧ считается значимой, данные ее исследования, такие как ЭМФ и данные ЭДРС сохраняются.

5.2.1.5. После завершения съемки образца полученные данные сохраняются в виде отдельных изображений для дальнейшей обработки. Данные анализа ЭДРС квантифицируются с использованием программного обеспечения приставки ЭДРС.

5.2.2. Точечное исследование срезов для обнаружения и идентификации одиночных НЧ.

5.2.2.1. После общего обзора срезов проводится точечное исследование для обнаружения и идентификации одиночных НЧ с увеличением 25000 — 100000 x с учетом выполнения условия, приведенного в п. 5.1.2.3.

5.2.2.2 Анализируются не менее 5 срезов из серии в каждой пробе.

5.2.2.3. На каждом срезе обследуется не менее 20 участков, равномерно распределенных по срезу (рис. 2).

Рис. 2. Пример распределения обследуемых участков по площади ультратонкого среза

5.2.2.4. При обнаружении одиночных НЧ ЭМФ необходимо сохранять в файл, обращая внимание на то, чтобы на изображениях была масштабная метка.

5.2.2.5. Измерение ЭМФ в режиме ПРЭМ дополняют данными ЭДРС в соответствии с инструкцией пользователя приставки. Данные ЭДРС используются для подтверждения элементного состава НЧ. Если набор элементов НЧ содержит в составе элементы вводимых НЧ, данная НЧ считается значимой, данные ее исследования, такие как ЭМФ и данные ЭДРС сохраняются.

5.3 Обработка данных.

5.3.1. В случае обнаружения вводимых НЧ производится измерение диаметра этих частиц по сохраненным ЭМФ. Для обработки ЭМФ и измерений рекомендуется использовать специализированное ПО для обработки и анализа изображений, например, (англ. Image Tool), (англ. Altami Studio) или (англ. ImageJ). Результаты вносятся в таблицу 7 с указанием формы НЧ.

Таблица 7

Шаблон рекомендуемой таблицы размеров и формы идентифицированных частиц

VI. Представление результатов

6.1. По результатам анализа готовится заключение (приложение к настоящим МУК).

6.1.1 Описание проб:

• номер животного;
• номера образца органа/ткани/биологической среды;
• номера проб;
• орган/ткань/биологическая среда;
• отдел/область.

6.1.2 Характеристики вводимых НЧ:

• наименование вводимых НЧ;
• размер;
• форма;
• метод введения НЧ.

6.1.3. В случае обнаружения НЧ в письменном заключении указывается факт наличия НЧ в образце органа/ткани/биологической среды с описанием среднего размера со среднеквадратическим отклонением и формы. В противном случае указывается, что НЧ не были обнаружены.

6.1.4. Составляется перечень исполнителей по выполняемым операциям с указанием должности и подписью.

6.1.5. В случае обнаружения НЧ в пробах, в приложении к заключению необходимо предоставить ЭМФ НЧ в пробах со спектрами ЭДРС данной области (приложение к настоящим МУК).

Приложение к МУК 1.2.3834-22

Пример заключения идентификации металлосодержащих наночастиц в тканях лабораторных животных

Результаты исследования

Проба № 1. В срезах пробы № В-0130-3 обнаружены наночастицы Pb O.

Результаты исследования

Проба № 2. В срезах пробы № В-0130-2 наночастицы PbO не обнаружены.

Проба № 3. В срезах пробы № В-0130-3 обнаружены наночастицы Pb O.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Федеральный закон от 30.12.2020 № 492-ФЗ «О биологической безопасности в Российской Федерации».

3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.09.2007 № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов».

4. Руководство Р 1.2.3156-13 «Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека».

5. МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов».

6. МУ 1.2.2741-10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

7. МУ 1.2.3699-21 «Подходы к экспериментально-токсикологическому обоснованию предельно допустимых концентраций наночастиц в воздухе рабочей зоны».

8. МР 01-19/24-17 «Методические рекомендации по использованию клеточных систем „ин витро“ и „ин виво“ для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей».

9. МР 1.2.2641-10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах».

10. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».

11. ГОСТ 23932 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия».

12. ГОСТ 21241 «Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

13. ГОСТ 21240 «Скальпели и ножи медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

14. ГОСТ 4328 «Натрия гидроокись. Технические условия».

15. ГОСТ 3118 «Кислота соляная. Технические условия».

16. ГОСТ 4198 «Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия».

17. ГОСТ 2493 «Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия».

18. CAS № 6131-99-3 «Натрий какодилат тригидрат».

19. CAS № 111-30-8 «Глутаровый альдегид».

20. ГОСТ 1625 «Формалин технический. Технические условия».

21. CAS № 92-31-9 «Толуидиновый синий».

22. ГОСТ 4199 «Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия».

23. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».

24. ГОСТ 5962 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».

25. ГОСТ 2603 «Ацетон. Технические условия».

26. CAS № 63148-64-1 «Формвар».

27. ГОСТ 1942 «1,2-Дихлорэтан технический».

28. ГОСТ 32337 «Перчатки медицинские диагностические нитрильные».

29. ГОСТ Р 51243 «Бритвенные системы для влажного бритья. Общие технические условия».

30. ГОСТ 9284 «Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия».

31. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

32. ГОСТ 12026 «Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия».

33. Цитологические и биохимические особенности жидкости, получаемой при бронхоальвеолярном лаваже у крыс после интратрахеального введения наноразмерных меднооксидных частиц // Л.И. Привалова, Б.А. Кацнельсон, Н.В. Логинова [и др.] // Токсикологический вестник. 2014. № 5(128). С. 8 — 15. EDN ZCORWJ.

34. Sutunkova, M.P., Minigalieva, I.A., Shelomencev, I.G. et al. Electron microscopy study on the transport of lead oxide nanoparticles into brain structures following their subchronic intranasal administration in rats. Sci Rep 12, 19444 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24018-7.