МР 3.1.0281-22. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика и профилактика лихорадки Ку. Методические рекомендации
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 08.04.2022)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 8 апреля 2022 г.
3.1 ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР, ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ЛИХОРАДКИ КУ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 3.1.0281-22 <*>
<*> МР 3.1.0281-22 введены взамен методических рекомендаций «Лабораторная диагностика лихорадки Ку», утвержденных Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации 20.12.1995 № 01-19/124-17, методических рекомендаций «Эпидемиологический надзор за лихорадкой Ку», утвержденных заместителем министра здравоохранения — Главным государственным санитарным врачом РСФСР 20.03.1980.
I. Область применения
1.1. Настоящие методические рекомендации (далее — МР) определяют организацию и порядок проведения эпидемиологического надзора, лабораторную диагностику и профилактику лихорадки Ку.
1.2. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами организаций, осуществляющих лабораторную диагностику лихорадки Ку.
II. Общие положения
2.1. Лихорадка Ку <1> (коксиеллез) — зоонозная инфекция, вызываемая Coxiella burnetii, с потенциальной возможностью перехода в хроническую форму. Возбудитель лихорадки Ку относится ко II группе патогенности. Человек высоко восприимчив к C. burnetii, особенно при аэрогенном механизме заражения <2>. Лихорадка Ку характеризуется длительным и самостоятельным существованием очагов сельскохозяйственных животных (как при бруцеллезе), наличием на отдельных территориях смешанных природно-хозяйственных (антропоургических) очагов, разнообразными путями передачи возбудителя, развитием распространенного ретикулоэндотелиоза, клинически сопровождающегося лихорадкой, интоксикацией, полиморфной симптоматикой.
<1> Код A78 раздел «Риккетсиозы» Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10, Всемирная организация здравоохранения, г. Женева, 1995, Т. 1 (Ч. 1).
<2> Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.R., Garrity G.M. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Ed, Vol 2, Proteobacteria, Part B (The Gammaproteobacteria). Springer, New York. 2005; 1 — 1136.
2.2. Организация и проведение санитарно-противоэпидемических мероприятий и мероприятий в эпидемическом очаге <3> по предупреждению возникновения и распространения лихорадки Ку осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <4>.
<3> Пункты 1426 - 1447 главы XVII СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» (далее — СанПиН 3.3686-21).
<4> Пункт 1448 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
2.3. Возбудитель лихорадки Ку — Coxiella burnetii — относится к классу гамма-протеобактерий, порядку Legionellales, семейству Coxiellaceae, роду Coxiella, являясь единственным видом с валидным названием в этом роде. Coxiella-подобный эндосимбионт Candidatus Coxiella mudrowiae генотипирован в клещах Rhipicephalus turanicus. ДНК Coxiella-подобных эндосимбионтов выявлена у 60 видов иксодовых и аргасовых клещей <5>. C. burnetii экологически связана с членистоногими и позвоночными, вызывая заболевание у большого числа видов домашних, промысловых и диких млекопитающих, птиц и человека.
<5> GenBank — база данных, содержащая аннотированные последовательности ДНК, РНК и белков: www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank (в свободном доступе).
2.4. Геном C. burnetii представлен молекулой ДНК размером от 1969211 п.н. у штамма C. burnetii RSA439 до 2158758 п.н. у штамма Dugway 5J108-111 (приложение 1 к настоящим МР). Содержание G+C% в хромосоме составляет примерно 43%, в плазмиде — 39 — 40%. C. burnetii имеет несколько типов плазмид: pQpHl, QpRS, QpDG и QpHl.
2.5. Штаммы C. burnetii выделены от человека, мелкого рогатого скота (далее — МРС) — коз и овец, крупного рогатого скота (далее — КРС), широкого круга диких позвоночных и членистоногих (приложение 1 к настоящим МР). Наибольшей вирулентностью для человека отличаются штаммы, выделенные от коз. Штаммы C. burnetii разных генотипов отличаются по степени эффективности заражения различных видов хозяев. Штаммы, которые преимущественно выделяются от коз и человека, очень редко выделяются от КРС и наоборот, что указывает на более высокую восприимчивость людей и коз к штаммам одного генотипа. Плазмиды не являются определяющим фактором патогенности C. burnetii, так как могут отсутствовать у штаммов (CbuG_Q212), вызывающих эндокардит у человека, и содержать плазмиду (QpDG) у авирулентного для морских свинок штамма. Плазмидо-подобные нуклеотидные последовательности могут быть интегрированы в хромосому (CbuG_Q212).
2.6. C. burnetii длительно выживает во внешней среде, высоко устойчива к физическим факторам (солнечные и ультрафиолетовые лучи, ионизирующая радиация, высокая температура), химическим (эфир) и дезинфицирующим (хлороформ, толуол) средствам. В 1%-м растворе фенола C. burnetii сохраняются до 1 суток, в 0,5%-м растворе формалина до 4 суток. Во влажной среде при температуре 80 — 90 °C выживают около 30 минут, при кипячении погибают в течение 5 минут. При низких температурах C. burnetii сохраняет жизнеспособность при температуре минус 5 — 8 °C в течение нескольких месяцев. В сыром молоке, хранящемся в холодильнике, сохраняется до 25 дней, в сливочном масле, в домашнем сыре, брынзе — несколько месяцев; в мясе — до 30 дней; во внутренних органах, костях, мышцах и лимфатических узлах инфицированных туш — в течение 1 месяца и более; в овечьей шерсти, смушках — от 2 до 6 месяцев. В замороженных инфицированных мясных и молочных продуктах C. burnetii остается жизнеспособной в течение всего срока хранения.
2.7. Для обеззараживания C. burnetii применяется химический метод с использованием хлорактивных (хлорамин с содержанием активного хлора (далее — АХ) не менее 24%; гипохлорит кальция с АХ 45 — 54%; 15%-е осветленные растворы, содержащие не менее 5% АХ; гипохлорит натрия с АХ не менее 14%; раствор с 1%-м АХ) и кислородоактивных (30%-я перекись водорода медицинская; 3,0 — 10%-е растворы перекиси водорода) дезинфицирующих средств.
III. Эпидемиологические особенности лихорадки Ку
3.1. Для человека основными источниками заражения C. burnetii являются овцы, козы, крупный рогатый скот. Отмечаются случаи заражения от собак, лошадей, верблюдов, яков, кошек, пушных животных в звероводческих хозяйствах, птицы в птицеводческих хозяйствах, декоративной птицы и других животных.
3.2. Заражение человека с наибольшей частотой происходит прямо или опосредовано от сельскохозяйственных животных. Ведущее значение имеют аспирационный (преобладает в очагах МРС) и контактный пути передачи, меньшее — алиментарный (преимущественно в очагах КРС) (приложение 2 к настоящим МР). С учетом высокой устойчивости C. burnetii во внешней среде особое значение имеет «пылевая инфекция». Трансмиссивный механизм передачи человеку C. burnetii может осуществляться при уходе за сельскохозяйственными животными в период сезонной активности клещей с помощью контаминационного пути передачи при втирании в поврежденную кожу или слизистую содержимого раздавленного клеща.
Факторами передачи C. burnetii человеку от больного животного служат сырье животного происхождения (шерсть, пух, шкуры), мясомолочные продукты, предметы ухода за животными, экскременты и другие объекты, инфицированные C. burnetii (приложение 2 к настоящим МР).
Аборты и окоты у инфицированных животных сопровождаются массивным и длительным выделением C. burnetii с абортированным плодом, околоплодными водами, плацентой, выделениями из половых и родовых путей. Происходит контаминация кожных покровов и шерсти животных, стойла, подстилок, предметов ухода, помещения, остатков кормов, а также пастбищ и мест водопоя. C. burnetii выделяются больными животными с мочой и молоком от нескольких месяцев до года и более.
3.3. Для лихорадки Ку характерна выраженная весенне-летняя сезонность, связанная с окотом, отелом и абортами инфицированных C. burnetii животных, а также с сезонной активностью клещей. Летний период характеризуется ростом числа контактов населения с очагами лихорадки Ку, производством и употреблением мясомолочных продуктов от животных индивидуального поголовья и уходом за ними. Спорадические случаи инфекции регистрируют в эндемичных районах круглый год.
3.4. Эпидемиологическое значение имеют неблагополучные по лихорадке Ку козоводческие и овцеводческие хозяйства с преобладанием наиболее вирулентных для человека штаммов C. burnetii, в которых чаще возникают вспышечные случаи заболевания людей. На фермах КРС регистрируется спорадическая заболеваемость.
3.5. Человек не принимает участия в передаче C. burnetii и эпидемиологического значения не имеет.
3.6. Инкубационный период у человека при лихорадке Ку колеблется от 3 до 32 дней и составляет в среднем 1 — 2 недели. Инфекция характеризуется полиморфизмом клинической картины, часто подострым и хроническим течением. Клинически лихорадка Ку у человека проявляется лихорадкой, другими общетоксическими симптомами, развитием бронхита, специфической атипичной пневмонии, поражением центральной нервной системы и других систем организма. При хронизации инфекционного процесса развивается эндокардит.
3.7. Лица, переболевшие лихорадкой Ку, приобретают длительный иммунитет. После перенесенного заболевания в сыворотке крови сохраняются антитела к антигенам возбудителя, что выражается в появлении и накоплении агглютининов, опсонинов, комплементсвязывающих антител и веществ, нейтрализующих токсическую субстанцию C. burnetii. Применение вакцины создает иммунитет, который сохраняет наивысшую напряженность в течение 5 — 6 месяцев.
3.8. Лихорадка Ку поражает население всех возрастных групп, болеют преимущественно лица трудоспособного возраста. Заболеваемость лихорадкой Ку в большинстве случаев носит профессиональный характер. К группам профессионального риска относятся работники животноводческих (МРС, КРС) хозяйств, ферм, боен, пунктов стрижки МРС, шерстеобрабатывающих, кожевенных и мясоперерабатывающих предприятий, молочных заводов, а также ветеринарные работники и персонал бактериологических лабораторий, работающий с материалом и культурами C. burnetii. Мужчины болеют чаще, чем женщины, что обусловленно социальными аспектами, условиями труда, различной степенью участия мужчин и женщин в трудовых процессах.
IV. Эпидемиологический надзор за лихорадкой Ку
4.1. Порядок организации и осуществления эпидемиологического надзора за лихорадкой Ку проводят органы, уполномоченные на осуществление федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <6>.
<6> Пункты 1426 - 1448 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
4.2. Характер и объемы проводимых мероприятий определяются исходя из эпидемической и эпизоотической обстановки. Мероприятия планового порядка в первую очередь осуществляются на объектах наибольшего риска, наиболее манифестно характеризующих складывающуюся ситуацию. К ним относятся, прежде всего, предприятия по переработке шерсти и пуха, мясокомбинаты, крупные животноводческие комплексы.
4.3. Основными методами эпидемиологического надзора являются ретроспективный и оперативный эпидемиологический анализ, эпидемиологическое слежение (мониторинг), включая зоолого-энтомологический мониторинг за соответствующей территорией, с применением методов углубленного эпидемиологического обследования очагов.
4.4. Эпидемиологический надзор за лихорадкой Ку среди людей представляет собой непрерывное наблюдение за динамикой эпидемического процесса, факторами и условиями, влияющими на его распространение. Целью эпидемиологического надзора является получение и оценка объективной эпидемиологической информации для разработки, осуществления и корректировки адекватных санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий, направленных на недопущение распространения инфекции среди людей и формирования эпидемических очагов.
4.5 Задачи эпидемиологического надзора за лихорадкой Ку:
- объективная оценка и характеристика распространения лихорадки Ку на каждой конкретной территории;
- выявление тенденций развития эпидемического процесса;
- выявление регионов, областей, населенных пунктов и организаций с высоким уровнем заболеваемости и риском инфицирования;
- выявление контингентов, наиболее подверженных риску заражения;
- выявление причин и условий, определяющих уровень и структуру заболеваемости лихорадкой Ку на каждой конкретной территории;
- контроль и оценка качества и эффективности осуществляемых профилактических и противоэпидемических мероприятий для их оптимальной корректировки (разработка управленческих решений);
- разработка прогноза эпидемической ситуации.
4.6 Эпидемиологический надзор за лихорадкой Ку включает:
- мониторинг заболеваемости лихорадкой Ку людей с учетом условий районирования (территориальности), сезонности, цикличности эпидемических и эпизоотических процессов;
- мониторинг за циркуляцией возбудителя;
- мониторинг за уровнем охвата вакцинопрофилактикой лиц, профессиональная деятельность которых связана с риском заражения лихорадкой Ку;
- оценку эпидемической ситуации и эффективности проводимых профилактических и противоэпидемических мероприятий;
- прогнозирование развития эпидемической ситуации.
4.7. Эпидемиологический надзор за лихорадкой Ку основан на результатах эпидемиологической, клинической и лабораторной диагностики.
4.7.1. Важным разделом эпидемиологического надзора за лихорадкой Ку является эпидемиологический анализ, который подразделяется на ретроспективный и оперативный.
4.7.2. Ретроспективный эпидемиологический анализ включает изучение многолетней и помесячной динамики заболеваемости населения лихорадкой Ку, анализ эпизоотологической ситуации на конкретной территории с определением факторов риска заболевания и причинно-следственных связей.
Ретроспективный эпидемиологический анализ включает следующее:
- характеристику многолетней динамики заболеваемости лихорадкой Ку с учетом отдельных территорий, среднемноголетних показателей заболеваемости и их тенденций (рост, снижение, стабилизация), темпов роста (прироста) или снижения;
- анализ заболеваемости лихорадкой Ку по годам, месяцам, эпидсезонам;
- изучение структуры заболеваемости по возрасту, полу, профессии, субъектам хозяйственной деятельности и месту жительства;
- распределение заболеваемости по характеру клинических проявлений и тяжести клинического течения;
- анализ многолетних данных о циркуляции C. burnetii по результатам лабораторных исследований материала от людей и животных (данные ветеринарной службы);
- изучение особенностей штаммов C. burnetii (биовары, генотипы);
- анализ факторов риска, включая сведения об эпизоотическом состоянии по лихорадке Ку административной территории, населенного пункта.
При изучении распространения эпидемических проявлений лихорадки Ку на территории осуществляется ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости за максимально длительный период. В работе могут использоваться архивные материалы, карты эпидемиологического обследования очага инфекционного заболевания, карты амбулаторных больных, истории болезни, другая документация. Анализируется территориальное распределение заболеваний в разрезе административных территорий (областей, районов, отдельных населенных пунктов), ландшафтных зон, экономических районов на основе абсолютных и интенсивных показателей заболеваемости за различные периоды.
Сбору и последующему анализу подлежат данные о сезонности заболеваний (с вычислением индекса сезонности), профессиональном составе заболевших (доля отдельных групп в процентах и интенсивные показатели в соответствующей группе), распределении по полу и возрасту (абсолютные данные и в интенсивных показателях на изучаемую группу), соотношении заболеваемости городского и сельского населения. Для более полного представления о динамике эпидемического процесса эффективно изучение сравниваемых показателей за определенные относительно большие периоды времени (десятилетия, пятилетия).
При анализе данные сводятся в таблицы, используются рисунки, диаграммы, картографические методы, что позволяет более наглядно выявить основные эпидемиологические закономерности распространения лихорадки Ку и уточнить предположения об источниках и факторах передачи инфекции.
В ходе ретроспективного эпидемиологического анализа учитываются результаты серологических обследований лихорадящих больных и различных групп населения на лихорадку Ку, а также сельскохозяйственных и диких животных.
Анализ иммунологической структуры населения к возбудителю лихорадки Ку проводится по тем же критериям, что и заболеваемости (по возрасту, профессиональным и бытовым группам, территориальным закономерностям и др.). Важное значение имеет анализ частоты иммунных ответов к C. burnetii среди различных профессиональных групп, прежде всего групп повышенного риска (животноводы, ветеринарные работники, работники предприятий по переработке сырья животного происхождения и др.). Значительное преобладание процента положительных результатов среди лиц повышенного риска свидетельствует о преимущественно профессиональном характере заболевания, отсутствие существенной разницы между процентом положительных результатов среди лиц повышенного риска и остальным населением — о значении животных индивидуального сектора в инфицировании людей возбудителем лихорадки Ку. Об этом же свидетельствуют результаты обследования лиц в возрасте до 14 лет. Возрастная структура иммунных ответов к возбудителю лихорадки Ку может использоваться для выяснения длительности существования очага.
Учитывая эпидемическую значимость очагов лихорадки Ку среди сельскохозяйственных животных (МРС, КРС), при ретроспективном эпидемиологическом анализе проводится изучение результатов проведенного при расшифровке вспышек серологического обследования этих животных. Следует учитывать вид животных, у которых преобладали антитела к возбудителю лихорадки Ку (чаще МРС и КРС), сельскохозяйственное направление (молочное, откормочное, репродуктивное) и тип хозяйства (индивидуальное, акционерное). Анализ указанных данных дает возможность определить вероятные источники и факторы передачи инфекции в очагах, что позволяет уточнить эпидемиологические закономерности, выявленные при анализе заболеваемости. В результате ретроспективного эпидемиологического анализа раскрываются закономерности эпидемического процесса на данной территории, эпидемическая ситуация по лихорадке Ку в целом, а также территории риска, группы риска, конкретные факторы риска.
4.7.3. Оперативный эпидемиологический анализ осуществляется за установленный промежуток времени, основывается на данных регистрации первичных диагнозов и позволяет своевременно установить изменения эпидемической ситуации и их причины.
Оперативный эпидемиологический анализ позволяет выяснить текущую эпидемическую ситуацию на определенной территории с целью своевременного проведения предупредительных мер в отношении лихорадки Ку и санации очагов при их появлении, осуществляется с учетом данных ретроспективного анализа, а также результатов изучения текущей заболеваемости, материалов лабораторных исследований, данных обследования очагов в динамике. Его реализация связана с использованием методов санитарно-эпидемиологической разведки. При оперативном эпидемиологическом анализе применяются те же принципы и методы, что и при ретроспективном.
При проведении оперативного эпидемиологического анализа значительное место уделяется методам активного наблюдения и специальным катамнестическим исследованиям отдельных случаев и вспышек с последующим информированием с целью своевременного и полноценного проведения противоэпидемических мер в очагах, предупреждения вспышек и снижения заболеваемости лихорадкой Ку.
Проведение ретроспективного и оперативного анализов позволяют своевременно выявить предпосылки и причины осложнения эпидемической ситуации при лихорадке Ку.
4.7.4 Предпосылками, способными обусловить возникновение случая лихорадки Ку у человека, являются:
- возникновение новых неблагополучных по лихорадке Ку пунктов разведения (хозяйств) мелкого и крупного рогатого скота;
- увеличение заболеваемости лихорадкой Ку на территории соседних районов, особенно в приграничных территориях;
- рост численности сельскохозяйственных животных эпидемиологически значимых видов (МРС, особенно коз), заболевших лихорадкой Ку;
- завоз сельскохозяйственных животных эпидемиологически значимых видов из хозяйств с территорий, неблагополучных по лихорадке Ку.
4.7.5 Предвестниками активизации эпидемического процесса являются:
- регистрация случаев заболевания людей лихорадкой Ку в количестве, превышающем среднемноголетний уровень для изучаемой административной территории;
- регистрация эпидемических очагов лихорадки Ку с групповой заболеваемостью на территории с неблагополучными по данной инфекции пунктами разведения МРС.
4.7.6. При регистрации впервые выявленных заболеваний лихорадкой Ку проводится эпидемиологическое расследование, осуществляемое в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <7>.
<7> Пункты 1414 - 1417 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
4.8 Эпидемиологический мониторинг.
Наблюдение за ситуацией по лихорадке Ку на соответствующей территории является существенным разделом эпидемиологического надзора и включает методы санитарно-эпидемиологической разведки и углубленного эпидемиологического обследования очагов. Основная его задача — используя минимально необходимый объем эпидемиологических и лабораторных исследований, получить оптимальную информацию о распространении и активности очагов лихорадки Ку. С этой целью проводится работа в нескольких ключевых направлениях.
4.8.1 Серо-эпидемиологическое обследование населения.
При осуществлении данной работы проводится серологическое обследование (ИФА, РСК с антигеном из C. burnetii II-й фазы) длительно лихорадящих больных с нетипичным течением пневмоний, затяжными бронхитами, острыми респираторными заболеваниями и другими инфекционными формами, если диагноз не подкреплен достаточными клинико-эпидемиологическими и лабораторными данными. На энзоотичных по лихорадке Ку административных территориях ежегодно проводится серологическое обследование местного населения на наличие антител к возбудителю. Проводится серологическое обследование (группы риска) — животноводов, ветеринарных работников, рабочих мясокомбинатов, персонала молочных комбинатов, фабрик по обработке шерсти, хлопка и других предприятий по переработке сырья животного и растительного происхождения, а также доноров из числа практически здоровых сельских жителей. Анализ полученных данных позволяет уточнить распространение очагов лихорадки Ку и особенности контакта населения с возбудителем. Проводить эту работу наиболее целесообразно в населенных пунктах с повышенной заболеваемостью острыми респираторными инфекциями и лихорадочными состояниями неясной этиологии. При наличии очага лихорадки Ку проводится активное выявление больных и переболевших. Анализируются записи в амбулаторных картах и историях болезни, собирается подробный эпидемиологический анамнез у переболевших, проводятся подворные обходы. Лица с подозрением на перенесенное заболевание лихорадкой Ку подвергаются серологическому обследованию и, при необходимости, дополнительному клиническому обследованию и специфическому лечению. При анализе перенесенных заболеваний обращается внимание на такие симптомы, как лихорадка длительностью более 5 дней, резкие головные, мышечные и суставные боли, резко повышенная потливость, наличие лейкопении, увеличение печени и селезенки, длительные остаточные явления и симптомы нарушения вегетативной нервной системы, астенизация, пониженная работоспособность. При сборе эпидемиологического анамнеза обращается внимание на наличие на протяжении 2 недель, предшествующих заболеванию, контакта с животными общественного и индивидуального секторов, продуктами животного происхождения (шерсть, пух и др.), а также с сеном, соломой, хлопком и другими материалами, которые могут быть инфицированы возбудителем лихорадки Ку.
Переболевшие лихорадкой Ку подлежат диспансеризации.
4.8.2. Определение свежевыделенных источников и факторов передачи инфекции.
Основываясь на данных эпидемиологического анализа, осуществляется контроль за эпизоотическим состоянием по лихорадке Ку, определение источников и факторов передачи инфекции. При выявлении в хозяйстве заболеваний животных с клиническими признаками, напоминающими лихорадку Ку (лихорадка, аборты и др.), и (или) выявлении случаев (вспышек) этой инфекции среди людей проводится серологическая диагностика.
4.8.3. Выявление природных очагов и установление их связей с очагами среди сельскохозяйственных животных.
При анализе особенностей распространения лихорадки Ку необходимо установить связи выявленных хозяйственных очагов с природными. С этой целью осуществляется зоолого-энтомологический мониторинг, сбор и анализ информации о численности и распределении по территории субъекта Российской Федерации диких и домашних животных, включая мелких млекопитающих, представителей отрядов парнокопытных (Artiodactyla) и непарнокопытных (Perissodactyla) животных, а также иксодовых клещей в природных биотопах и на животных. Обобщение оперативных результатов зоолого-энтомологического мониторинга осуществляется профильным специалистом — руководителем зоогруппы (зоолог) учреждения ежегодно к 15 июня и 15 ноября. При этом используются следующие материалы:
- зоолого-энтомологического, эпизоотологического мониторинга в природных очагах инфекций;
- оценка распространения и численности млекопитающих и птиц (объекты животного мира, отнесенные и не отнесенные к охотничьим ресурсам), в том числе, зайцеобразных, копытных и хищных животных (кабан, лось, олень, косуля, лисица, волк и т.д.), голубей, ворон, грачей и т.д.;
- оценка распространения и численности поголовья сельскохозяйственных животных (коз, овец, КРС, лошадей, верблюдов и т.д.), регистрации случаев лихорадки Ку и объемов вакцинации против лихорадки Ку этих животных, объемов акарицидных обработок сельскохозяйственных животных и мест их выпаса.
На основании результатов исследования иксодовых клещей на наличие маркеров возбудителя лихорадки Ку и изучения степени контакта сельскохозяйственных животных с переносчиками определяется характер взаимосвязи природных и хозяйственных очагов с дифференциацией на устойчивую и интенсивную взаимосвязь, слабую непостоянную связь и практически полное отсутствие связей, что имеет существенное прогностическое значение.
Наиболее эпизоотически напряженные очаги и длительное эпидемическое неблагополучие территорий отмечаются в условиях устойчивых и интенсивных взаимосвязей природных и внутристадных циклов возбудителя. При разрыве такой взаимосвязи в очагах отмечается тенденция к снижению их эпизоотической и эпидемической активности.
V. Методика осуществления эпидемиологического надзора
5.1 Ландшафтно-эпидемиологическое районирование территорий.
На первом этапе эпидемиологического надзора на основе изучения природных и хозяйственных предпосылок существования очагов и результатов их эпидемиологического обследования выделяются ландшафтно-эпидемиологические зоны (районы), отличающиеся по условиям существования очагов и риску инфицирования населения. Между ландшафтами и ведущими направлениями хозяйственной деятельности существует взаимосвязь, что создает возможность дифференцирования степени распространения очагов на ландшафтно-эпидемиологической основе. Предварительное ландшафтно-эпидемиологическое районирование территорий является основой для разработки тактики обеспечения мониторинга и его осуществления.
5.2 Дифференциация территорий по риску заражения населения.
Задачей дифференциации эндемичных территорий является выделение зон высокого, среднего и низкого риска заражения. В качестве основных критериев при этом используются следующие данные:
- эпидемиологического мониторинга (среднемноголетние показатели заболеваемости на 100 тыс. населения, результаты в процентах серологического обследования с помощью ИФА (ранее — РСК) лихорадящих больных и иммунологического (серологического) обследования профессиональных групп повышенного риска);
- зоолого-энтомологического, эпизоотологического мониторинга, в том числе выявление больных (инфицированных) сельскохозяйственных и диких животных, результаты индикации ДНК (антигена).
Дифференциация показателей по степени риска инфицирования приведена в приложении 3 к настоящим МР. Оценка риска заражения населения осуществляется в разрезе административных районов по преобладанию показателей. Результаты дифференциации территорий по риску заражения населения могут быть представлены картографически на основе составления картосхем. Эпидемиологическая дифференциация территорий является основой для разработки комплексов предупредительных мероприятий, ориентированных на конкретные территории и зоны.
5.3. Зоолого-энтомологический, эпизоотологический мониторинг в природных очагах лихорадки Ку.
5.3.1. При энтомологическом мониторинге проводится учет численности иксодовых клещей на ключевых участках территории (не менее 100 — 150 экз. с одного участка), осуществляется сбор, определение видов и исследование экспресс- и риккетсиологическими методами. Двукратного выявления инфицированности переносчиков достаточно для подтверждения существования природного очага лихорадки Ку. Природные очаги подлежат мониторингу, включая определение пространственной и функциональной структуры. Для изучения характера связей между природными и внутристадными очагами особое значение имеет сбор и исследование иксодовых клещей, собранных с выпасаемых сельскохозяйственных животных. Для определения степени контакта сельскохозяйственных животных с переносчиками определяются индексы обилия и встречаемости иксодид на скоте. Иксодовые клещи собираются с не обработанных акарицидами животных. Учитывается число клещей на отдельных животных, результаты заносятся в журнал учета <8>. Выявляется степень контактов скота с переносчиками:
<8> МУ 3.1.3012-12 «Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих в природных очагах опасных инфекционных болезней».
- низкая (индекс обилия менее 1, индекс встречаемости до 10);
- средняя (1 — 3 и 10 — 30);
- высокая (более 3 и более 30 соответственно).
5.3.2. Зоологические работы — учеты численности мелких млекопитающих проводятся методом ловушко-линий в сроки и в объемах, предусмотренные действующими методическими документами по мониторингу в природных очагах инфекционных болезней, включая отработку не менее 5000 ловушко-суток в доступных стациях в один обзорный период <9>.
<9> МР 3.1.7.0250-21 «Тактика и объемы зоологических работ в природных очагах инфекционных болезней».
5.3.3. Отбор проб от млекопитающих и птиц (объекты животного мира, отнесенные и не отнесенные к охотничьим ресурсам) проводят зоологи при взаимодействии со специалистами природоохранных органов и организаций, включая особо охраняемые природные территории (заповедники). Сбор клещей, определение их видовой принадлежности, индекса обилия с добытых млекопитающих и птиц осуществляется энтомологами.
5.3.4. Молекулярно-биологические и серологические исследования материала от млекопитающих и птиц на инфицированность возбудителем лихорадки Ку проводятся в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы патогенности <10>. Пробы от клещей, животных и птиц, в которых при помощи серологических и молекулярно-биологических методов (глава VI) выявлены положительные результаты на лихорадку Ку, направляются в референс-центр по мониторингу за риккетсиозами <11> организацией, проводившей исследование. Порядок передачи и транспортирования проб зоолого-энтомологического материала (в части безопасной упаковки, маркировки и оформления документации) регламентирован санитарно-эпидемиологическими требованиями <12>.
<10> Пункт 1419 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
<11> В соответствии с приказом Роспотребнадзора № 1116 от 01.12.2017 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации» референс-центром по мониторингу за риккетсиозами является ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, официальный сайт: oniipi.org (в свободном доступе).
<12> Пункты 512 - 530 главы IV СанПиН 3.3686-21.
5.4. Тактика мониторинга и профилактических мероприятий в очагах различной эпидемической активности.
5.4.1 При подозрении на возникновение случаев лихорадки Ку среди людей осуществляются:
- анализ лихорадочных заболеваний, возникших за последние 6 месяцев, с учетом клинической картины и данных серологического обследования переболевших с неустановленным или сомнительным диагнозом;
- анализ эпизоотических предпосылок и экспресс-исследование предполагаемых источников и факторов передачи инфекции;
- принятие оперативных решений по результатам обследования.
5.4.2 При выявлении случаев заболевания лихорадкой Ку у людей проводятся:
- эпидемиологический анализ выявленных случаев;
- установление возможных источников и факторов передачи возбудителя инфекции;
- специфическая профилактика среди групп риска (при необходимости);
- мероприятия по усилению мер личной и общественной профилактики, в т.ч. санитарно-просветительская работа;
- уточнение результатов серологического обследования сельскохозяйственных животных — предполагаемых источников инфекции совместно с организациями, подведомственными Россельхознадзору, в субъекте Российской Федерации;
- экспресс-исследование материалов, подозрительных на наличие C. burnetii;
- выезд зоолого-энтомологической группы на предполагаемое место заражения для проведения эпизоотологического обследования территории с целью выявления очага инфекции, отбор проб для выявления возбудителя и отправка проб в специализированные лаборатории, при необходимости работу осуществляют при взаимодействии и информировании о результатах специалистов Россельхознадзора;
- систематическое уничтожение мелких млекопитающих в помещениях животноводческих хозяйств, на территории ферм, в местах хранения кормов;
- контроль эффективности противоэпизоотических, дезинфекционных и дератизационных мероприятий силами организации, осуществляющей мероприятия.
5.4.3. В антропоургических очагах лихорадки Ку ежегодно планово проводится отбор проб сена, соломы, шерсти в местах содержания сельскохозяйственных животных (фермы МРС, КРС, фермерские хозяйства и т.д.). Лабораторные исследования проводятся профильными лабораториями.
VI. Лабораторная диагностика лихорадки Ку
6.1. Постановка диагноза «лихорадка Ку» вследствие полиморфизма клинического течения осуществляется после лабораторного подтверждения. Лабораторная диагностика лихорадки Ку осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <13>.
<13> Пункты 1418 - 1422 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
6.2. Диагноз «лихорадка Ку» у человека считается установленным при лабораторном подтверждении любым из существующих методов (серологическим или молекулярно-биологическим), а также у больного с клиническими симптомами лихорадки Ку при подтвержденном случае коксиеллеза у контактного животного.
6.3 Рекомендуются следующие клинико-эпидемиологические показания к проведению обследования больных на лихорадку Ку:
- больные с лихорадкой различного типа более 5 дней и симптомами интоксикации различной степени выраженности;
- больные с лихорадкой и поражением дыхательной системы в виде бронхитов и пневмоний;
- больные с лихорадкой и экзантемой полиморфного характера;
- больные с лихорадкой и поражением гепатобиллиарной системы (гепатомегалия, желтуха различной интенсивности);
- больные, поступающие из природного очага лихорадки Ку.
Материалом для исследований на лихорадку Ку являются:
- от больных или подозрительных на заболевание людей: кровь и ее компоненты, мокрота, промывные воды бронхов, спинномозговая жидкость и др.;
- трупный материал: кровь, секционный материал органов и др.;
- материал от сельскохозяйственных и диких животных (органы, биологические жидкости, абортированные плоды), членистоногих;
- продовольственное сырье, продукция животного происхождения и др.;
- объекты окружающей среды: почва, вода, воздух и др.
6.4. Отбор, передача, транспортировка, хранение и исследование материала на лихорадку Ку выполняются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <14>. Отбор проб клинического материала для исследования, их упаковку и транспортирование осуществляет медицинский персонал.
<14> Пункты 493 - 506, 512 - 530 главы IV, пункты 1423 - 1424 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
6.5. Для лабораторной диагностики лихорадки Ку у человека и при осуществлении эпидемиологического надзора применяются иммунологические (серологические), молекулярно-биологические и биологические методы, которые предназначены как для выявления (и выделения) самого возбудителя (его ДНК и антигенов), так и антител к C. burnetii. При серологической диагностике применяются ИФА (РНИФ, РСК). У больных преобладают антитела к антигену C. burnetii II фазы; антитела к антигену I фазы преобладают при формировании хронического течения заболевания. Рекомендуется комплексное применение взаимодополняющих методик для объективной постановки диагноза и решения конкретных эпидемиологических задач.
6.6. Серологические и молекулярно-генетические исследования без накопления возбудителя могут проводиться в бактериологических лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы патогенности <15>. Исследования по выделению из материала от больных возбудителя инфекции или его генома, связанные с накоплением возбудителя (микробиологические, молекулярно-генетические исследования), проводятся в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на работу с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность микроорганизмами I — II групп патогенности <16>. Выявление C. burnetii и выделение культуры данного патогена при исследовании материала, полученного от животных, трупного материала или объектов окружающей среды осуществляется теми же методами, что и материала от больного человека.
<15> Пункт 1419 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
<16> Пункт 1420 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
6.7. При работе по выделению C. burnetii персонал лаборатории должен быть вакцинирован <17> и защищен от возможного аэрогенного заражения. Используется метод биопроб на морских свинках, беспородных белых мышах, культивирование в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов (далее — РКЭ) и культуре клеток, исследование иксодовых клещей. Указанные виды работ выполняют сотрудники аэрозольной лаборатории, удовлетворяющей требованиям к изолированной лаборатории 3 уровня, в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <18>. В такой лаборатории может осуществляться комплексное исследование материала (от больных людей и сельскохозяйственных животных, секционного материала, образцы из объектов окружающей среды: клещи, пищевые продукты, почва и др.) при лабораторной диагностике лихорадки Ку с последующим выделением штамма C. burnetii по схеме, приведенной в приложении 4 к настоящим МР.
<17> Пункт 1461 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
<18> Пункты 342 - 343 главы IV СанПиН 3.3686-21.
6.8. Лабораторная диагностика лихорадки Ку у людей осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями с использованием диагностических препаратов (медицинских изделий), зарегистрированных на территории Российской Федерации <19>. С применением медицинских изделий осуществляются серологические и молекулярно-биологические исследования при диагностике лихорадки Ку и выявлении ДНК C. burnetii в образцах окружающей среды (приложение 5 к настоящим МР).
<19> Пункт 1418 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
6.9 Индикация возбудителя лихорадки Ку.
6.9.1. Полимеразная цепная реакция. Наряду с серологическими методами постановка диагноза «лихорадка Ку» основывается на детекции ДНК C. burnetii в биологическом материале от больного (кровь, мокрота, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Для дифференциации штаммов применяется мультилокусный анализ вариабельных тандемных повторов (multiple locus variable-number tandem repeats analysis) (далее — MLVA). Для выявления ДНК C. burnetii в различных биологических материалах, включая пробы от сельскохозяйственных и диких животных, иксодовых клещей, используются различные варианты ПЦР с праймерами, комплементарными специфическим фрагментам генов плазмид и хромосомы.
6.9.2. Для выявления ДНК возбудителя лихорадки Ку методом ПЦР и ПЦР в режиме реального времени применяются разные генетические маркеры. С применением ПЦР-тест-систем обеспечивается высокая специфичность молекулярно-генетической детекции C. burnetii с отсутствием перекрестных реакций в отношении других возбудителей природно-очаговых инфекций. В то же время не исключается полностью вероятность детекции близкородственных микроорганизмов (Coxiella spp.), патогенность которых для человека к настоящему времени не установлена. В положительных пробах, учитывая широкое распространение Coxiella spp. у членистоногих (клещей разных таксономических групп), для их дифференциации от C. burnetii рекомендуется секвенировать протяженные фрагменты гена 16S рРНК (вариабельные локусы), генов groEL и rpoB. Также следует учитывать в некоторых случаях возможность присутствия в пробе ДНК нежизнеспособного патогена C. burnetii.
6.9.3. Работы по детекции ДНК C. burnetii выполняют в соответствии с методическими указаниями <20>.
<20> МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».
6.9.4. Исследуется материал от людей (цельная периферическая кровь, мокрота, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал: ткани мозга, сердца, легких, селезенка), животных (кровь, плацента, абортивный материал, секционный материал: селезенка) и иксодовые клещи (рода Rhipicephalus, Haemaphysalis, Dermacentor и Ixodes). Кровь, мокроту, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 суток. При поступлении в лабораторию проводится пробоподготовка крови, ликвора, промывных вод бронхов с получением бактериального осадка и с последующей экстракцией нуклеиновых кислот или проба замораживается для длительного хранения. Клещи хранятся живыми до 1 месяца или 1 неделю при температуре не выше минус 16 °C, далее при температуре не выше минус 68 °C. Секционный и абортивный материал, а также плацента хранятся 1 неделю при температуре не выше минус 16 °C, далее при температуре не выше минус 68 °C. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.
6.9.5. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены корректные результаты для положительного и отрицательного контроля амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК в соответствии с данными таблицы оценки результатов контрольных реакций.
6.10 Выделение возбудителя лихорадки Ку.
Из образцов проб, в которых было подтверждено наличие генетических мааркеров или антигенов C. burnetii, в специализированных лабораториях, имеющих разрешительную документацию на работу с возбудителем лихорадки Ку, может быть продолжена работа по выделению штамма методом биопроб и культуральными методами.
6.10.1. Культивирование C. burnetii в организме чувствительных лабораторных животных.
Для постановки биологических проб (далее — биопроб) при лихорадке Ку используется тот же материал, что и при постановке ПЦР. Для постановки биопроб используются морские свинки (250 — 300 г), белые мыши (12 — 14 г) и 7-дневные РКЭ.
Лабораторные животные используются для первичного накопления C. Burnetii, если исследуемые пробы обильно контаминированы посторонней микрофлорой. Контроль контаминации гетерологичными бактериями осуществляется на стандартных питательных средах.
Исследуемый материал растирается, добавляется стерильный физиологический раствор, тщательно эмульгируется и после отстаивания взвеси (или центрифугирования при малых оборотах) вводится внутрибрюшинно или подкожно подопытным морским свинкам (2 — 3 мл) или белым мышам (0,5 — 1,0 мл). При исследовании крови сыворотка отделяется стерильно от сгустка и используется для серологического исследования. Сгусток измельчается в гомогенизаторе (при необходимости растирается в ступке), эмульгируется в физиологическом растворе и вводится внутрибрюшинно лабораторным животным.
У морских свинок в результате заражения примерно через неделю развивается лихорадка (до 40 — 41 °C), продолжающаяся 5 — 7 дней. C. burnetii в большом количестве накапливаются в легких, печени и других органах. У белых мышей инфекция протекает в скрытой форме, с накоплением большого количества C. burnetii в селезенке на 7 — 9-й день после заражения.
Положительный результат экспериментов доказывается обнаружением возбудителя в мазках-отпечатках из органов животных микроскопией, детекцией ДНК C. burnetii, а также выявлением в сыворотке их крови специфических антител.
Серологическое исследование экспериментальных животных проводится первый раз через 25 — 30 дней, второй — через 2 месяца. При выявлении в сыворотке антител при первом исследовании животные забиваются, эмульсией селезенок заражаются РКЭ, параллельно проводят пассаж на свежих морских свинках.
6.10.2 Заражение морских свинок для выделения штаммов C. burnetii
Для воспроизведения лихорадки Ку чувствительной моделью являются морские свинки. Для заражения используется кровь больного, гомогенизаты различного происхождения (клещи, органы животных), смывы с объектов окружающей среды и др., в которых по данным ПЦР были обнаружены генетические маркеры C. burnetii, антигены C. burnetii с помощью ИФА или гомогенизаты селезенок лабораторных мышей, в которых по методу Гименеса было выявлено небольшое количество возбудителя.
Морские свинки (самцы) заражаются путем введения в брюшную полость инфекционного материала (лиофилизированная культура живых C. burnetii, суспензии из желточных мешков РКЭ, зараженных C. burnetii, и органов биопробных животных, суспензия из иксодовых клещей и культур клеток). С этой целью лиофилизированная культура живых C. burnetii растворяется в расчетном объеме стерильного фосфатного буферного раствора pH 7,2 \pm 0,1. Суспензия из желточного мешка готовится из расчета 3 — 5 мл стерильного физиологического раствора на 1 желточный мешок. Из органов морской свинки готовится 10%-я суспензия на физиологическом растворе. Из отмытых в 70%-м спирте и стерильном физиологическом растворе иксодовых клещей готовится 10%-я суспензия на физиологическом растворе.
Заражение морских свинок проводится сотрудниками аэрозольной лаборатории, удовлетворяющей требованиям к изолированной лаборатории 3 уровня, в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <21>.
<21> Пункты 342 - 343 главы IV СанПиН 3.3686-21.
Проверка контаминированности проб гетерологичными бактериями и при необходимости их обработка антибиотиками проводится так же, как при заражении мышей. Морским свинкам внутрибрюшинно вводится 0,5 мл инфицированного материала. Животным ежедневно ректально измеряется температура. Обычно через неделю (срок зависит от дозы C. burnetii) развивается лихорадка (40 — 41 °C), продолжающаяся 4 — 7 дней. В первые дни лихорадки у животного забирается кровь и исследуется с помощью ПЦР. При получении положительного результата этой пробой крови инокулируются РКЭ.
6.10.3 Культивирование C. burnetii на лабораторных мышах.
В качестве лабораторных животных для культивирования C. burnetii обычно используются лабораторные мыши. Различные линии (штаммы) мышей существенно различаются по чувствительности к C. burnetii. Мыши линии A/J более чувствительны к этому патогену, чем C57BL/6J. Из экономии часто работают на белых беспородных мышах (самцах). Их чувствительность к C. burnetii повышается при применении иммунодепрессантов.
При бактериальной контаминации в гомогенизированные пробы добавляются пенициллин (200 ЕД/мл) и стрептомицин (400 ЕД/мл), выдерживаются при комнатной температуре один час и внутрибрюшинно вводятся белым мышам (массой 12 — 14 г) в объеме 0,5 мл. У белых мышей инфекция протекает в скрытой форме, с накоплением C. burnetii в селезенке на 7 — 9 день после заражения. Селезенка стерильно извлекается, готовятся мазки-отпечатки, окрашиваются по методу Гименеса и микроскопируются. Из селезенок мышей, содержащих C. burnetii, стерильно готовятся гомогенезированные пробы для последующего культивирования в РКЭ.
6.10.4 Культивирование C. burnetii в развивающихся куриных эмбрионах.
Исходным материалом (особенно сгустком крови) заражаются и непосредственно РКЭ. В желточный мешок 6 — 7-дневных развивающихся эмбрионов вводится 0,4 — 0,5 мл взвеси исследуемого материала. РКЭ инкубируются в термостате (37 °C) и ежедневно овоскопируются. РКЭ, погибшие до 4-го дня включительно, уничтожаются (гибель от посторонних причин), а погибшие в более поздние сроки или оставшиеся живыми до предельного срока инкубации (11 — 12 дней после заражения) помещаются в холодильник до вскрытия.
Эмбрионы вскрываются стерильно берется желточный мешок, капля содержимого желточного мешка вносится в сахарный бульон для контроля на загрязнение посторонней бактериальной флорой. Из кусочка оболочки желточного мешка делаются параллельные мазки. Один из них обрабатывается специфической флуоресцирующей сывороткой, а парный окрашивается по Здродовскому или по Романовскому-Гимзе для световой микроскопии. Небольшой фрагмент оболочки желточного мешка берется для исследования с помощью ПЦР.
Для выделения и пассирования C. Burnetii кроме РКЭ и морских свинок можно использовать белых мышей массой 12 — 14 г, которые заражаются внутрибрюшинно исследуемым материалом. Изолированные культуры C. burnetii могут быть лиофильно высушены. В сухом виде культуры C. burnetii в холодильнике (4 °C) могут сохраняться в течение десятков лет.
Техника заражения и вскрытия РКЭ. При заражении и вскрытии РКЭ (приложение 7 к настоящим МР) технологические операции выполняются сотрудниками аэрозольной лаборатории, удовлетворяющей требованиям к изолированной лаборатории 3 уровня, в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <22>.
<22> Пункты 342 - 343 главы IV СанПиН 3.3686-21.
6.10.5 Культивирование C. burnetii с применением бесклеточной среды.
В последние годы применяется бактериологический метод с использованием бесклеточной среды. Среда рекомендуется для культивирования C. burnetii из клинического материала и культивирования «чистых» штаммов C. burnetii. Однократную среду готовят согласно инструкции производителя, стерилизуют фильтрацией через мембраны 0,22 мкм.
Исследуемый материал при хронической форме лихорадки Ку, кусочки клапанов сердца, гомогенизируются в 3 мл стерильного фосфатно-солевого буфера. 0,6 мл суспензии ткани добавляются к бесклеточной среде до конечного объема 20 мл и культивируются во флаконе «Для клеточных культур» площадью дна 25 см2 в газовой среде, содержащей 92,5% N2, 5% CO2, 2,5% O2. На 5-е, 7-е и 14-е сутки после инокуляции отбираются аликвоты. Количество C. burnetii определяется микроскопированием с помощью окраски по методу Гименеса. Удовлетворительным накоплением считаются десятки микробных клеток не менее чем в 50% полей зрения. Если количество C. burnetii меньше, суспензией бактерий инокулируются РКЭ. При удовлетворительном количестве C. burnetii проводится их идентификация.
6.10.6 Идентификация и хранение C. burnetii.
Идентификация выделенной культуры C. burnetii проводится в два этапа.
1-й этап: исследование с помощью реагентов (тест-систем) для выявления ДНК C. burnetii методом ПЦР.
2-й этап: для подтверждения амплификации ДНК C. burnetii используется метод ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру гена 16S рРНК. Суммарная ДНК из исследуемого образца выделяется с помощью общедоступных наборов для выделения ДНК; для постановки ПЦР применяются общедоступные мастер-миксы или наборы реагентов. ПЦР проводится с использованием праймеров E8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG и E1541R AAGGAGGTGATCCANCCRCA; конечная концентрация праймеров 0,5 мкМ. Условия амплификации: денатурация 2 минуты при 94 °C; 30 циклов — 1 минута при 94 °C, 1 минута при 55 °C, 1 минута при 72 °C, 10 минут при 72 °C. Ампликоны (продукты ПЦР) очищаются с помощью общедоступных наборов для очистки продуктов ПЦР и анализируются с помощью секвенирования по методу Сэнгера с помощью анализаторов нуклеиновых кислот (секвенаторов) и соответствующих расходных реагентов для каждого типа анализатора с помощью секвенирующих праймеров E341R (TGCIGCCICCCGTAGG) и E1115F (CAACGAGCGCAACCCT). Анализ электрофореграмм и последовательности гена проводится с помощью общедоступного программного обеспечения. Для реконструкции филогенетических деревьев по сравнению штаммов и изолятов рекомендуется применять выравнивание по алгоритму MUSCLE, построение по алгоритму Neighbor-joining с бутстрепом не менее 500.
После идентификации C. burnetii, содержащиеся в удовлетворительном количестве в оболочках желточных мешков, клеточных культурах или выращенные на бесклеточной среде, помещаются в ампулы, лиофильно высушиваются или хранятся при температуре минус 80 °C. Жизнеспособность C. burnetii сохраняется в течение десятков лет.
6.10.7 Внутривидовое типирование C. burnetii.
Методы микробиологического анализа не позволяют выделить специфические особенности фенотипа отдельных штаммов C. burnetii или их групп. Их применение затрудняется чрезвычайно высокой контагиозностью патогена, специфической внутриклеточной нишей, в которой микроорганизм обитает в естественных условиях, и сложной процедурой культивирования. Типирование C. burnetii проводится с помощью методов молекулярной биологии. Идентификация отдельных изолятов C. burnetii и их групп с помощью молекулярно-биологических методов является важнейшим инструментом в изучении эпидемиологических вопросов при возникновении вспышек лихорадки Ку и решении фундаментальных задач при изучении эволюции этого патогена.
6.10.8 Определение геномной группы изолята.
При исследовании геномных характеристик C. burnetii по доступным в базах данных полным геномам выделяется шесть или восемь геномных групп, изоляты которых характеризуются определенными свойствами и обнаруживаются в определенных географических регионах. Штаммы отдельных геномных групп характеризуются разным патогенетическим потенциалом при оценке с использованием модельных животных (морских свинок).
Разделение на геномные группы является трудоемким процессом из-за необходимости использования систем высокопроизводительного секвенирования для получения нуклеотидных последовательностей штамма или геномной гибридизации на микрочипах и ввиду отсутствия общепринятого, стандартизированного протокола обработки данных (пайплайна). Отдельные алгоритмы и программные продукты для анализа геномов позволяют проводить исследования в области молекулярной эпидемиологии C. burnetii.
6.10.9. Типирование C. burnetii с использованием спейсерных участков генома.
Применяется методика генотипирования штаммов и изолятов C. burnetii с помощью анализа нуклеотидной последовательности некодирующих межгенных спейсеров (multi-spacer types) (далее — MST), более вариабельных, чем кодирующие участки генома. Метод основывается на применении ПЦР с праймерами к консервативным участкам спейсеров с последующим секвенированием ампликонов по Сэнгеру. Подход применяется для типирования штаммов и изолятов C. burnetii, выделяется более 60 разных типов MST. Этот метод называется «геотипированием», так как наблюдается приуроченность отдельных типов к определенным географическим регионам. При этом существуют типы, распространенные на нескольких континентах. Панель из спейсеров, обладающая максимальной дискриминирующей способностью, состоит из десяти спейсеров, в некоторых исследованиях типирование проводится с частью спейсеров.
6.10.10 Мультилокусный анализ вариабельных тандемных повторов.
Методика типирования штаммов и изолятов C. burnetii с помощью оценки длин тандемных повторов апробирована на выборке из изолятов различного географического происхождения с использованием 17 локусов мини- и микросателлитов. MLVA позволяет оценить длину локуса сателлита не только с помощью секвенирования по Сэнгеру, но и с помощью фрагментного анализа с флюоресцентно меченным праймером. При одновременном исследовании изолятов методами MLVA и MST при конкордантных результатах MLVA оказывается более дискриминативным методом. В зависимости от технических возможностей выбирается MST или используются оба метода для более полной характеристики изолятов.
6.11. Применение иммунологических (серологических) методов для диагностики лихорадки Ку.
Специфическая диагностика лихорадки Ку осуществляется с помощью серологических методов. В ответ на заражение C. burnetii в организме человека на ранних стадиях инфекции образуются антитела на белковые компоненты микробной клетки — антитела к C. burnetii II фазы. На поздней стадии острой инфекции или при хроническом течении болезни синтезируются антитела к C. burnetii I фазы, вырабатывающиеся к липополисахаридным компонентам клетки возбудителя.
6.11.1 Получение и хранение материала для серологической диагностики.
Для серологического исследования (определение антител) забираются две пробы сыворотки крови: 1-я проба берется в день постановки предварительного диагноза (5 — 6 дни болезни), 2-я проба — через 1 — 2 недели после первой. Взятие крови осуществляется из вены в объеме 3 — 4 мл или из третьей фаланги среднего пальца в объеме 0,5 — 1,0 мл в одноразовую пластиковую пробирку без антикоагулянта. Пробы крови отстаиваются при комнатной температуре в течение 30 минут или помещаются в термостат при 37 °C на 15 минут. После центрифугирования (10 минут при 3000 об./мин) сыворотка переносится в стерильные пробирки. Для каждого образца используется отдельный наконечник с аэрозольным барьером. Срок хранения цельной крови — не более 6 часов при комнатной температуре, при температуре 2 — 8 °C в течение 5 — 10 суток, замораживание недопустимо. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °C не более 1 года. Перед использованием образцы размораживаются при температуре от 16 °C до 25 °C и перемешиваются встряхиванием. Образцы проб сывороток, содержащие агрегаты и осадок, осветляются центрифугированием в течение 10 минут при 6000 об./мин.
Не допускается использование исследуемого материала, прошедшего термообработку, консервированного азидом натрия, с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериальным проростом, что может привести к ложноположительным результатам. Повторное замораживание сыворотки не допускается.
Иммунологические методы диагностики лихорадки Ку включают в себя серологические тесты. Наиболее часто применяется ИФА, из «классических» серологических методов, эффективно применявшихся ранее, — РСК и РА, которая ранее считалась обязательной для лабораторного подтверждения диагноза лихорадки Ку. Были разработаны дополнительные иммунологические пробы: реакция микроагглютинации с диагностикумом из C. burnetii, меченных изотиоционатом флуоресцеина, реакция непрямой иммунофлуоресценции по методу Кунса и реакция кольцепреципитации с растворимым антигеном из C. burnetii I-й фазы.
Иммунологические реакции применяются для лабораторного подтверждения диагноза лихорадки Ку у больных людей и выявления переболевших, обнаружения инфекции у сельскохозяйственных и домашних животных, среди диких грызунов, для оценки эффективности вакцинации и других эпидемиологических вопросов. Серологические реакции — необходимый этап комплекса исследований по изоляции и идентификации возбудителя.
Серологическая диагностика лихорадки Ку у людей осуществляется с использованием диагностических препаратов, зарегистрированных на территории Российской Федерации <23>. Тест-системы предназначаются для серологической текущей и ретроспективной in vitro диагностики лихорадки Ку по наличию антител IgG-класса в сыворотке крови человека с помощью качественного иммуноферментного анализа. Наборы реагентов применяются для осуществления мероприятий по контролю и профилактике внебольничных пневмоний для исключения лихорадки Ку <24>.
<23> Пункт 1418 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
<24> МУ 3.1.2.3047-13 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями».
Целевым аналитом, выявляемым набором реагентов, являются сывороточные антитела класса IgG к антигенам C. burnetii, присутствие которых в сыворотке свидетельствует об инфицированности исследуемого человека возбудителем лихорадки Ку и при наличии клинико-эпидемиологических данных позволяет диагностировать лихорадку Ку. IgG-антитела к C. burnetii сохраняются в течение длительного времени после перенесения заболевания, поэтому их обнаружение при стертой клинической картине является основанием для повторного исследования через 10 — 12 дней. Четырехкратное увеличение титра антител к C. burnetii в «парных сыворотках» указывает на текущую инфекцию, а отсутствие изменения титра антител свидетельствует о перенесенном заболевании в прошлом.
Анализируемые образцы. Исследуемые образцы сыворотки крови хранятся при температуре от 2 °C до 8 °C не более 3 суток от момента взятия крови. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °C не более 1 года. Перед использованием образцы размораживаются при температуре от 16 °C до 25 °C и перемешиваются встряхиванием. Образцы проб сывороток, содержащие агрегаты и осадок, осветляются центрифугированием 10 минут при 6000 об./мин.
Анализируемая сыворотка перед использованием разбавляется в 400 раз, что гарантирует нивелирование действия возможных интерферентов, присутствующих в следовых количествах.
Постановка реакции осуществляется в соответствии с инструкцией производителя.
Титром антител считается наибольшее разведение сыворотки, при котором результаты ИФА оцениваются как положительные. Нарастание титров в 4 и более раз подтверждает наличие текущей коксиеллезной инфекции. В случае отсутствия возможности исследования парных сывороток, обнаружение антител к C. burnetii при значительных разведениях сыворотки (1:3200 и выше) может свидетельствовать о недавно перенесенной лихорадке Ку.
Для выявления антител только к C. burnetii II фазы планшеты сенсибилизируются антигеном штамма коксиелл, который находится в этом фазовом состоянии. Использование гидролизного антигена штамма C. burnetii I фазы, позволяет значительно повысить чувствительность ИФА за счет пространственной демаскировки антигена C. burnetii II фазы при сохранении или даже активации антигена I фазы.
Для лабораторной диагностики случаев острого коксиеллеза исследование сывороток крови больного проводится в первые дни лихорадочного периода болезни. С помощью «ИФА — анти Ку IgG» антитела к C. burnetii выявляются на 5 — 7 день лихорадки. IgM-антитела к C. burnetii выявляются несколько раньше. Для лабораторного подтверждения лихорадки Ку необходимо повторное одновременное исследование «парных сывороток».
Для постановки окончательного диагноза лихорадки Ку применяется комплекс серологических, клинических и эпидемиологических данных.
VII. Профилактика лихорадки Ку
7.1. Санитарно-эпидемиологические (профилактические) мероприятия в отношении лихорадки Ку определены в санитарно-эпидемиологических требованиях <25>, включая специфическую профилактику <26>.
<25> Пункты 1449 - 1457 главы IV СанПиН 3.3686-21.
<26> Пункты 1458 - 1478 главы IV СанПиН 3.3686-21.
ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЕНОМОВ ШТАММОВ COXIELLA BURNETII
| Coxiella burnetii штаммы | Источник | Номер доступа в базе данных GenBank <27> | Размер хромосомы (п.н.) | G + C% | Количество генов | Плазмида | |
| Тип | Размер (п.н.) | ||||||
| NL3262 | Коза | NZ_CP013667.1 | 2093477 | 42,84 | 2401 | QpH1 | 37320 |
| CbRSA331 | Человек | NC_010117.1 | 2016427 | 42,74 | 2272 | QpH1 | 37317 |
| CbuG_Q212 | Человек | NC_011527.1 | 2008870 | 42,60 | 2208 | интегрированная | |
| Nine Mile (NMRSA493) (phase I) | Клещ Dermacentor andersonii | NC_002971.4 | 1995281 | 42,64 | 2085 | QpH1 | 37319 |
| Z3055 | Овца | NZ_LK937696.1 | 1995463 | 42,60 | 2197 | QpH1 | |
| NMRSA 439 (phase II) | Культура клеток | NZ_CP020616.1 | 1969224 | 42,64 | 2217 | pQpH1 | 37319 |
| NMRSA439 (phase II, clone 4) | Человек | NZ_CP018005.1 | 1969245 | 42,64 | 2219 | pQpH1 | 37,319 |
| MSU Goat Q177 | Коза | NZ_CP018150.1 | 2090565 | 42,64 | 2305 | QpRS | 39281 |
| CbuK_Q154 | Человек | NC_011528.1 | 2063100 | 42,64 | 2302 | QpRS | 39280 |
| Dugway 5J108-111 | Грызуны Dipodomys ordii | NC_009727.1 | 2158758 | 42,34 | 2358 | QpDG | 54179 |
| 2014-PE-15890 | Коза | NZ_CP032542.1 | 2093382 | 42,90 | 2352 | - | - |
| Nine Mile mutant (phase II) | (Китай) | NZ_CP035112.1 | 1987028 | 42,64 | 2255 | без названия | 37321 |
| RSA439 | Клещ D. andersonii | NZ_CP040059.1 | 1969211 | 42,64 | 2220 | pQpH1 | 37318 |
<27> GenBank — база данных, содержащая аннотированные последовательности ДНК, РНК и белков: www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank (в свободном доступе).
ПУТИ, ФАКТОРЫ ПЕРЕДАЧИ COXIELLA BURNETII И МАТЕРИАЛ, ПОДЛЕЖАЩИЙ ИССЛЕДОВАНИЮ В ОЧАГАХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ ЛИХОРАДКИ КУ
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ РИСКА ЗАРАЖЕНИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕМ ЛИХОРАДКИ КУ
СХЕМА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИХОРАДКИ КУ И ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ
ПРИМЕРЫ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ (ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛИХОРАДКИ КУ <28>
<28> Зарегистрированные в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий».
ЗАРАЖЕНИЕ МОРСКИХ СВИНОК ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ШТАММОВ C. BURNETII
1. Заражение морских свинок выполняется сотрудниками аэрозольной лаборатории в помещении, соответствующем санитарно-эпидемиологическим требованиям <29>. Для заражения животных используется стерильный шприц 10 мл с иглой большого калибра длиной 4 см. Материал для заражения набирается в шприц, после чего конец иглы вводится в стерильный ватик. От попавшего с набираемым в шприц материалом воздуха освобождаются, повернув шприц вертикально вверх иглой, которая предварительно вводится в толщу стерильного ватного тампона, упакованного в сложенный по типу конверта небольшой лист пергаментной бумаги. Игла вкалывается в толщу ватика через складки бумаги, где ее не касались руками. Ватики предотвращают разбрызгивание инфекционного материала из шприца, т.е. распространение ПБА в окружающей среде. Игла, находящаяся в ватике, до момента инъекции остается стерильной. Повернув шприц иглой вверх, из него осторожно выпускаются пузырьки воздуха. Использованный ватик помещается в емкость с дезинфицирующим раствором.
<29> Пункт 1420 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
2. Заражение морских свинок осуществляется введением суспензии, содержащей C. burnetii, шприцем в брюшную полость. Одним из сотрудников фиксируется животное: правой рукой удерживаются задние лапы, левой — передние лапы и голова. Животное удерживается в вертикальном положении головой вниз. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. Другим сотрудником обрабатывается место прокола 70%-ным этиловым спиртом, большим и указательными пальцами левой руки захватывается и оттягивается складка кожи вместе с брюшиной в нижней трети живота. В оттянутую складку кожи вводится игла и осторожно продвигается вглубь. Чувство «провала», исчезновение ощущения сопротивления указывают на проникновение иглы в брюшную полость. После этого вводится содержащийся в шприце заражающий материал в объеме 3 — 5 мл, создавая натяжение кожи и мышц брюшной стенки со стороны инъекции. Проникновение иглы ощущается по исчезнувшему сопротивлению брюшной стенки.
3. Термометрия и наблюдение за зараженными морскими свинками. Температура тела животным измеряется в прямой кишке электронным термометром. Перед использованием термометр протирается ватой, смоченной в 70%-м спирте, вытирается насухо и смачивается вазелиновым маслом. Глубина введения термометра должна быть всегда постоянной, так как от этого зависит температура. Измерение температуры в каждой группе животных в течение всего периода наблюдений производится одним термометром в одно и то же время. Одновременно с термометрией проводится наблюдение за скротальной реакцией, которая является внешним проявлением специфического периорхита и иногда орхита. Обращается внимание на наличие гиперемии, отека мошонки и увеличения яичек, которые перестают вправляться в брюшную полость.
4. Подготовка морской свинки к вскрытию. Вскрытие морских свинок проводится сотрудниками в микробиологическом боксе на лабораторном столе из нержавеющей стали или в боксе микробиологической безопасности. Подлежащая вскрытию свинка усыпляется эфиром для наркоза. Усыпленное животное погружается в дезинфицирующий раствор, шерсть обсушивается полотенцем и свинка фиксируется животом вверх на специальной доске для вскрытия с приспособлением для фиксации конечностей. Шерсть в области брюшка, мошонки, паха и затылка тщательно удаляется (выщипывается или бреется).
5. Передняя поверхность тела свинки перед вскрытием для удаления остатка волос смачивается 96%-м спиртом и поджигается (завершающее фламбирование). После этого начинается собственно вскрытие по схеме:
-
разрезы, отделение покровов, вскрытие полостей и внутренний осмотр положения органов и состояния полостей;
6. Разрез кожи производится по белой линии от лонной кости (симфиза) до шеи. Чтобы не прорезать брюшину, пинцетом, находящемся в левой руке, приподнимается кожа и делается сначала поперечный надрез складки кожи, удерживаемой пинцетом у симфиза. Одна бранша ножниц вставляется в образовавшееся отверстие, разрезается кожа до шеи животного, после чего кожа разрезается по направлению к каждой из четырех конечностей. Концом закрытых ножниц кожа препарируется, открывая ее лоскуты вправо и влево. Лоскуты кожи фиксируются корнцангами за верхние и нижние углы. Наружный листок брюшины обрабатывается ватным тампоном, смоченным 70%-м спиртом.
7. Яички оказываются в основании кожного треугольника. Для взятия яичек пинцетом Кохера захватывается за вершину треугольный лоскут кожи и оттягивается вниз. Обнажаются яички, покрытые влагалищными оболочками. Если обнажение не удается сразу, яички высвобождаются из рыхлой клетчатки концом закрытых ножниц при оттягивании кожного лоскута пинцетом Кохера. Освобожденные яички захватываются хирургическим пинцетом, отрезаются ножницами от жирового придатка и переносятся в 2 пробирки: в стерильную — для пассирования на биологических моделях, в пробирку с 70%-м спиртом — для исследования в ПЦР. Небольшим кусочком ткани органа делаются мазки-отпечатки для микроскопии.
8. После замены инструментов вскрывается брюшная полость. Производится разрез брюшной стенки под линией диафрагмы и по белой линии до лонной кости. Треугольники брюшной стенки отводятся в стороны и фиксируются корнцангами. В качестве материала, содержащего C. burnetii, наибольший интерес представляют легкие, печень и другие органы. У морских свинок селезенка имеет плоскую форму, размещается дорсолатеральнее желудка, с которым связана короткой брыжейкой. Ее длина составляет 2,5 — 3 см, ширина — 0,8 — 1 см.
9. Грудная полость вскрывается, после поднятия мечевидного отростка пинцетом, ребра перерезаются ножницами в области хрящей. Осматривается грудная полость и при наличии в органах изменений описывается их картина. При наличии патологоанатомических изменений в легких, фрагменты органа берутся для дальнейшего пассирования, делаются мазки-отпечатки.
10. Вскрытие черепа выполняют, укрепив животное в брюшном положении путем фиксации передних конечностей и головы. Кожа головы и шеи обрабатывается 96%-м спиртом и поджигается (завершающее фламбирование). Разрез кожи производится перпендикулярно оси тела за ушами, продолжается слева и справа вперед к глазницам. Кожа вместе с ушами отпрепаровывается и отбрасывается вперед, оголяя черепную коробку. Одна бранша ножниц вставляется в большое черепное отверстие и кости черепа разрезаются влево и вправо по направлению к глазницам. Открывается надрезанная часть черепной коробки. Мозг животных, имеющий мажущуюся мягкую консистенцию, извлекается из основания черепа, поднимается слегка раздвинутыми браншами ножниц, подрезаются черепно-мозговые нервы.
11. Все извлеченные органы делятся на части: основная (большая по размеру) помещается в стерильные пробирки для дальнейших пассажей, небольшие фрагменты органов помещаются в пробирки с 70%-м спиртом, производятся мазки-отпечатки для световой и люминесцентной микроскопии.
12. Контроль степени накопления C. burnetii. Степень накопления C. burnetii проверяется с помощью микроскопии мазков, окрашенных методом флуоресцирующих антител и по методу Здродовского. Приготовленные на стерильных предметных стеклах мазки-отпечатки из кусочков тканей органов высушиваются на воздухе и фиксируются в ацетоне в течение 20 минут. Окрашиваются по методу Здродовского. Оценка степени накопления C. burnetii проводится визуально, накопление C. burnetii оценивается по общепринятой четырехкрестовой шкале. Для люминесцентной микроскопии применяется реакция непрямой иммунофлуоресценции. Для контроля накопления C. burnetii в тканях органов осуществляется детекция ДНК возбудителя в ПЦР.
Заключительные работы. После завершения работы флаконы с органами животных помещаются в холодильник, проводится текущая дезинфекция боксового блока. Остатки инфицированного материала выдерживаются в емкости с дезраствором 24 часа с последующим автоклавированием. Рабочая одежда подвергается автоклавированию.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ C. BURNETII В РАЗВИВАЮЩИХСЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ
1. Работа по отбору, инкубированию и культивированию РКЭ выполняется сотрудниками аэрозольной лаборатории в помещении, соответствующем санитарно-эпидемиологическим требованиям <30>.
<30> Пункт 1420 главы XVII СанПиН 3.3686-21.
2. Подготовительные работы. Для работы используется свежее оплодотворенное куриное яйцо массой 40 \pm 5 г с белой чистой скорлупой. РКЭ при поступлении в лабораторию овоскопируются, отбраковываются нежизнеспособные или имеющие дефекты (трещины) скорлупы эмбрионы.
3. РКЭ, отобранные сотрудниками лаборатории, укладываются на подставки с горизонтальными гнездами величиной 3,5 — 4,0 см тупым концом вверх и помещаются в термостат. Инкубирование проводится в течение 5 — 6 суток при относительной влажности воздуха 60 — 65% и температуре 37 °C. Для заражения используются 6 — 7-суточные РКЭ.
4. В течение всего периода инкубации РКЭ ежедневно овоскопируются и поворачиваются вокруг продольной оси. Термостат проветривается ежедневно в течение 30 — 40 минут.
5. На 2 — 4-е сутки РКЭ овоскопируются для отбраковки погибших и неполноценных эмбрионов. Затем овоскопия проводится 2 раза в сутки.
6. Боксовый блок подготавливается к работе. Готовятся стерильные растворы и питательные среды (мясопептонный агар, мартеновский бульон, тиогликолевая среда). Готовятся дезинфицирующие растворы.
7. Основные работы по заражению РКЭ.
Приготовление взвеси овокультуры живых C. burnetii.
РКЭ заражаются путем введения в желточный мешок инфекционного материала (лиофилизированная культура живых C. burnetii, суспензии из желточных мешков РКЭ, зараженных C. burnetii, и органов биопробных животных). Лиофилизированная культура живых C. burnetii растворяется в расчетном объеме стерильного фосфатного буферного раствора pH 7,2 \pm 0,1. Суспензия из желточного мешка готовится из расчета 3 — 5 мл стерильного физиологического раствора на 1 мешок. Из органов морской свинки готовится 10%-я суспензия на физиологическом растворе. Для проведения пассажей заражающая доза подбирается с таким расчетом, чтобы вызвать максимальную гибель эмбрионов на 8 — 9-е сутки после заражения.
Заражение куриных эмбрионов проводится сотрудниками аэрозольной лаборатории. Скорлупа 5 — 6-дневных РКЭ обрабатывается 70%-м этиловым спиртом, место прокола 5%-м спиртовым раствором йода на площади не более чем 0,5 х 0,5 см, который удаляется спиртовым тампоном. Смоченная 96%-м спиртом поверхность яйца обжигается. Скорлупа над воздушной камерой прокалывается стерильным троакаром (смоченный 96%-м спиртом троакар прожигается в пламени спиртовки). Заражение РКЭ проводится с помощью стерильного шприца с иглой среднего калибра длиной 3 — 4 см. Заражение РКЭ по Коксу производится введением суспензии C. burnetii шприцем в полость желточного мешка через воздушную камеру. Яйцо берется левой рукой так, чтобы его тупой конец с отмеченной воздушной камерой был направлен вперед при расположении отметки эмбриона внизу. Через отверстие в скорлупе на глубину 2,5 — 3 см вводится игла шприца и инъецируется жидкость, содержащая C. burnetii в объеме 0,5 мл. Игла вынимается, отверстие в скорлупе герметизируется расплавленным стерильным парафином. После заражения и герметизации на скорлупе делаются карандашом надписи с указанием номера РКЭ, заражающего материала (название штамма, суспензия органов биопробного животного и др.) и даты. По окончании каждого серийного заражения делаются контрольные высевы на стерильность в сахарный бульон.
8. Инкубирование и овоскопия развивающихся куриных эмбрионов. Зараженные РКЭ инкубируются в термостате в условиях, как описано выше, и ежедневно овоскопируются для определения жизнеспособности куриных эмбрионов. Оптимальной для эмбрионов, зараженных C. burnetii, является температура 37 °C.
Эмбрионы, погибшие ранее 3-х суток (травматическая гибель), отбраковываются, помещаются в емкость с дезинфицирующим раствором и обезвреживаются автоклавированием при температуре (132 \pm 2) °C в течение 1 часа. При дальнейшей ежедневной овоскопии отбираются для вскрытия погибшие эмбрионы (отсутствие подвижности, сглаженный сосудистый узор) или явно больные (ограниченная подвижность, менее ясный сосудистый узор). Погибшие эмбрионы выдерживаются в течение 24 — 48 часов при температуре культивирования или в условиях постепенного снижения температуры в отключенном термостате.
9. Основные работы при вскрытии РКЭ. Вскрытие развивающихся куриных эмбрионов выполняется сотрудниками аэрозольной лаборатории в помещении, соответствующем санитарно-эпидемиологическим требованиям. Куриные эмбрионы на подложке переносятся из термостата в бокс, предварительно обработанные в предбоксе ватным тампоном, смоченным 70%-м спиртом. Тупой конец яйца, подлежащий вскрытию, обрабатывается спиртом и йодом, как указано выше (заключительное фламбирование). Скорлупа яиц прокалывается профламбированным пинцетом немного выше границы воздушной камеры и циркулярно надламывается на том же уровне. Отделенный фрагмент скорлупы помещается в емкость с дезинфицирующим раствором для эмбрионов. Пинцет помещается в емкость с дезинфицирующим раствором для инструментов.
10. Для дальнейшей работы используются два стерильных профламбированных пинцета. Хорион-аллантоисная оболочка отслаивается пинцетом и удаляется. Эмбрион извлекается пинцетами, отделяется за пупочный канатик. Желточный мешок захватывают пинцетом и избавляются от его содержимого. Оболочка желточного мешка помещается во флакон со стеклянными бусами, предварительно отделяются небольшие кусочки желточной оболочки для приготовления мазка-отпечатка. Флакон закрывается ватно-марлевыми пробками. Для приготовления мазков стерильным пинцетом захватывают небольшой кусочек желточного мешка с хорошо выраженным сосудом, максимально избавляются от примеси желтка, используя стерильную фильтровальную бумагу. Тканевым кусочком наносятся тонкие мазки на поверхность хорошо обезжиренных предметных стекол. На шлифованный край стекла простым карандашом наносится маркировка.
11. Флаконы с желточными оболочками маркируются с указанием штамма C. burnetii, № зараженного эмбриона и даты вскрытия. Флаконы с инфицированными желточными оболочками помещаются в низкотемпературный холодильник и хранятся при температуре минус (70 \pm 5) °C до получения результатов контрольных исследований (контроля стерильности желточных оболочек и контроля степени накопления C. burnetii).
12. Контроль стерильности желточных оболочек. Контроль проводится путем посева кусочка ткани желточной оболочки на сахарный мартеновский бульон. Посевы выдерживаются в термостате при температуре (37 \pm 1) °C в течение 2 суток. Отсутствие роста посторонней микрофлоры свидетельствует о стерильности посевного материала. Нестерильные желточные оболочки подвергаются автоклавированию при условиях, указанных выше.
13. Контроль степени накопления C. burnetii. Степень накопления C. burnetii проверяется микроскопией мазков, окрашенных методом флуоресцирующих антител, и по методу Здродовского. Приготовленные на стерильных предметных стеклах мазки-отпечатки из кусочка ткани желточного мешка высушиваются на воздухе и фиксируются в ацетоне в течение 20 минут. Окрашиваются по методу Здродовского. Оценка степени накопления C. burnetii проводится визуально, накопление C. burnetii оценивается по общепринятой четырехкрестовой шкале. Для контроля накопления C. burnetii в желточных мешках осуществляется детекция ДНК возбудителя с помощью ПЦР.
Заключительные работы. После завершения работы флаконы с инфицированным материалом помещаются в холодильник, посевы с желточной оболочки переносятся в термостат, проводится текущая дезинфекция боксового блока. Остатки инфицированных куриных эмбрионов выдерживаются в емкости с дезраствором 24 часа с последующим автоклавированием. Рабочая одежда подвергается автоклавированию.
НОРМАТИВНЫЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Федеральный закон от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации».
3. Федеральный закон от 10.01.2002 № 7-ФЗ «Об охране окружающей среды».
4. Постановление Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 № 54 «Об утверждении Положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании».
5. Постановление Правительства Российской Федерации от 16.04.2012 № 317 «О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III и IV степеней потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах».
6. Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий».
7. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
8. СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».
9. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 04.02.2016 № 11 «О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях санитарно-эпидемиологического характера».
10. Приказ Роспотребнадзора от 14.01.2013 № 6 «Об утверждении инструкции по оформлению обзора и прогноза численности мелких млекопитающих и членистоногих».
11. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации».
12. МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории».
13. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».
14. МУ 4.2.2942-11 «Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях».
15. МУ 3.4.3008-12 «Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных, „новых“ и „возвращающихся“ инфекционных болезней».
16. МУ 3.1.3012-12 «Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих в природных очагах опасных инфекционных болезней».
17. МУ 4.2.3115-13 «Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний».
18. МР 3.1.7.0250-21 «Тактика и объемы зоологических работ в природных очагах инфекционных болезней».
19. Международная статистическая классификация болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10, Всемирная организация здравоохранения, г. Женева, 1995, том 1 (часть 1).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1972. 496 с.
2. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. М., 2013. С. 191 — 215.
3. Панферова Ю.А., Фрейлихман О.А., Токаревич Н.К., Карпенко С.Ф., Галимзянов Х.М. Сравнение диагностической эффективности методов детекции Coxiella burnetii в крови больных лихорадкой Ку на основе амплификации фрагментов гена 16S рРНК (стандартная ПНР) и гена groEL (ПЦР в режиме реального времени) // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016. № 3. С. 70 — 74.
4. Рудаков Н.В., Фетисова Н.Ф., Сыскова Т.Г. Коксиеллез в Российской Федерации // Здоровье населения и среда обитания. 1994. № 2. С. 10 — 12.
5. Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко. М.: ЗАО «МП Гигиена». 2006. 288 с.
6. Токаревич Н.К., Фрейлихман О.А. Коксиеллезы // кн. Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. Долгов В.В., Меньшиков В.В. 2012. Том 2. С. 335 — 341.
7. Транквилевский Д.В., Царенко В.А., Жуков В.И. Современное состояние эпизоотологического мониторинга за природными очагами инфекций в Российской Федерации // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2016. № 2. С. 19 — 24.
8. Фрейлихман О.А., Токаревич Н.К., Кондрашова В.Д. Лабораторные методы диагностики Ку-лихорадки и генотипирование Coxiella burnetii. // Инфекционные болезни. 2017. № 2. С. 49 — 60.
9. Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Фаизов Т.Х., Фахрутдинов Н.А., Камалдинов И.Н., Усольцев К.В. Генетические маркеры возбудителей особо опасных заболеваний, характеризующихся природной очаговостью // Ветеринарный врач. 2020. № 1. С. 67 — 73.
10. Baker G.C., Smith J.J., Cowan D.A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers // J Microbiol Methods. 2003. Vol. 55. P. 541 — 555. doi: 10.1016/j.mimet.2003.08.009.
11. Boden K., Wolf K., Hermann B., Frangoulidis D. First isolation of Coxiella burnetii from clinical material by cell-free medium (ACCM2) // European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 2015. Vol. 34. P. 1017 — 1022. doi: 10.1007/s10096-015-2321-1.
12. Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.R., Garrity G.M. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Ed, Vol 2, Proteobacteria, Part В (The Gammaproteobacteria). Springer, New York. 2005; 1 — 1136.
13. Eldin C., Angelakis E., Renvoise A., Raoult D. Coxiella burnetii DNA, but not viable bacteria, in dairy products in France // Am J Trop Med Hyg. 2013. Vol. 88. P. 765 — 769. doi: 10.4269/ajtmh.12-0212.
14. Eldin C., Mélenotte C., Mediannikov O., Ghigo E., Million M., Edouard S., Mege JL., Maurin M., Raoult D. From Q Fever to Coxiella burnetii Infection: a Paradigm Change. // Clin Microbiol Rev. 2017. Vol. 30. P. 115 — 190. doi: 10.1128/CMR.00045-16.
15. Freylikhman O., Kiselev A., Kazakov S., Sergushichev A., Panferova Y., Tokarevich N., Kostareva A. Draft Genome Sequence of Coxiella burnetii Historical Strain Leningrad-2, Isolated from Blood of a Patient with Acute Q Fever in Saint Petersburg, Russia // Genome Announc. 2018. Vol. 18; 6(3). doi: 10.1128/genomeA.01464-17.
16. Glazunova O., Roux V., Freylikman O., Sekeyova Z., Fournous G., Tyczka J., Tokarevich N., Kovacava E., Marrie T.J., Raoult D. Coxiella burnetii genotyping // Emerg Infect Dis. 2005 Vol. 11. P. 1211 — 1217.
17. Gottlieb, Y., Lalzar, I., and Klasson, L. «Distinctive genome reduction rates revealed by genomic analyses of two Coxiella-like endosymbionts in ticks.» Genome Biol. Evol. (2015) 7: 1779 — 1796.
18. Kuley R., Kuijt E., Smits M.A., et al. Genome Plasticity and Polymorphisms in Critical Genes Correlate with Increased Virulence of Dutch Outbreak-Related Coxiella burnetii Strains // Front Microbiol. 2017. № 8. P. 1526.
19. McLaughlin H.P., Cherney B., Hakovirta J.R., Priestley R.A., Conley A., Carter A., Hodge D., Pillai S.P., Weigel L.M., Kersh G.J., Sue D. Phylogenetic inference of Coxiella burnetii by 16S rRNA gene sequencing // PLoS One. 2017. Vol. 12. e0189910. doi: 10.1371/journal.pone.0189910.
20. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. 2012. Vol. 28. P. 1166 — 1167. doi: 10.1093/bioinformatics/bts091.
21. Santos A.S., Tilburg J.J., Botelho A., Barahona M.J., Núncio M.S., Nabuurs-Franssen M.H., Klaassen C.H. Genotypic diversity of clinical Coxiella burnetii isolates from Portugal based on MST and MLVA typing // Int J Med Microbiol. 2012. Vol. 302. P. 253 — 256. doi: 10.1016/j.ijmm.2012.08.003.
22. Shpynov S.N., Tarasevich I.V., Skiba A.A., Pozdnichenko N.N., Gumenuk A.S. Comparison of genomes of Coxiella burnetii strains using formal order analysis // New Microbes New Infect. 2018. Vol. 23. P. 86 — 92. doi: 10.1016/j.nmni.2018.02.011
23. Svraka S., Toman R., Skultety L., Slaba K., Homan W. Establishment of a genotyping scheme for Coxiella burnetii // FEMS Microbiol. Lett. 2006. Vol. 254. P. 268 — 274.
24. Tan, C.K., and Owens, L. Infectivity, transmission and 16S rRNA sequencing of a rickettsia, Coxiella cheraxi sp. nov., from the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus. Dis. Aquat. Organ. (2000) 41:115 — 122.
25. Tokarevich N.K., Freilykhman O.A., Titova N.M., Zheltakova I.R., Ribakova N.A., Vorobeychikov E.V. Anthropogenic effects on changing Q fever epidemiology in Russia. // Annals of the New York Academy of Sciences. 2006. Vol. 1078. P. 120 — 123. doi: 10.1016/j.ttbdis.2018.11.020.
26. Tokarevich N.K., Panferova Y.A., Freylikhman O.A., Blinova O.V., Medvedev S.G., Mironov S.V., Grigoryeva L.A., Tretyakov K.A., Dimova T., Zaharieva M.M., Nikolov B., Zehtindjiev P., Najdenski H. Coxiella burnetii in ticks and wild birds // Ticks Tick Borne Dis. 2019. Vol. 10. P. 377 — 385.
27. Vincent G.A., Graves S.R., Robson J.M., Nguyen C., Hussain-Yusuf H., Islam A., Fenwick S.G., Stenos J. Isolation of Coxiella burnetii from serum of patients with acute Q fever // J Microbiol Methods. 2015. Vol. 119. P. 74 — 78. doi: 10.1016/j.mimet.2015.10.008.
Методические рекомендации разработаны Разработаны ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора (Н.В. Рудаков, С.Н. Шпынов, И.Е. Самойленко, С.Ю. Зеликман), ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора (Н.К. Токаревич, Ю.А. Панферова), ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (А.Л. Гинцбург, А.В. Костарной, А.Н. Пантюхина), ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (А.Н. Куличенко, Ю.М. Тохов), ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (С.В. Башхонов, Е.И. Андаев), ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (Д.В. Транквилевский), Управчение Роспотребнадзора по Ставропольскому краю (И.В. Ковальчук, А.В. Сазонов), Управчение Роспотребнадзора по Омской области (А.С. Крига, Т.А. Шахова), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае» Роспотребнадзора (О.А. Меркушев), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области» Роспотребнадзора (Д.А. Квасов, О.В. Клепиков, Ю.С. Калашников, Е.П. Гайдукова), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области» Роспотребнадзора (Ю.А. Юрченко, Л.Ю. Чернышова, Е.В. Семенова), ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ставропольском крае» Роспотребнадзора (Н.И. Соломащенко, К.А. Пурмак, М.Ю. Маркова).