МР 1.2.0307-22. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Методические рекомендации по оценке цитотоксичности наночастиц методом электронной микроскопии. Методические рекомендации

(утв. Роспотребнадзором 26.12.2022)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 26 декабря 2022 года

1.2 ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОЦЕНКЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ НАНОЧАСТИЦ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 1.2.0307-22

1. Разработаны ФБУН «Екатеринбургский медицинский-научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Роспотребнадзора (д.м.н. М.П. Сутункова, И.Г. Шеломенцев, Л.А. Амромин, д.б.н. И.А. Минигалиева).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 декабря 2022 г.

3. Введены впервые.

I. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее — МР) определяют порядок выполнения работ по оценке цитотоксичности наночастиц (далее — НЧ) методом электронной микроскопии (далее — ЭМ), посредством анализа топологии внутренней мембраны митохондрий.

1.2. МР используются при оценке безопасности НЧ, а также в целях принятия решений по оценке рисков, ассоциированных с присутствием различных НЧ в воздухе рабочей зоны и окружающей атмосфере, вызванных непосредственным контактом НЧ с рабочими промпредприятий и местным населением.

1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими, научно-исследовательскими и иными организациями, занимающимися вопросами оценки безопасности наноматериалов.

II. Общие положения

2.1. Оценка токсикологических рисков, ассоциированных с НЧ, приобретает актуальность соразмерно использованию НЧ в промышленности и распространению загрязнения ими среды обитания человека.

2.2. НЧ, даже малых концентраций, в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе населенных мест оказывают влияние на цитологические процессы до того, как урон здоровью может быть обнаружен клинически.

2.3. ЭМ позволяет получить информацию о субклеточных структурах организмов. Такие данные расширяют картину токсикологического воздействия, кроме того, являются самостоятельным инструментом анализа оценки токсичности.

2.4. Мероприятия по проведению цитотоксикологических исследований посредством ЭМ: отбор проб, их упаковка, маркировка и транспортирование в лабораторию, проводящую исследования, подготовку для исследования рекомендуется осуществлять в соответствии с методическими документами <1>.

<1> МУ 1.2.2741-10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных» (далее — МУ 1.2.2741-10); МУ 1.2.2745-10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных» (далее — МУ 1.2.2745-10); МР 1.2.2641-10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах» (далее — МР 1.2.2641-10).

2.5. Основное утверждение, на котором основана излагаемая методика, может быть сформулировано таким образом: соотношение морфотипов митохондрий в клетках тканей организма является маркером цитотоксического воздействия на клетки данных тканей.

2.6. Митохондриальный анализ предоставляет объективные и детальные данные о состоянии клеток и индукции в них апоптотических процессов. Данный анализ является универсальным для большинства типов клеток и тканей организма.

III. Принцип метода

3.1. МР внедряются в качестве новой методики анализа данных в исследованиях по оценке цитотоксичности НЧ, которая осуществляется посредством ЭМ. Строение внутренней мембраны митохондрии коррелируется с физиологическим состоянием митохондрий и потерей потенциала митохондриальной мембраны (\Delta\Psi m) во время процесса клеточной гибели. Принципом метода является ранжирование митохондрий по типам конфигурации внутренней мембраны (морфотипы митохондрий) с последующим сравнением процентного распределения морфотипов между опытной и контрольной группой (приложение 1 к настоящим МР).

Предложенным в данных МР анализом митохондрий оценивается индукция апоптотических процессов для широкого практического применения в качестве универсального метода оценки цитотоксического воздействия НЧ.

IV. Методика отбора и подготовки проб

4.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют приборы, оборудование, реактивы и расходные материалы, приведенные в табл. 1 - 4.

Таблица 1

Приборы

Таблица 2

Вспомогательное оборудование и инвентарь

Таблица 3

Реактивы

Таблица 4

Расходные материалы

4.1.1. Характеристики приборов, оборудования, реактивов и расходных материалов.

Примеры приборов, оборудования, инвентаря, реактивов и расходных материалов указаны в методических документах <2>. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

<2> МУ 1.2.2741-10; МУ 1.2.2745-10; МР 1.2.2641-10.

4.2 Приготовление химических реактивов.

4.2.1. Приготовление химических растворов проводится в соответствии с методическими документами <3>.

<3> Пункт 5.1.3.3 МР 1.2.2641-10.

4.2.2. Использование натрий-фосфатного буфера (PBS) в сочетании с уранилацетатом может приводить к образованию артефактов на изображениях в структуре образцов. Ввиду чего для приготовления растворов рекомендуется использовать в качестве буфера — тригидрат какодилата натрия.

4.2.3. На этапах фиксации и дофиксации должен использоваться буфер одного типа — PBS или BSA.

4.2.4 Приготовление маточных растворов.

4.2.4.1 Приготовление 10 Н раствора NaOH.

Для приготовления 100 см3 10 Н раствора NaOH в стеклянный стакан, содержащий 50 см3 дистиллированной воды, внести 40 г NaOH. NaOH растворить при перемешивании на водяной/ледяной ванне. После его полного растворения объем раствора довести до 100 см3 дистиллированной водой.

4.2.4.2 Приготовление 1 М раствора HCl.

Для приготовления 1 М раствора HCl в мерную колбу объемом 100 см3 внести 8 см3 концентрированной HCl и довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой.

4.2.4.3. Приготовление 0,2 М раствора фосфорно-солевого буфера (PBS), pH 7,2 — 7,4.

Для приготовления 0,2 М раствора PBS в мерную колбу объемом 1000 см3 содержащую 500 см3 дистиллированной воды внести навески 6,2 г KH2PO4·H2O, 33,65 г K2HPO4·3H2O и 17,4 г KCl и перемешивают. После полного растворения довести объем раствора до 1000 см3. Измеряется pH. До необходимого pH довести добавлением 1 М HCl или 1 Н NaOH.

4.2.4.4. Приготовление 0,2 М раствора натрий-какодилатного буфера (BSA), pH 7,2 — 7,4.

Для приготовления 0,2 М раствора BSA в мерную колбу объемом 100 см3 внести 4,28 г Na-какодилата растворить в 50 — 70 см3 дистиллированной воды. После полного растворения довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой. Измеряется pH. До необходимого pH довести добавлением 1 М HCl. Измеряется pH. До необходимого pH довести добавлением 1 М HCl или 1 Н NaOH.

4.2.4.5 Приготовление 4%-го водного раствора четырехокиси осмия.

Для приготовления 25 см3 раствора 1 г OsO4 внести в бутыль объемом 50 см3, прилить 25 см3 дистиллированной воды. Перемешивать в течение 15 мин OsO4. Для полного растворения раствор хранить в течение 24 ч при плюс 4 °C в отдельном герметичном боксе, в специальной посуде с непроницаемой крышкой, без доступа воздуха, в темноте. После чего маточный раствор разаликвотить в виалы по 5 — 10 см3. Хранить раствор в морозильной камере при минус 20 °C и ниже в отдельном герметичном боксе, в специальной посуде с непроницаемой крышкой, без доступа воздуха и в темноте <4>.

<4> Меры предосторожности. Кристаллы OsO4 и его растворы очень токсичны, работать в перчатках и в маске под вытяжным шкафом. Фиксатор не стабилен, следует избегать соприкосновения с металлами, липидными и белковыми загрязнениями, воздухом. Использованный фиксатор нельзя сливать в канализацию, его следует собирать в специальную прочную тару с плотной герметичной крышкой.

4.2.5 Приготовление рабочих растворов.

4.2.5.1 Приготовление 1 Н раствора NaOH.

Для приготовления 100 см3 1 Н раствора NaOH к 10 см3 10 Н раствора NaOH добавить 90 см3 дистиллированной воды.

4.2.5.2 Приготовление раствора 0,1 М HCl.

Для приготовления 100 см3 0,1 М раствора HCl к 10 см3 1 М раствора HCl добавить 90 см3 дистиллированной воды.

4.2.5.3 Приготовление 0,1 М раствора фосфатно-солевого буфера (PBS)

Для приготовления 100 см3 0,1 М раствора PBS к 50 см3 0,2 М раствора PBS добавить 50 см3 дистиллированной воды.

4.2.5.4 Приготовление 0,1 М раствора натрий-какодилатного буфера (BSA)

Для приготовления 100 см3 0,1 М раствора BSA к 50 см3 0,2 М раствора BSA добавить 50 см3 дистиллированной воды.

4.2.5.5. Приготовление раствора для фиксации: 2,5% глутаровый альдегид и 2% формалин на фосфатно-солевом буфере.

Для приготовления 100 см3 раствора для фиксации в мерную колбу внести 50 см3 0,2 М раствора PBS, 10 см3 коммерческого препарата глутарового альдегида (25% водный раствор) и 5 см3 коммерческого препарата формалина (40% водный раствор). На pH-метре доводят pH буфера до 6,9 добавлением 1 М HCl или 1 Н NaOH. Далее довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой.

Для фиксации использовать свежеприготовленный раствор. При необходимости фиксатор можно хранить в холодильнике, при плюс 4 °C, в плотно укупоренной посуде.

4.2.5.6. Приготовление раствора для фиксации: 2,5% глутаровый альдегид и 2% формалин на натрий-какодилатном буфере.

Для приготовления 100 см3 раствора в мерную колбу внести 50 см3 0,2 М раствора BSA, 10 см3 коммерческого препарата глутарового альдегида (25% водный раствор) и 5 см3 коммерческого препарата формалина (40% водный раствор). На pH-метре доводят pH буфера до 6,9 добавлением 1 М HCl или 1 Н NaOH. Далее довести объем раствора до 100 см3 дистиллированной водой.

Для фиксации использовать свежеприготовленный раствор. При необходимости фиксатор можно хранить в холодильнике, при плюс 4 °C, в плотно укупоренной посуде.

4.2.5.7. Приготовление 1%-го четырехокиси осмия на 0,1 М фосфатно-солевом буфере.

Готовят непосредственно перед использованием. Для приготовления 10 см3 раствора в колбу внести 2,5 см3 4%-го водного раствора OsO4, 5 см3 0,2 М раствора PBS и довести до отметки дистиллированной водой.

4.2.5.8. Приготовление 1%-го четырехокиси осмия на 0,1 М натрий-какодилатном буфере.

Готовят непосредственно перед использованием! Для приготовления 10 см3 раствора в колбу внести 2,5 см3 4%-го водного раствора OsO4, 5 см3 0,2 М раствора BSA и довести до отметки дистиллированной водой.

4.2.5.9 Приготовление 50%-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1000 см3, содержащую 479 см3 дистиллированной воды, внести 521 см3 96%-го коммерческого этилового спирта.

4.2.5.10 Приготовление 60%-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1000 см3, содержащую 375 см3 дистиллированной воды, внести 625 см3 96%-го коммерческого этилового спирта.

4.2.5.11 Приготовление 80%-го раствора этилового спирта.

В мерную колбу объемом 1000 см3, содержащую 167 см3 дистиллированной воды, внести 833 см3 96%-го коммерческого этилового спирта.

4.2.5.12 Приготовление смеси эпоксидных смол.

Приготовление эпоксидных смол производить согласно инструкции производителя.

4.2.5.13 Приготовление смеси эпоксидных смол и ацетона 1:3.

Для приготовления смеси в колбу объемом 100 см3 внести 25 см3 смеси эпоксидных смол и прилить 75 см3 ацетона. Тщательно перемешать.

4.2.5.14 Приготовление смеси эпоксидных смол и ацетона 1:1.

Для приготовления смеси в колбу объемом 100 см3 внести 50 см3 смеси эпоксидных смол и прилить 50 см3 ацетона. Тщательно перемешивают.

4.2.5.15 Приготовление смеси эпоксидных смол и ацетона 3:1.

Для приготовления смеси в колбу объемом 100 см3 внести 75 см3 смеси эпоксидных смол и прилить 25 см3 ацетона. Тщательно перемешивают.

4.2.5.16 Приготовление 0,3%-го раствора формвара в дихлорэтане.

Для приготовления 100 см3 раствора 30 см3 коммерческого 1%-го раствора формвара внести в мерную колбу с притертой крышкой. Туда же прилить 70 см3 1,2-дихлорэтана. Тщательно перемешать. Раствор хранить в темноте в плотно укупоренной посуде.

4.2.5.17. Приготовление красителя: 4%-го раствора толуидинового синего на 1%-м тетраборате натрия.

Для приготовления 100 см3 красителя навеску 4 г порошка толуидинового синего и 1 г тетрабората натрия поместить в плотно закрывающуюся посуду. Прилить 100 см3 дистиллированной воды. Интенсивно перемешивать в течение 30 минут вручную, на шейкере или вортексе. Хранить в темноте. Перед использованием перемешивать и отфильтровать через микрофильтр 0,22 мкм.

4.2.5.18 Приготовление водного 2%-го раствора уранилацетата.

Для приготовления 10 см3 навеску 0,2 г порошка уранилацетата поместить в плотно закрывающуюся посуду. Прилить 10 см3 дистиллированной воды перемешивать до полного растворения вручную, на шейкере или вортексе. Хранить в темноте, перед использованием отфильтровать через микрофильтр 0,22 мкм.

4.2.5.19 Приготовление раствора цитрата свинца.

Для приготовления 50 см3 раствора цитрата свинца в мерную колбу на 50 см3 с притертой пробкой внести 30 см3 теплой свежекипяченой дистиллированной воды, добавить навески 1,33 г нитрата свинца и 1,76 г цитрата натрия. Перемешивание производить в течение 30 мин вручную, на шейкере или вортексе. После к раствору прилить 8 см3 1 Н раствора NaOH. Объем раствора довести до 50 см3 дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешать. Величина pH готового раствора должна быть в пределах 12 +/- 1. Раствор можно хранить до 6 месяцев. Перед использованием отфильтровать через микрофильтр 0,22 мкм.

4.2.6. Подготовка оборудования, приборов и сопутствующих инструментов для отбора и подготовки проб к анализу.

4.2.6.1. Подготовка оборудования, приборов и сопутствующих инструментов для подготовки проб к анализу производится согласно инструкциям производителя.

4.2.6.2. Подготовка сеток/блендов для ультратонких срезов проводится в соответствии с методическим документом <5>.

<5> Пункт 5.1.5.4 МР 1.2.2641-10.

4.2.6.3 Приготовление пленки:

• отфильтровать дистиллированную воду через мембранный фильтр (нейлон или PES) с размером пор не более 0,22 мкм и налить в широкую емкость до образования выпуклого мениска. При появлении пыли на поверхности воды произвести смену воды с трехразовой промывкой емкости отфильтрованной дистиллированной водой;
• чистое предметное стекло опустить в емкость с 0,3%-м раствором формвара, вынуть, поставить стекло ребром на фильтровальную бумагу для удаления излишков раствора и высушить;
• процарапать препаровальной иглой прямоугольник по краю стекла;
• коротко подышать на стекло с формваровой пленкой и медленно погрузить его в емкость с водой. В процессе погружения формваровая пленка отделится от стекла;
• вымытые бленды поместить на поверхность пленки с помощью пинцета;
• поверх пленки с блендами/сетками настелить кусочек парафильма;
• пленку вместе с парафильмом аккуратно снять с поверхности воды и поместить в чашку Петри (пленкой вверх) для последующего высушивания;
• высушить бленды/сетки не менее 24 часов при комнатной температуре в закрытой чашке Петри.

4.3 Принципиальная схема алгоритма отбора и анализа проб.

4.3.1. Пробоотбор и анализ проб осуществляется согласно план-дизайну эксперимента и рис. 1.

Рис. 1. Принципиальная схема алгоритма отбора и анализа проб.

4.3.2. Необходимым условием является наличие контрольной группы животных, не подвергшихся воздействию НЧ.

4.3.3. У каждого животного (не менее 6) из исследуемых групп отбираются образцы органов. У крупных однородных по несколько образцов из разных участков (например, печень, скелетная мускулатура). У неоднородных (например, головной мозг, сердце или почки) из заранее определенных план-дизайном участков органа или тканей.

4.3.4. Образцы делятся на 3 и более пробы (повторности) и фиксируются согласно п. 4.3.1.

4.3.5 Подготовка проб к анализу согласно п. 4.4.

4.3.6 Исследование проб методом ЭМ согласно п. 5.2.

4.3.7. Анализ электронных микрофотографий (далее — ЭМФ) проводится двумя независимыми исследователями согласно п. 5.2.

4.3.8. Анализ полученных данных и заключение согласно главе VI.

4.4. Отбор, транспортировка, хранение и фиксация проб органов и тканей.

4.4.1. Порядок отбора проб и транспортирования в лабораторию, проводящую исследования, а также их фиксации и хранения осуществляется в соответствии с методическими документами <6>.

<6> Пункты 4.6.12, 4.6.13, 4.7.4, 4.7.5, глава V МУ 1.2.2741-10; пункты 4.5, 4.8, глава V МУ 1.2.2745-10; пункт 5.1.5 МР 1.2.2641-10.

4.4.2. Для приготовления срезов для оценки цитотоксичности НЧ методом ЭМ полученные образцы тканей/органов разрезают острой бритвой на кусочки размером 1x1x1 мм. Не менее 3 проб от одного образца ткани/органа переносят в пробирки с фиксатором (п. 4.2.5.5 или 4.2.5.6).

4.4.3. Отношение объема фиксатора к фиксируемой ткани должно быть не менее 10:1.

4.4.4. Пробы от каждого образца помещают в отдельную маркированную пробирку.

4.4.5. Пробы, направляемые в лабораторию, снабжают этикеткой и актом отбора проб, в котором указывают место, время отбора, объект, органы, подписи лиц, отбиравших пробу.

4.4.6. При регулярном контроле pH возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4 °C. Нельзя допускать замораживание образцов, так как образующиеся кристаллы льда разрушают ткани.

4.5 Подготовка проб к анализу.

4.5.1. Пробоподготовка образцов для ЭМ, включающая в себя дофиксацию OsO4, дегидратацию, проводку, полимеризацию, изготовление ультратонких срезов и их контрастирование (табл. 5), проводится в соответствии с методическими документами <7>.

<7> Пункт 5.1.5.4.2 МР 1.2.2641-10.

Таблица 5

Протокол подготовки проб для исследования методом ЭМ

4.5.3. Для подтверждения наличия ткани в плоскости среза изготавливают полутонкие срезы толщиной 0,3 — 1,0 мкм и перемещают на предметное стекло. Срезы окрашивают 4% раствором толуидинового синего на 1%-м тетраборате натрия в течение 15 секунд на плитке при температуре плюс 60 °C. После чего краситель смывают дистиллированной водой.

4.5.4. На ультрамикротоме с помощью алмазного или стеклянного ножа получают ультратонкие срезы толщиной 50 — 100 нм. Срезы переносят на бленды или сетки, покрытые формваровой пленкой и высушивают не менее 1 ч на воздухе.

4.5.5 Контрастирование ультратонких срезов растворами уранилацетата и цитрата свинца:

4.5.5.1 Очистить пару пинцетов ацетоном, затем промыть дистиллированной водой;

4.5.5.2 Уложить и закрепить чистый кусочек парафильма в двух чашках Петри;

4.5.5.3 Наполнить 6 стаканов объемом 100 см3 теплой свежекипяченой дистиллированной водой;

4.5.5.4 Нанести несколько капель раствора уранилацетата на парафильм;

4.5.5.5. Во вторую чашку Петри поместить гранулы NaOH вокруг края парафильма, чтобы поглотить CO2. Закрыть чашку Петри крышкой;

4.5.5.6. Взять сетку чистым пинцетом и поместить сетку срезом вниз на каплю раствора уранилацетата. Накрыть чашку Петри светонепроницаемой крышкой и оставить сетки на 10 минут;

4.5.5.7. Во время контрастирования срезов уранилацетатом, используя длинную пипетку Пастера отобрать небольшой объем раствора цитрата свинца из мерной колбы. Открыв верхнюю часть чашки Петри настолько, чтобы вставить пипетку Пастера, вылить первые 2 — 3 капли цитрата свинца на гранулы NaOH. Затем нанести несколько капель (по одной капле на каждую сетку) цитрата свинца на парафильм. Немедленно закрыть крышкой;

4.5.5.8. Извлечь сетку из уранилацетата, опустить сетку в первый стакан с дистиллированной водой и взболтать сетку. Повторить процесс в двух других стаканах с дистиллированной водой. Нельзя позволять сетке высохнуть;

4.5.5.9. Поместить сетку на каплю цитрата свинца; будьте осторожны, открывая крышку чашки Петри только настолько, чтобы поместить сетку срезом вниз на пятно;

4.5.5.10. Через 5 минут открыть чашку Петри ровно настолько, чтобы извлечь сетку и промыть в стаканах с водой, как это было сделано в п. 4.5.5.8;

4.5.5.11 Высушить сетку, используя штифты из фильтровальной бумаги, поместив бумажный штифт между кончиками щипцов;

4.5.5.12. Поместить сетку к коробку для хранения и транспортировки сеток для ЭМ.

4.5.6. При использовании РЭМ в режиме детектирования прошедших электронов в качестве оборудования для визуализации, рекомендуется произвести напыление пленки углерода толщиной 2 — 5 нм на срез (сетку/бленд) для снятия заряда с поверхности и стабилизации изображения. Нанесенный слой не оказывает влияния на визуализацию субклеточных структур, так как является электроннопрозрачным в условиях съемки.

V. Методика проведения анализа

5.1. Подготовка оборудования, приборов и сопутствующих инструментов для анализа.

5.1.1. Для визуализации объектов помимо ПЭМ рекомендуется применение РЭМ. РЭМ для проведения исследования должен отвечать ряду требований:

• диапазон величин ускоряющего напряжения электронов — не уже 25 — 30 кВ;
• диапазон увеличений — не уже 20000 — 100000;
• разрешение не должно превышать 3 нм;
• необходимо наличие приставки ПРЭМ.

5.1.2. Подготовка электронного микроскопа перед исследованием должна осуществляться квалифицированным оператором в соответствии с инструкцией пользователя.

5.1.3. Принимается, что для корректной оценки топологии внутренней мембраны митохондрий необходимо получить изображение митохондрии с толщиной мембраны не менее 3 пикселов. Таким образом, выбор увеличения проводят при помощи таблицы 6, полученной в предположении, что увеличение микроскопа рассчитывается для стандартного размера изображения 127x95 мм.

Таблица 6

Зависимость размера пикселя от увеличения, разрешения изображения и ширины поля зрения (при L = 127 мм)

При заданном увеличении M, ширина поля зрения составит, формула (1):

l = \frac{L}{M} , (1)

где: L — ширина изображения, мм; l — ширина поля зрения, мм;

M — увеличение электронного микроскопа, крат.

Тогда при разрешении 1280x960 пикселов, размер пиксела Dп составит, формула (2):

D_{\text{п}} = \frac{l}{N_{\text{п}}} , (2)

где: Nп — количество пикселей, шт.

5.2 Алгоритм получения ЭМФ.

5.2.1. На сетке анализируют только один ультратонкий срез наилучшего качества из серии (например, с наибольшей просматриваемой площадью, отсутствием артефактов, складок, разрывов), для предотвращения дублирования оценки митохондрий.

5.2.2. Съемку производят при в диапазоне увеличений 20000 — 100000 x с учетом выполнения условия, приведенного в п. 5.1.3, а также в поле зрения не должно попадать более 20 митохондрий.

5.2.3. Сохраняют снимки не менее 20 участков, равномерно распределенных по срезу (рис. 2). Параллельно ведут подсчет митохондрий, целиком попавших в поле зрения.

Рис. 2. Пример распределения регистрируемых участков по площади исследуемого ультратонкого среза

5.2.4. В случае, если суммарное количество митохондрий на снимках менее 100 шт., делают дополнительные снимки до достижения минимального значения.

5.2.5. В случае недостаточного количества митохондрий на срезе (низкая плотность митохондрий или недостаточная просматриваемая площадь среза), подготавливают дополнительную серию ультратонких срезов с шагом не менее 10 мкм от изученного участка ткани/органа.

5.3 Порядок анализа изображений.

5.3.1. Перед началом морфотипирования митохондрий из полученных ЭМФ необходимо составить комплект репрезентативных ЭМФ митохондрий на основе описания топологии внутренней мембраны митохондрий (приложение 1 к настоящим МР).

5.3.2 Анализ ЭМФ проводят параллельно 2 независимых исследователя.

5.3.3. При анализе полученных ЭМФ, при необходимости, исследователь дополнительно корректирует контраст и яркость изображений.

На основании визуальной оценки топологии внутренней мембраны митохондрий, сверяя изображения с референсами, исследователь присваивает митохондриям один из пяти соответствующих морфотипов (приложение 1 к настоящим МР). Результаты морфотипирования вносят в таблицу, где 1 строка соответствует 1 классифицированной митохондрии (таблица 7).

Таблица 7

Рекомендуемый шаблон сводной таблицы морфотипированных митохондрий

VI. Обработка данных

6.1. После завершения анализа ЭМФ проводят расчет процентного распределения митохондрий по пяти морфотипам от общего их числа обнаруженных в пробе по результатам анализа изображений (таблица 7) каждым исследователем отдельно. Результаты расчетов вносят в таблицу 8.

Таблица 8

Рекомендуемый шаблон таблицы процентного распределения митохондрий по морфотипам для каждой пробы

6.2. Производят проверку корреляции результатов независимых исследователей для значений каждого типа ткани/органа отдельно, но для одной группы животных (таблица 9).

Таблица 9

Рекомендуемый шаблон таблицы с коэффициентами корреляции значений полученными 2 независимыми исследователями

В том случае, если коэффициент корреляции r < 0,4, то проводят дополнительный анализ ЭМФ третьим исследователем. Дальнейшие расчеты ведут с использованием данных, полученных парой исследователей с наибольшим значением коэффициента корреляции при условии, что оно >= 0,4.

6.3. Далее производят последовательное усреднение значений (среднее арифметическое), согласно схеме исследования (рисунок 1). Сначала усредняют результаты независимых исследователей для каждой пробы. После, полученные значения усредняют для каждого типа ткани или органа. Результаты расчета вносят в таблицу 10.

Таблица 10

Рекомендуемый шаблон таблицы процентного распределения митохондрий по морфотипам для каждого типа ткани или органа

6.4. По данным из табл. 8 производят расчет средних значений для группы животных (для каждой ткани/органа отдельно) со среднеквадратическим отклонением (табл. 11).

Таблица 11

Рекомендуемый шаблон таблицы первичных результатов исследования цитотоксичности НЧ

6.5. Процентные значения для каждого морфотипа и группы животных пересчитывают на 1000 митохондрий согласно формуле 3:

Ki = pi/100 x 1000, (3)

где: p — процент митохондрий;

i — морфотип митохондрий.

Получение значения округляются до единиц и вносятся в табл. 12.

Таблица 12

Рекомендуемый шаблон таблицы для проведения статистического анализа с помощью критерия согласия Пирсона (X2)

Рис. 3. Схема анализа данных

Примечание:

<1> — распределение митохондрий по морфотипам контрольной группы принимается как ожидаемое, а опытной группы как наблюдаемое. При анализе число степеней свободы d.f. = 4, уровень значимости p = 0,05;

<2> — критерий согласия Пирсона (X^2) сравнивает лишь средние значения для групп без учета внутригрупповой вариабельности;

<3> — противоречивые результаты тестов (высокая вариабельность значений, недостаток количества особей в группах или иные причины.

VII. Представление результатов

7.1. По результатам исследования и статистического анализа готовится заключение (приложение 2 к настоящим МР):

7.1.1. Характеристики НЧ:

• наименование исследуемого вещества;
• размер;
• форма;
• счетная концентрация;
• массовая концентрация.

7.1.2. Описание животных:

• вид и порода;
• пол;
• возраст на начало эксперимента.

7.1.3. Дизайн исследования:

• продолжительность исследования;
• метод введения вещества;
• периодичность введения;
• длительность экспозиции/объем вещества;
• суммарная счетная доза за весь период;
• суммарная массовая доза за весь период;

7.1.4. Описание проб:

• орган/ткань;
• отдел/область;
• клетки.

7.1.5. письменное заключение о наличии цитотоксического действия исследуемых НЧ на клетки изученных тканей/органов.

7.1.6. перечень исполнителей по выполняемым операциям с указанием должности и подписью.

7.2 К заключению необходимо предоставить приложение, включающее:

• репрезентативные ЭМФ пяти морфотипов митохондрий;
• значение критерия согласия Пирсона (\chi^{2}) и уровень значимости;
• таблицу с результатами исследования цитотоксичности НЧ, содержащую:
• количество животных в каждой из групп;
• средние значения процента митохондрий всех морфотипов каждой из групп;
• среднеквадратическое отклонение;
• коэффициент корреляции между значениями, полученными 2 независимыми исследователями для каждой из групп;
• результаты попарного сравнения контрольной и опытной группы по процентным значениям каждого из морфотипов митохондрий (при наличии различий в распределении митохондрий по морфотипам между группами).

Приложение 1 к МР 1.2.0307-22

ОПИСАНИЕ МОРФОТИПОВ МИТОХОНДРИЙ

Рис. 3. Репрезентативные ЭМФ пяти морфотипов митохондрий, на основании топологии внутренней мембраны: (a) нормальный; (b) нормально-везикулярный; (c) везикулярный; (d) везикулярно-набухший; (e) набухший. Масштабные полосы представляют 200 нм на изображениях a — d и 100 нм на изображении e.

Таблица 1.1

Описание пяти типов морфотипов митохондрий

Приложение 2 к МР 1.2.0307-22

ПРИМЕР ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Протокол об оценке цитотоксического воздействия наночастиц методом электронной микроскопии

Рис. 1. Репрезентативные ЭМФ пяти морфотипов митохондрий нейронов базальных ядер головного мозга крыс при интраназальном введении суспензии PbO, на основании топологии внутренней мембраны: (a) нормальный; (b) нормально-везикулярный; (c) везикулярный; (d) везикулярно набухший; (e) набухший.

Значение критерия согласия — \chi^{2}(4;0,05) = 641,5 ; p << 0,001.

Таблица 2.1

Результаты исследования цитотоксичности НЧ на нейроны базальных ядер головного мозга крысы

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Федеральный закон от 30.12.2020 № 492-ФЗ «О биологической безопасности в Российской Федерации».

3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.09.2007 № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов».

4. МУ 1.2.2741-10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных».

5. МУ 1.2.2745-10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных».

6. МР 1.2.2641-10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах».

7. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».

8. ГОСТ 23932 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия».

9. ГОСТ 21241 «Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

10. ГОСТ 21240 «Скальпели и ножи медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

11. ГОСТ 4328 «Натрия гидроокись. Технические условия».

12. ГОСТ 3118 «Кислота соляная. Технические условия».

13. ГОСТ 4198 «Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия».

14. ГОСТ 2493 «Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия».

15. CAS № 6131-99-3 «Натрий какодилат тригидрат».

16. CAS № 20816-12-0 «Осмия тетроксид».

17. CAS № 111-30-8 «Глутаровый альдегид».

18. ГОСТ 1625 «Формалин технический. Технические условия».

19. CAS № 92-31-9 «Толуидиновый синий».

20. ГОСТ 4199 «Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия».

21. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».

22. ГОСТ 5962 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».

23. ГОСТ 2603 «Ацетон. Технические условия».

24. CAS № 63148-64-1 «Формвар».

25. ГОСТ 1942 «1,2-Дихлорэтан технический».

26. ГОСТ 4236 «Свинец (II) азотнокислый. Технические условия».

27. ГОСТ 22280 «Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия».

28. ГОСТ 32337 «Перчатки медицинские диагностические нитрильные».

29. ГОСТ Р 51243 «Бритвенные системы для влажного бритья. Общие технические условия».

30. ГОСТ 9284 «Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия».

31. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

32. ГОСТ 12026 «Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия».