МР 02.032-08. Идентификация микроорганизмов и определение их чувствительности к антибиотикам с применением автоматического микробиологического анализатора VITEK 2 Compact. Методические рекомендации

(утв. Роспотребнадзором 30.06.2008)

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ С ПРИМЕНЕНИЕМ АВТОМАТИЧЕСКОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗАТОРА VITEK 2 COMPACT

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 02.032-08

1. Разработаны:

ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора;

НИИ Антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»;

ФГУЗ ФЦГиЭ Московской области;

ФГУЗ ГЦГСЭН Министерства обороны РФ

при участии ООО «Биомерье», г. Москва.

2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Роспотребнадзора (протокол № 4 от 30.06.2008).

3. Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета, Главным врачом ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора А.И. Верещагиным 30 июня 2008 г.

4. Введены впервые.

1. Область применения

Настоящие Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих бактериологические исследования с целью выделения и идентификации патогенных биологических агентов (ПБА) бактериальной этиологии (бактерий, грибов) из клинического материала, объектов окружающей среды, а также определения их чувствительности к антимикробным препаратам.

2. Нормативные ссылки

2.1. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)».

2.2. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV группы патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

2.3. СанПиН 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

2.4. «Временные рекомендации (правила) по охране труда при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Минздрава России». М., 2002.

2.5. «Инструкция по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений». М., 1991.

3. Общие положения

Идентификация основана на анализе изменения биохимических субстратов под действием микроорганизмов. Определение чувствительности производится на основании подавления роста микроорганизмов под действием различных концентраций антибиотиков. При этом определяются минимальные ингибирующие концентрации (МИК) антибиотиков, которые выражаются в мг/л и интерпретируются в виде категорий «устойчив», «чувствителен», «умеренно устойчив».

4. Сущность метода

Работа в анализаторе VITEK 2 Compact проводится с чистой культурой микроорганизма. В качестве расходных материалов используются пластиковые карты, содержащие биохимические субстраты (ID-карты, карты для идентификации) или антибиотики в различных концентрациях (AST-карты, карты для определения чувствительности). Карты под вакуумом, создаваемым анализатором, в автоматическом режиме заполняются суспензией чистой культуры микроорганизмов, запаиваются и помещаются в карусель, где они инкубируются и регулярно (каждые 15 минут) сканируются оптической системой анализатора. При этом для считывания ID-карт используется колориметрия (анализатор содержит 2 оптических модуля и использует волны 660, 428 и 568 нанометров), для считывания AST-карт — турбидиметрия (фиксируется изменение плотности микробной суспензии под влиянием антибиотика). Результаты сканирования подвергаются компьютерной обработке. По завершении идентификации анализатор найдет в базе данных соответствие тестируемому микроорганизму или проведет определение чувствительности к антибиотикам, после чего карта сбрасывается в специальный приемник.

5. Методы отбора и подготовки проб

Исследуемый материал инокулируется на питательные среды согласно методам микробиологических исследований, утвержденных в установленном порядке. Чашки инкубируются 18 — 24 (48) ч до получения изолированных колоний. Колонии микроорганизмов для исследования на VITEK 2 Compact рекомендуется брать с неселективных питательных сред. Используется только чистая культура микроорганизмов.

6. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды

Анализатор Vitek 2 Compact

Суспензиальный раствор (0,45% раствор хлорида натрия)

Диспенсер суспензиального раствора

Пластиковые пробирки для анализатора Vitek 2 Compact

Карты для идентификации

Карты для определения чувствительности

Петли бактериологические

Тампоны стерильные

Денситометр

7. Подготовка к испытанию

Перед началом работы необходимо, следуя инструкциям программного обеспечения, ввести информацию об используемых AST-картах, а также произвести ряд общих настроек: настроить печать (автоматическая или по требованию) и прочие параметры, следуя инструкции пользователя по программному обеспечению.

Чистая культура (материал одной или нескольких изолированных колоний) с помощью бактериологической петли или тампона вносится в пластиковую пробирку с суспензиальным раствором и гомогенизируется там до достижения требуемой плотности бактериальной суспензии <1>:

для грамположительных и грамотрицательных бактерий: 0,5 — 0,63 McF <2>;

для прихотливых бактерий: 2,7 — 3,3 McF;

для бацилл: 1,8 — 2,2 McF;

для грибов: 1,8 — 2,2 McF.

---

<1> Работа с ПБА I — II должна проводиться в соответствии с СП 1.3.1285-03.

<2> Стандарт 1 McF (мутности по МакФарланду) соответствует 300 миллионам бактериальных клеток в мл.

Выбор карты для исследования производится на основании окраски по Граму или пробы с КОН, позволяющей разделить бактерии на грамположительные и грамотрицательные. При этом следует использовать карты VITEK 2 GP (грамположительные) или VITEK 2 GN (грамотрицательные) соответственно. Микроорганизмы, прихотливые к условиям культивирования (нейссерии, гемофилы и прочие <3>), идентифицируются при помощи карт VITEK 2 NH, грибы — карт VITEK 2 YST. Карты VITEK 2 BCL предназначены для идентификации микроорганизмов рода Bacillus.

---

<3> Перечень микроорганизмов, идентифицируемых на различных картах, см. в Приложении.

Пробирки с суспензиями устанавливаются в кассету, напротив них в специальные прорези (слоты) устанавливаются соответствующие карты, так, чтобы относящаяся к карте пластиковая трубочка была погружена в пробирку.

8. Проведение испытания

8.1 Работа в режиме виртуальной кассеты

Виртуальная кассета создается согласно инструкции по программному обеспечению. В соответствующие ячейки образовавшейся таблицы вводится номер штрих-кода (путем считывания штрих-кода ридером), рядом с которым проставляются лабораторные номера. Затем созданную «виртуальную кассету» необходимо сохранить в памяти компьютера. (Время от момента сохранения «виртуальной кассеты» до момента загрузки собственно кассеты с картами в прибор не должно превышать 30 минут.)

Далее следует приступить к загрузке кассеты с картами в вакуумную камеру анализатора. Перед тем как загружать кассету в камеру, следует убедиться (это отображено на маленьком собственном мониторе анализатора), что статус прибора «ok», вакуумная камера готова к работе и в карусели имеется достаточное количество свободных мест. В том случае, если все эти условия соблюдены, можно открыть дверцу вакуумной камеры, поместить туда кассету с картами, плотно закрыть дверцу и нажать на клавишу «Начать заполнение».

В процессе заполнения карт суспензией в вакуумной камере рекомендуется не отходить от анализатора и, дождавшись (ожидание занимает 70 секунд), когда раздастся сигнал и замигает стрелка индикатора, открыть камеру. При этом разблокируется дверца загрузочного модуля, которую следует открыть и переставить кассету с заполненными картами из одной камеры в другую. Затем дверцы анализатора следует закрыть в произвольной последовательности. Если кассета не будет перенесена из вакуумной камеры в загрузочный модуль в течение 10 минут, прибор не примет ее для дальнейшего исследования.

После помещения кассеты в загрузочный модуль рекомендуется дождаться окончания процесса считывания штрих-кодов (занимает примерно 1 минуту), не отходя от анализатора. Мелодичный сигнал говорит о нормально прошедшем процессе считывания. Грубый звук сигнализирует об имеющихся ошибках. В последнем случае следует установить причину ошибок, вызвав их описание на дисплее анализатора. После нормально прошедшей загрузки индикатор загрузочного модуля будет показывать мигающую синюю стрелку. Кассету с оставшимися пробирками из этой камеры прибора можно извлечь сразу или в другое время (например, при загрузке следующей кассеты).

8.2 Работа в режиме постановки тестов с последующим описанием

При данном режиме работы кассета с картами помещается в вакуумную камеру и дальше — в загрузочный модуль без предварительного этапа внесения данных в компьютер. В этом случае результаты обработки карт в окне результатов изолята появятся только после внесения необходимой информации (лабораторного номера) в таблицу окна постановки тестов с последующим описанием.

8.3 Внесение данных об образце

Внести данные об образце (если эта функция активирована) можно как до момента загрузки карт в анализатор, так и после завершения обработки карт. При этом нужно иметь в виду, что результаты анализов с отсутствующей информацией об образце не будут переноситься в архив.

9. Обработка результатов

После считывания карт полученные результаты анализируются программным обеспечением.

Результаты исследования карт можно просмотреть (распечатать) в соответствующем окне интерфейса.

10. Ограничение метода

Корректная идентификация и определение чувствительности с использованием анализатора VITEK 2 Compact возможны только для микроорганизмов, имеющих клиническое значение.

(Наименования идентифицируемых анализатором Vitek 2 Compact микроорганизмов приводятся в соответствии с 9-м изданием Определителя бактерий Берджи с учетом последних изменений, опубликованных в International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (www.bacterio.net).)

Бактерии, идентифицируемые на карте VITEK 2 GN
Enterobacteriaceae	Не Enterobacteriaceae
Buttiauxella agrestis	Achromobacter denitrificans
Cedecea davisae	(ранее Achromobacter
Cedecea lapagei	xylosoxidans ssp. denitrificans)
Citrobacter amalonaticus	Achromobacter xylosoxidans
Citrobacter braakii	(ранее Achromobacter
Citrobacter farmeri	xylosoxidans ssp. xylosoxidans)
Citrobacter freundii	Acinetobacter baumannii
Citrobacter koseri	Acinetobacter haemolyticus
Citrobacter sedlakii	Acinetobacter junii
Citrobacter youngae	Acinetobacter lwoffii
Edwardsiella hoshinae	Actinobacillus ureae
Edwardsiella tarda	Aeromonas hydrophila/Aeromonas
Enterobacter aerogenes	cavlae
Enterobacter amnigenus 1	Aeromonas salmonicida
Enterobacter amnigenus 2	Aeromonas sobria
Enterobacter asburiae	Aeromonas veronii
Enterobacter cancerogenus	Alcaligenes faecalis ssp. faecalis
Enterobacter cloacae	Bordetella bronchiseptica
Enterobacter gergoviae	Bordetella trematum
Enterobacter intermedius	Brevundimonas diminuta/vesicularis
Enterobacter sakazakii	Brucella melitensis
Escherichia coli	Budvicia aquatica
Escherichia coli 0157	Burkholderia cepacia группа
Escherichia fergusonii	Burkbolderia gladioli
Escherichia hermannii	Burkholderia mallei
Escherichia vulneris	Burkholderia pseudomallei
Ewingella americana	CDC группа EF-4 (Pasteurella)
Hafhia alvei	Chromobacterium violaceum
Klebsiella oxytoca	Chryseobacterium gleum
Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae	Chryseobacterium indologenes
Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae	Chryseobacterium meningosepticum
Klebsiella pneumoniae ssp. rhinoscleromatis	Comamonas testosteroni Delftia acidovorans
Kluyvera ascorbata	Francisella tularensis
Kluyvera cryocrescens	Grimontia hollisae
Leclercia adecarboxylata	(ранее Vibrio hollisae)
Moellerella wisconsensis	Mannheimia haemolytica
Morganella morganii ssp. morganii	Methylobacterium spp.
Morganella morganii ssp. sibonii	Moraxella группа
Pantoea agglomerans	Myroides spp.
Pantoea spp.	Ochrobactrum anthropi
Proteus mirabilis	Oligella ureolytica
Proteus vulgaris группа/Proteus penneri	Paracoccus yeeii (ранее CDC группа EO-2)
Providencia alcalifaciens	Pasteurella aerogenes
Providencia rettgeri	Pasteurella multocida
Providencia rustigianii	Rasteurella pneumotropica
Providencia stuartii	Photobacterium damselae
Rahnella aquatilis	Piesiomonas shigelloides
Raoultella ornithinolytica	Pseudomonas aeruginosa
Salmonella enterica ssp. anzonae	Pseudomonas alcaligenes
(ранее Salmonella choleraesuis ssp. arizonae)	Pseudomonas fluorescens Pseudomonas luteola
Salmonella группа	Pseudomonas mendocina
Salmonella ser. Gallinarum	Pseudomonas oryzihabitans
Salmonella ser. Paratyphi A	Pseudomonas pseudoailcaligenes
Salmonella ser. Typhi	Pseudomonas putida
Serratia ficaria	Pseudomonas stutzeri
Serratia fonticola	Ralstonia mannitolilytica
Serratia liquefaclens группа	Ralstonia pickettii
Serratia marcescens	Rhizobium radiobacter
Serratia odorifera	Shewaneiia putrefaciens
Serratia plymuthica	Sphingobacterium multivorum
Serratia rubidaea	Sphingobacterium spiritivorum
Shigella группа	Sphingobacterium thalpophiium
Shigella sonnei	Sphingomonas paucimobilis
Yersinia enterocolitica группа	Stenotrophomonas maltophilia
Yersinia pestis	Vibrio alginolyticus
Yersinia pseudotuberculosis	Vibrio cholerae
Yersinia ruckeri	Vibrio fluvialis
Yokenella regensburgei	Vibrio metschnikovii Vibrio mimicus Vibrio parahaemolyticus Vibrio vulnificus Wautersia paucula (ранее Ralstonia paucula)
Высоко вирулентные виды
Brucella melitensis
Burlkholderia mallei
Burlkholderia pseudomallei
Escherichia coli 0157
Francisella tularensis
Vibrio cholerae
Yersinia pestis

Бактерии, идентифицируемые на карте GP
Abiotrophia defectiva	Streptococcus constellatus
Aerococcus urinae	ssp. constellatus
Aerococcus viridans	Streptococcus constellatus
Alloiococcus otitis	ssp. pharyngis
Dermacoccus nishinomiyaensis/	Streptococcus cristatus
Kytococcus sedentarius	Streptococcus downel
Enterococcus avium	Streptococcus dysgalactiae ssp.
Enterococcus casseliflavus	dysgalactiae
Enterococcus cecorum	Streptococcus dysgalactiae ssp.
Enterococcus columbae	equisimilis
Enterococcus durans	Streptococcus equi ssp. equi
Enterococcus faecalis	Streptococcus equi ssp.
Enterococcus faecium	zooepidemicus
Enterococcus gallinarum	Streptococcus equlnus
Enterococcus hirae	Streptococcus gallolyticus ssp.
Enterococcus raffinosus	gallolyticus
Enterococcus saccharolyticus	Streptococcus gallolyticus ssp.
Erysipelothrix rhusiopahiae	pasteurlanus
Facklamia hominis	Streptococcus gordonii
Gardnerella vaginalis	Streptococcus hyointestinalis
Gemella bergeri	Streptococcus infantarius ssp.
Gemella haemolysans	infantarius
Gemella morbillorum	Streptococcus infantarius
Gemella sanguinis	ssp. coli/Streptococcus bovis
Giobicatella sanguinis	Staphylococcus epidermidis
Giobicatella suifidifaciens	Staphylococcus equorum
Granuiicatella adiacens	Staphylococcus gallinarum
Granuiicatella eiegans	Staphylococcus haemolyticus
Helcococcus kunziii	Staphylococcus hominis
Kocuria kristinae	Staphylococcus hyicus
Kocuria rosea	Staphylococcus intermedius
Kocuria varians	Staphylococcus kloosii
Lactococcus garvieae	Staphylococcus lentus
Lactococcus lactis ssp. cremoris	Staphylococcus lugdunensis
Lactococcus lactis ssp. lactis	Staphylococcus saprophyticus
Lactococcus raffinolactis	Staphylococcus schleiferi
Leuconostoc citreum	Staphylococcus sciuri
Leuconostoc lactis	Staphylococcus simulans
Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris	Staphylococcus vitulinus Staphylococcus warneri
Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum	Staphylococcus xylosus Streptococcus agalactiae
Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides	Streptococcus alactolyticus Streptococcus anginosus
Leuconostoc pseudomesenteroides	Streptococcus canis
Listeria grayi	Streptococcus intermedius
Listeria innocua	Streptococcus mitis/Streptococcus
Listeria ivanovii	oralis
Listeria monocytogenes	Streptococcus mutans
Listeria seeligeri	Streptococcus ovis
Listeria welshimeri	Streptococcus parasanguinis
Micrococcus luteus/lylae	Streptococcus pluranimalium
Pediococcus acidilactici	Streptococcus pneumoniae
Pediococcus pentosaceus	Streptococcus porcinus
Rothia mucilaginosa	Streptococcus pyogenes
Staphylococcus arlettae	Streptococcus salivarius
Staphylococcus aureus <*>	Streptococcus sanguinis
Staphylococcus auricuiaris	Streptococcus sobrinus
Staphylococcus capitis	Streptococcus suis I
Staphylococcus caprae	Streptococcus suis II
Staphylococcus carnosus ssp. carnosus	Streptococcus thermophilus
Staphylococcus chromogenes	Streptococcus thoraltensis
Staphylococcus cohnii ssp. cohnii	Streptococcus uteris
Staphylococcus cohnii ssp. urealyticus С (ранее Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum)	Streptococcus vestibularis Vagococcus fluvialis

---

<*> Staphylococcus aureus включает только подвид aureus.

Бактерии, идентифицируемые на карте NH
Actinobacillus ureae	Haemophilus segnis
Campylobacter coli	Haemophilus parainfluenzae
Campylobacter fetus ssp. fetus	Kingella denitrificans
Campylobacter jejuni ssp. jejuni	Kingella kingae
Capnocytophaga spp.	Moraxella (Branhamella) catarrhalis
Cardiobacterium hominis	Neisseria cinerea
Eikenella corrodens	Neisseria elongata
Gardnerella vaginalis	Neisseria gonorrhoeae
Haemophilus actinomycetemcomitans	Neisseria lactamica
Haemophilus aphrophilus/ paraphrophilus	Neisseria meningitidis Neisseria sicca
Haemophilus haemolyticus	Oligella urethralis
Haemophilus influenzae	Suttonella indologenes
Haemophilus parahaemolyticus

Грибы, идентифицируемые на карте YST
Candida albicans	Candida utilis
Candida boidinii	Candida zeylanoides
Candida catenulata	Cryptococcus albidus
Candida colliculosa	Cryptococcus laurentii
Candida dubliniensis	Cryptococcus neoformans
Candida famata	Cryptococcus terreus
Candida freyschussii	Cryptococcus uniguttulatus
Candida glabrata	Geotrichum capitatum
Candida guilliermondii	Geotrichum kiebahnii
Candida haemulonii	Kioeckera spp.
Candida intermedia	Kodamaea ohmeri
Candida kefyr	Malassezia furfur
Candida krusei/Candida inconspicua/	Malaiassezia pachydermatis
Candida lambica	Pichia farinosa
Candida lipolytica	Prototheca wickerhamii
Candida lusitaniae	Prototheca zopfii
Candida magnoliae	Rhodotorula glutinis/Rhodotorula
Candida norvegensis	mucilaginosa
Candida parapsilosis	Rhodotorula minuta
Candida peliculosa	Saccharomyces cerevisiae
Candida pulchemma	Sporoboiomyces salmonicolor
Candida rugosa	Steplianoascus ciferrii
Candida sake	Trichosporon asahii
Candida sphaerica	Trichosporon inkin
Candida tropicalis	Trichosporon mucoides Zygosaccharomyces bailii

Бактерии, идентифицируемые на карте BCL
Aneurinibacillus aneurinilyticus	Brevibacillus centrosporus
Bacillus amyloliquefaciens	Brevibacillus choshinensis
Bacillus anthracis	Brevibacillus invocatus
Bacillus badius	Brevibacillus laterosporus
Bacillus cereus	Brevibacillus parabrevis
Bacillus circulans	Geobacillus stearothermophilus
Bacillus coagulans	Geobacillus thermodenitrificans
Bacillus firmus	Geobacillus thermoglucosidasius
Bacillus fusiformis	Paenibacillus alvei
Bacillus lentus	Paenibacillus amylolyticus
Bacillus licheniformis	Paenibacillus durus (ранее
Bacillus megaterium	Paenibacillus azotofixans)
Bacillus mycoides	Paenibacillus glucanolyticus
Bacillus pumilus	Paenibacillus macerans
Bacillus smithii	Paenibacillus pabuli
Bacillus sphaericus	Paenibacillus peoriae
Bacillus sporothermodurans	Paenibacillus polymyxa
Bacillus subtilis	Paenibacillus thiaminolyticus
Bacillus thuringiensis	Paenibacillus validus
Brevibacillus agri	Virgibacillus pantothenticus
Brevibacillus borstelensis	Virgibacillus proomii
Brevibacillus brevis

---