Методика по исследованию спермы крупного рогатого скота на контаминацию вирусом инфекционного ринотрахеита — пустулезного вульвовагинита (ИРТ-ИПВ)

(утв. Минсельхозом СССР 08.02.1983)

Утверждена 8 февраля 1983 года

МЕТОДИКА ПО ИССЛЕДОВАНИЮ СПЕРМЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА КОНТАМИНАЦИЮ ВИРУСОМ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА — ПУСТУЛЕЗНОГО ВУЛЬВОВАГИНИТА (ИРТ-ИПВ)

ИРТ-ИПВ — остро протекающая контагиозная болезнь, характеризующаяся катарально-некротическими поражениями органов дыхания, лихорадкой, общим угнетением и конъюнктивитом, а также развитием пустулезного вульвовагинита и появлением абортов у коров, а также баланопаститами у быков.

Возбудителем болезни является ДНК-содержащий вирус из группы герпесвирусов. Вирус культивируется в культуре первично-трипсинизированных и перевиваемых клеток почек и семенников телят, не обладает гемадсорбирующими и гемагглютинирующими свойствами, чувствителен к эфиру, хлороформу, инактивируется при 56 °C в течение 20 мин, при 37 °C — через 4...10 дней, быстро теряет активность в кислой среде, но длительно сохраняется при pH 6...9 и температуре 40 °C или в замороженном состоянии.

Метод обнаружения вирусных контаминантов в сперме основан на выделении вируса в культуре клеток и идентификации его в реакции нейтрализации или методом флуоресцирующих антител.

Исследованию подлежит неразбавленная сперма, а также сперма, разбавленная и сохраненная при 2...5 °C или в замороженном виде при температуре -190 °C.

Выделение вируса проводят путем заражения первично-трипсинизированной культуры клеток почек эмбрионов коровы (ПЭК) или тестикул бычков (ТБ).

Для проведения исследований применяют следующее оборудование и реактивы:

• автоклав;
• центрифуга на 8 тыс. об/мин;
• шкаф сушильный;
• термостат;
• магнитная мешалка;
• микроскоп биологический;
• микроскоп люминесцентный;
• ножницы;
• пипетки мерные 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 мл;
• колбы мерные;
• чашки бактериологические ГОСТ 10515-63;
• пробки резиновые № 12, 14, 24;
• фильтры марлевые;
• раствор Хенкса pH 7,2...7,4;
• 0,5% раствор гидролизата лактальбумина;
• сыворотку крупного рогатого скота;
• специфическую сыворотку против вируса ИРТ и отрицательную сыворотку;
• флуоресцирующую сыворотку против вируса ИРТ;
• масло нефлуоресцирующее;
• антибиотики: пенициллин натриевая соль, стрептомицин хлоркальциевый комплекс, полимиксин, сульфат M, микостатин (нистатин);
• спирт этиловый-ректификат ГОСТ 5962-67.

ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ

Подготовка к исследованию спермы. Неразбавленную сперму перед инокуляцией в культуру клеток разводят 1:10 раствором Хенкса, содержащем пенициллин, стрептомицин 750...1000 мкг/мл, полимиксин — по 750...1000 ЕД/мл и микостатин (нистатин) — 50 ЕД/мл. Сохраненную (замороженно-оттаянную) сперму разводят с учетом разбавления, сделанного перед замораживанием, и доводят разведение до 1:10. Если исследованию подвергается сперма, разбавленная 1:10 или более, то к такой сперме, если она не санирована, добавляют только антибиотики в указанной концентрации. Подготовленную сперму замораживают два-три раза при -15...-40 °C и оттаивают при комнатной температуре.

Приготовление культур клеток. Культуру клеток ПЭК или ТБ готовят по методике, изложенной в «Методических указаниях по приготовлению первично-трипсинизированных культур клеток крупного рогатого скота», рекомендованных ГУВ МСХ СССР в 1976 г. Клетки культивируют в среде, состоящей из 0,5% гидролизата лактальбумина в растворе Хенкса, 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков: пенициллина — 100 ЕД/мл, стрептомицина — 100 мкг/мл, микостатина (нистатина) — 20 ЕД/мл. В качестве поддерживающей среды используют 0,5%-ный гидролизат лактальбумина без сыворотки.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение вируса. Для выделения вируса используют 3...4-суточную культуру клеток ПЭК или ТБ. Каждой серией спермы (партией) заражают не менее 4 пробирок или один 100 мл матрац с культурой клеток. Серии спермы от одного быка, полученные в течение трех месяцев, смешивают и исследуют как одну пробу.

Клетки перед инокуляцией материала дважды отмывают раствором Хенкса или питательной средой, после чего в каждую пробирку вносят 0,1...0,2 мл подготовленной спермы. Матрацы заражают по 1,0...2,0 мл. Адсорбируют в течение 30 мин при 37 °C или одного часа при комнатной температуре. Затем инокулят удаляют, а монослой отмывают два раза раствором Хенкса или питательной средой. В пробирки добавляют по 1,0 мл, а в матрацы по 10...12 мл поддерживающей среды и культивируют при 37 °C в течение 5...7 дней.

Для контроля оставляют не менее 5 пробирок с незараженной культурой клеток. Зараженные и контрольные пробирки ежедневно смотрят под микроскопом (об. 8,10 x ок. 7) на наличие цитопатических изменений (ЦПД). Через 5...7 дней проводят второй пассаж исследуемого материала. Для этого культуру инфицированных клеток замораживает при -15...-40 °C и оттаивают при комнатной температуре. Суспензию тщательно перемешивают и вносят по 0,1...0,2 мл в пробирки с монослоем клеток. Через 5...7 дней учитывают результаты заражения и при отсутствии ЦПД проводят третий пассаж. При отсутствии цитопатических изменений в четырех пассажах сперму считают свободной от вируса ИРТ-ИПВ. При наличии цитопатических изменений в первом пассаже для исключения цитотоксического действия спермы проводят второй пассаж. Цитопатический агент второго или последующего пассажей идентифицируют в реакции нейтрализации (РН) или методом флуоресцирующих антител (МФА).

Идентификация вируса в реакции нейтрализации (РН).

Реакцию ставят в культуре клеток ПЭК или ТБ со специфической и отрицательной сыворотками. Сыворотки каждую в отдельности прогревают при 56 °C в течение 30 мин, разводят средой 1:10 и разливают по 1,0 мл в 7 стерильных пробирок. Затем готовят десятикратные разведения вируса на питательной среде в объеме 5 мл, начиная с 10-1 до 10-7 и по 1,0 мл каждого разведения вносят в пробирки с сыворотками, встряхивают и инкубируют в течение часа при температуре 37 °C и используют для заражения культуры клеток. Каждой смесью заражают по 0,2 мл 4 пробирки с культурой клеток. Через 30...40 мин инкубирования в пробирки добавляют по 0,8 мл питательной среды. Параллельно готовят контроль специфической и отрицательной сывороток на токсичность. Для этого сыворотки (каждую в отдельности) в разведении 1:10 смешивают с равным объемом питательной среда и вносят по 0,2 мл в 4 пробирки с культурой клеток. Для контроля культуры клеток 4 пробирки оставляют незараженными. В них ростовая среда меняется на поддерживающую.

Опытные и контрольные пробирки инкубируют в течение 7 сут, проводя микроскопию со 2-го дня. Учет реакции проводят при условии отсутствия цитопатических изменений в контрольных пробирках.

Реакцию учитывают по индексу нейтрализации (ИН). ИН — это отношение титра вируса в смеси с отрицательной сывороткой к титру вируса в смеси со специфической сывороткой. Его рассчитывают по формуле

\text{ИН } = \frac{\text{титр вируса в смеси с отрицательной сывороткой}}{\text{титр вируса в смеси со специфической сывороткой}} .

Титр вируса определяют методом Рида и Менча по формуле

A = \frac{a - 50 \cdot d}{a - b} ,

где A — показатель логарифма дозы, поражающей более 50% пробирок; a — процент эффекта дозы, поражающей более 50% пробирок; b — процент эффекта дозы, поражающей менее 50% пробирок; d — разность показателей логарифмов доз, поражающих менее и более 50% пробирок.

Положительным считают индекс нейтрализации, равный 2 и более десятичным логарифмам (lg 2). Вирус ИРТ-ИПВ считают идентифицированным, если он нейтрализуется специфической сывороткой с положительным индексом.

Идентификация вируса методом флуоресцирующих антител основана на обнаружении вирусного антигена в культуре клеток, обработанных флуоресцирующим иммуноглобулином. Для этого культуру клеток выращивают в пробирках на полосках покровных стекол или слюдинках и заражают вирусом. Через 24 ч инкубации стекла извлекают, дважды промывают фосфатным буфером и подсушивают на воздухе. Затем фиксируют 10...12 мин в ацетоне и после повторного подсушивания препараты хранят при -20 °C или окрашивают флуоресцирующей сывороткой.

Препараты обрабатывают флуоресцирующей сывороткой в рабочем разведении в течение 30 мин во влажной камере (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) при температуре 37 °C, затем двукратно промывают фосфатным буфером pH 7,2...7,4 и споласкивают дистиллированной водой. На высушенный препарат наносят каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и 1 части фосфатного буфера pH 7,2...7,4, покрывают покровным стеклом и просматривают в фиолетово-синем свете при использовании иммерсионного объектива. На ранней стадии инфицирования клеток специфический антиген выявляется в перинуклеарной зоне, а позднее в ядре и в цитоплазме инфицированных клеток. Специфичность флуоресценции контролируют следующим образом: обрабатывают флуоресцирующей сывороткой клетки, незараженные вирусом; окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой инфицированные клетки, предварительно обработанные специфической немаркированной сывороткой.

Положительной считается реакция, при которой отмечают специфическую флуоресценцию в зараженной культуре клеток, при отсутствии флуоресценции в контрольных препаратах.

В случае отрицательных результатов исследования в реакциях нейтрализации и иммунофлуоресценции со специфической и флуоресцирующей сыворотками против вируса ИРТ-ИПВ цитопатический агент исследуют сыворотками против вирусов парагриппа-3, диареи и аденовирусов. Идентификацию изолята проводят методами, изложенными в «Методических указаниях по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота», утвержденных ГУВ МСХ СССР 25.07.1978.

При обнаружении в сперме вируса ИРТ-ИПВ сперму бракуют.

Методические указания подготовлены Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветпрепаратов МСХ СССР.

Зав. лабораторией контроля и стандартизации препаратов, применяемых при искусственном осеменении с/х животных, Н.Г. Балашов;

Зав. лабораторией контроля и стандартизации препаратов против оспенных и респираторных инфекций, доцент В.В. Гуненков;

Ст. научный сотрудник, кандидат биологических наук Н.В. Изотова;

Младший научный сотрудник Г.Э. Фарботко.

---