ПНД Ф 14.2:4.263-2011. Количественный химический анализ вод. Методика измерений массовых концентраций глифосата (раундапа) и его основного метаболита (аминометилфосфоновой кислоты) в питьевых и природных водах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. ФБУ «ФЦАО» 17.10.2011)

17 октября 2011 года

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОД

МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ГЛИФОСАТА (РАУНДАПА) И ЕГО ОСНОВНОГО МЕТАБОЛИТА (АМИНОМЕТИЛФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ) В ПИТЬЕВЫХ И ПРИРОДНЫХ ВОДАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Методика допущена для целей государственного экологического контроля.

Настоящий документ устанавливает методику измерений массовых концентраций глифосата (раундапа) и его основного метаболита аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) в питьевых и природных водах в диапазоне от 0,01 до 0,1 мг/куб. дм.

Продолжительность анализа одной пробы не менее 7 часов.

Блок-схема анализа приведена в Приложении 1.

1. ПРИПИСАННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ

Настоящая методика обеспечивает получение результатов анализа с погрешностями, не превышающими значений, приведенных в таблице 1.

Таблица 1

ПРАВИЛЬНОСТИ, ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ МЕТОДИКИ

<1> Соответствует относительной расширенной неопределенности с коэффициентом охвата k = 2.

2. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ

Измерения выполняют методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием после проведения реакции определяемых веществ с 9-флуоренилметилхлороформиатом.

3. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы:

3.1 Средства измерений

3.1.1. Хроматографическая система, например, Series 200 фирмы «Perkin Elmer» (США) или Agilent 1100 Series фирмы «Agilent Technologies» (США) или любая другая в комплекте:

• Градиентный насос высокого давления на 2 или 4 элюента.
• Флуоресцентный детектор.
• Колонка хроматографическая металлическая с фазой на основе силикагеля с привитыми группами С18 размером 250 x 4,6 мм, зернением 5 мкм, например, Alltima фирмы «Grace» (США).
• Устройство для автоматического отбора и ввода проб (автосэмплер), позволяющее вводить 10 — 30 мм пробы.

Допускается использовать хроматограф любой другой марки, позволяющий проводить хроматографический анализ в условиях, приведенных в п. 8.1, с необходимой чувствительностью.

3.1.2. Весы лабораторные высокого класса точности с максимальной нагрузкой 210 г по ГОСТ Р 53228.

3.1.3. Колбы мерные вместимостью 10, 25, 100, 250, 500 и 1000 куб. см по ГОСТ 1770, класс точности 2.

3.1.4. Микрошприцы вместимостью 0,025, 0,050, 0,10, 0,25 и 1,0 куб. см, например, фирмы «Hamilton».

3.1.5 Пипетки вместимостью 1, 2 и 5 куб. см по ГОСТ 29227.

3.1.6. Стандартный образец глифосата (ГСО) с содержанием основного вещества не менее 98%.

3.1.7. Аминометилфосфоновая кислота (АМФК) — вещество гарантированной чистоты с содержанием основного вещества не менее 98%, например, фирмы «Dr.Ehrenstorfer» или любой другой.

3.1.8. pH-метр с магнитной мешалкой, например, pH 673М.

3.2 Вспомогательные устройства

3.2.1. Бидистиллятор стеклянный по ТУ 25-11.1592 или установка для получения деионизированной воды 2 степени чистоты по ГОСТ Р 52501.

3.2.2 Вакуумный дегазатор для дегазирования элюентов.

3.2.3. Компьютер персональный, позволяющий работать с программным обеспечением, например, с программой «Totalchrom», версия 6.3, для сбора информации и обработки хроматограмм.

3.2.4 Принтер любой модели.

3.2.5. Пробирка стеклянная с притертой пробкой вместимостью 5 куб. см по ГОСТ 1770 или по ГОСТ 25336.

3.2.6. Стакан вместимостью 1000 куб. см по ГОСТ 25336.

3.2.7. Термостатируемое отделение для колонки, обеспечивающее температуру 35 — 40 °C.

3.2.8 Фильтрационная установка, например, фирмы «Millipore».

3.2.9. Флаконы, герметично закрывающиеся с завинчивающимися крышками вместимостью 1,5 — 2 куб. см, снабженные прокладками с тефлоновым покрытием.

3.2.10. Форколонка с картриджем размером 15 x 3,2 мм с сорбентом на основе силикагеля с привитыми группами С18, зернением 7 мкм, например, фирмы «Perkin Elmer».

3.2.11. Холодильник двухкамерный бытовой, обеспечивающий температуру холодильной камеры (2 — 10) °C и морозильной камеры минус (12 — 24) °C.

3.2.12 Шкаф сушильный, например, СНОЛ, ТУ 16-681.032.

Допускается использовать средства измерений и вспомогательные устройства с метрологическими и техническими характеристиками не хуже, чем у выше указанных.

3.3 Материалы и реактивы

3.3.1. Ацетонитрил для градиентной хроматографии, например, фирмы «Merck» или «ACROS».

3.3.2. Бумага индикаторная для определения pH в диапазоне 5 — 10 ед. pH с шагом 0,5 ед. pH.

3.3.3. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или деионизированная по ГОСТ Р 52501 2 степени чистоты.

3.3.4. Диэтиловый эфир стабилизированный медицинский по ТУ 2600-001-45682126, или х.ч. по ГОСТ 6265.

3.3.5 Калия гидроокись (гидроксид калия), ч.д.а., по ГОСТ 24363.

3.3.6. Калий фосфорнокислый 1-замещенный, х.ч., по ГОСТ 4198.

3.3.7 Кислота щавелевая, х.ч., по ГОСТ 22180.

3.3.8. Натрий серноватистокислый (натрия тиосульфат), ч.д.а., по ГОСТ 27086.

3.3.9. Натрий тетраборнокислый 10-водный (тетраборат натрия), х.ч., по ГОСТ 4199.

3.3.10 Фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

3.3.11. 9-флуоренилметилхлороформиат с содержанием основного вещества не менее 97%, например, фирмы «ACROS».

Допускается использовать реактивы более высокой квалификации, в том числе импортных.

4. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ, ОХРАНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

4.1. При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

4.2. При работе с оборудованием необходимо соблюдать правила электробезопасности по ГОСТ Р 12.1.019.

4.3. Обучение работающих безопасности труда должно быть организовано в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

4.4. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

5. ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРА

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих квалификацию инженера или техника-химика, владеющих методом хроматографического анализа, знающих конструкцию, принцип действия и правила эксплуатации данного оборудования.

К выполнению работ по пробоподготовке допускают лиц, имеющих квалификацию техника-химика или лаборанта-химика, обученных методике подготовки пробы для хроматографического анализа.

6. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ

7. ОТБОР И ХРАНЕНИЕ ПРОБ ВОДЫ

7.1. Отбор проб воды осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 51592 и ГОСТ Р 51593 в стеклянные герметично закупоривающиеся флаконы. Флаконы заполняют пробой воды до пробки. Объем отбираемой пробы должен быть не менее 0,025 куб. дм.

7.2. Отобранную пробу анализируют в течение суток, если такой возможности нет, то пробу хранят в холодильнике при температуре 2 — 10 °C не более 3-х суток. Пробу питьевой воды, содержащую остаточный хлор, консервируют на месте отбора, добавляя тиосульфат натрия из расчета 80 — 100 мг на 1 куб. дм пробы.

7.3 При отборе проб составляется сопроводительный документ по утвержденной форме, в котором указывается:

• определяемый показатель;
• шифр пробы;
• должность, фамилия отбирающего пробу.

8. ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ

8.1 Подготовка аппаратуры

Подготовку хроматографической системы и компьютера к работе проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации. На компьютере в программе управления создают метод анализа с использованием абсолютной градуировки согласно руководству по эксплуатации программного обеспечения. В качестве элюентов используют элюент A и элюент B, которые представляют собой соответственно фосфатный буфер и ацетонитрил.

Для удаления растворенных газов применяют вакуумный дегазатор.

Ввод пробы в колонку осуществляют с помощью автосэмплера.

Хроматографическую систему включают в соответствии с инструкцией по эксплуатации и выводят на режим при следующих условиях.

Параметры работы флуоресцентного детектора:

8.2 Приготовление градуировочных растворов

Основной градуировочный раствор глифосата с массовой концентрацией 1 мг/куб. см в воде готовят весовым способом. Для этого 10 мг глифосата помещают в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Основной градуировочный раствор глифосата хранят не более 1 недели в холодильнике при температуре 2 — 10 °C в герметично закрытой мерной колбе. Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре не менее 20 минут.

Основной градуировочный раствор АМФК с массовой концентрацией 1 мг/куб. см в воде готовят весовым способом. Для этого 10 мг АМФК помещают в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Основной градуировочный раствор АМФК хранят не более 1 недели в холодильнике при температуре 2 — 10 °C в герметично закрытой мерной колбе. Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре не менее 20 минут.

Промежуточный градуировочный раствор глифосата и АМФК с массовой концентрацией 0,01 мг/куб. см готовят путем разбавления основных растворов. Для этого 0,10 куб. см основного градуировочного раствора глифосата и 0,10 куб. см основного градуировочного раствора АМФК помещают в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Градуировку хроматографа проводят по шести градуировочным растворам:

C ,  C ,  C ,  C ,  C   и  C .  В  качестве  C   используют холостую пробу,

 0    1    2    3    4      5                 0

представляющую собой дистиллированную воду (см. п. 3.3.3).

    Градуировочные  растворы  глифосата и  АМФК C , C , C , C  и C  готовят

                                                 1   2   3   4    5

непосредственно  перед  использованием.  Для  этого  необходимое количество

промежуточного  градуировочного  раствора  (см.  табл. 3) помещают в мерную

колбу   вместимостью   25  куб.  см  и  доводят  объем  раствора  до  метки

Примечание: Допускается в качестве градуировочных растворов использовать растворы с другой массовой концентрацией с корректировкой схемы приготовления градуировочных растворов.

8.3 Установление градуировочной характеристики

Компьютер устанавливают в режим измерения факторов отклика по методу абсолютной градуировки.

Градуировку хроматографа проводят в условиях выполнения измерений. При этом для каждого градуировочного раствора (см. табл. 3) и холостой пробы (в качестве холостой пробы используется дистиллированная вода, см. п. 3.3.3) проводят пробоподготовку (см п. 9.3). Полученные градировочные растворы хроматографируют в тот же день, если такой возможности нет, то градуировочные растворы хранят в герметично закрытой посуде в холодильнике при температуре 2 — 10 °C не более трех суток. Растворы, хранившиеся в холодильнике, перед анализом выдерживают при комнатной температуре не менее 20 минут.

    Каждый   градуировочный   раствор  (C  - C ),  подвергшийся   процедуре
                                         0    5

пробоподготовки, хроматографируют дважды при условиях, указанных в п. 8.1, рассчитывая среднее значение площади пика определяемого соединения (S ) для i

каждого  из  растворов.  Затем  с  помощью  программного модуля градуировки
управляющей  программы для каждого соединения строят градуировочный график,

описываемый уравнением:

                            S  = A  * C  + b ,
                             i    i    i    i

где:
A  - относительный градуировочный коэффициент;
 i
C  -  массовая  концентрация  определяемого соединения в градуировочном
 i

растворе;

    b  - площадь пика определяемого соединения в холостой пробе (C ).
     i                                                            0

Установление градуировочных характеристик проводят не реже одного раза в 6 месяцев, при смене хроматографической колонки или после ремонта оборудования, повлекшего за собой изменение условий хроматографирования.

Проверку стабильности градуировочных характеристик проводят для каждой серии проб по результатам анализа одного из градуировочных растворов. Градуировочную характеристику считают стабильной в случае, если измеренное значение массовой концентрации отличается от аттестованного значения не более чем на 25%, а время удерживания глифосата и АМФК в градуировочном растворе отклоняется от установленного при градуировке времени удерживания не более чем на 0,2 мин.

Глифосат и АМФК идентифицируют по абсолютным временам удерживания.

Пример типичной хроматограммы глифосата и АМФК представлен в Приложении 2.

9. ВЫПОЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ

При измерении массовых концентраций глифосата и АМФК выполняют следующие операции.

9.1 Подготовка реактивов

9.1.1. Приготовление раствора щавелевой кислоты с молярной концентрацией 1,11 моль/куб. дм. В мерную колбу вместимостью 500 куб. см, содержащую 300 — 400 куб. см дистиллированной воды, помещают (50,00 +/- 0,05) г щавелевой кислоты, перемешивают. Затем доводят объем раствора до 500 куб. см дистиллированной водой. Раствор хранят не более 3 месяцев в холодильнике при температуре 2 — 10 °C.

9.1.2. Приготовление раствора гидроксида калия с молярной концентрацией 3 моль/куб. дм. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см, содержащую 50 — 70 куб. см дистиллированной воды, помещают (16,80 +/- 0,05) г гидроксида калия, перемешивают. Затем доводят объем раствора до 100 куб. см дистиллированной водой. Раствор хранят не более 3 месяцев при комнатной температуре.

9.1.3 Приготовление боратного буфера — раствора тетрабората натрия

Na B O  x 10H O  с молярной концентрацией 0,05 моль/куб. дм. В мерную колбу
  2 4 7      2
вместимостью  250  куб.  см,  содержащую 100 - 150 куб. см дистиллированной
воды,  помещают  (4,80  +/- 0,05) г тетрабората натрия, перемешивают. Затем
доводят  объем  раствора  до  250  куб.  см дистиллированной водой. Раствор

хранят не более 3 месяцев в холодильнике при температуре 2 — 10 °C.

9.1.4 Приготовление фосфатного буфера с молярной концентрацией 0,002

моль/куб. дм и pH 7,0. В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, содержащую 200 — 400 куб. см дистиллированной воды, помещают (0,270 +/- 0,001) г калия

фосфорнокислого   1-замещенного  (KH PO ),  перемешивают  и  доводят  объем
                                    2  4

раствора до метки дистиллированной водой. Далее содержимое колбы переливают

в  стакан  (вместимостью 1000 куб. см), кладут в стакан магнитную мешалку и
при  перемешивании  проводят  измерения  pH.  Добавляя  в  стакан по каплям
гидроксид  калия с молярной концентрацией 3 моль/куб. дм, доводят pH буфера
до  7,00 с точностью до 0,02 единицы pH. Раствор хранят не более 1 месяца в
холодильнике  при  температуре  2 - 10 °C.  Перед  использованием фосфатный

9.1.5. Приготовление раствора дериватизирующего агента — раствора 9-флуоренилметилхлороформиата в ацетонитриле с массовой концентрацией 1 мг/куб. см. Основной раствор 9-флуоренилметилхлороформиата в ацетонитриле с массовой концентрацией 1 мг/куб. см готовят весовым способом. Для этого (10,0 +/- 0,2) мг 9-флуоренилметилхлороформиата помещают в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем раствора до метки ацетонитрилом.

Основной раствор 9-флуоренилметилхлороформиата хранят не более 2 недель в морозильной камере при температуре минус (12 — 24) °C в герметично закрытой мерной колбе.

9.2 Подготовка аппаратуры

Хроматографическую систему выводят на режим в соответствии с условиями, указанными в п. 8.1. На компьютере в программе управления активизируют метод измерения.

9.3 Подготовка пробы

Отмеряют пипеткой 3,0 куб. см пробы воды и помещают в пробирку вместимостью 5 куб. см. В пробирку добавляют микрошприцем 60 куб. мм раствора щавелевой кислоты (п. 9.1.1) и выдерживают 1 час.

Затем добавляют микрошприцем 40 куб. мм раствора гидроксида калия (п. 9.1.2) и контролируют значение pH (по индикаторной бумаге). Если значение pH выходит за пределы диапазона 6 — 7 ед. pH, то по каплям добавляют раствор щавелевой кислоты или раствор гидроксида калия. После установления необходимого значения pH пробу выдерживают 3 минуты.

Затем пипеткой добавляют 1 куб. см боратного буфера (п. 9.1.3) и контролируют значение pH (по индикаторной бумаге). Если значение pH менее 9 ед. pH, то по каплям добавляют боратный буфер. После достижения необходимого значения pH пробу выдерживают 15 минут.

Затем пипеткой добавляют 3 куб. см диэтилового эфира (п. 3.3.4), пробирку встряхивают в течение 3 минут и оставляют в покое на 15 минут для разделения слоев.

После этого пипеткой отбирают 1,5 куб. см водной фазы и перемещают в другую пробирку. В эту пробирку микрошприцем добавляют 250 куб. мм ацетонитрила, 250 куб. мм раствора дериватизирующего агента (п. 9.1.5) и оставляют в покое на 1 час.

Затем в пробирку пипеткой добавляют 2 куб. см диэтилового эфира, встряхивают в течение 3 минут и оставляют на час.

После этого из пробирки пипеткой отбирают 0,5 — 1 куб. см водной фазы и помещают в герметично закрывающийся флакон вместимостью 2 куб. см.

9.4 Проведение измерений

Полученные растворы хроматографируют в тот же день. В случае невозможности немедленного проведения анализа полученные растворы хранят в герметично закрытой посуде в холодильнике при температуре 2 — 10 °C не более трех суток. Растворы, хранившиеся в холодильнике, перед анализом выдерживают при комнатной температуре не менее 20 минут.

Глифосат и АМФК идентифицируют по абсолютным временам удерживания в соответствии с градуировкой (см. п. 8.3). В случае, когда массовая концентрация определяемого вещества в пробе выше, чем максимальная массовая концентрация градуировочного раствора, то исходную пробу следует разбавить дистиллированной водой, подвергнуть процедуре пробоподготовки по п. 9.3 и провести измерение массовой концентрации разбавленной пробы. При вычислении результатов измерений необходимо учесть степень разбавления.

10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

Обработку результатов измерений массовых концентраций глифосата или АМФК выполняют с помощью управляющей программы компьютера в соответствии с градуировочной характеристикой по формуле:

                            (S  - b )

                                  i    i

                           X  = ---------, мг/куб. дм,

                        i      A
                                i

где:

X  - содержание определяемого соединения в пробе, мг/куб. дм;
 i
S  - площадь пика  определяемого соединения  в анализируемом экстракте,
 i

мВ * с; A — относительный градуировочный коэффициент, мВ * с * куб. дм/мг (см. i п. 8.3); b — площадь пика определяемого соединения в холостой пробе, мВ * с. i

11. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

11.1 Результаты измерений представляют в виде:

X \pm \Delta,\text{мг}/\text{куб}.\text{дм},P = 0,95,

где:

X — результат анализа, мг/куб. дм;

\Delta — значение показателя точности, \Delta = \delta*0,01*\text{Х} , мг/куб. дм;

\delta — значение показателя точности, % (см. табл. 1).

11.2 Результаты измерений округляют с точностью до:

при концентрации от 0,01 мг/куб. дм до 0,1 мг/куб. дм     0,001 мг/куб. дм;
                 свыше 0,1 мг/куб. дм до 1 мг/куб. дм     0,01 мг/куб. дм;
                 свыше 1 мг/куб. дм                       0,1 мг/куб. дм.

12. ОЦЕНКА ПРИЕМЛЕМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

    12.1. При  получении  двух  результатов  измерений  (X , X ) в условиях
                                                          1   2

повторяемости (сходимости) осуществляют проверку приемлемости результатов в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725 (часть 6, раздел 5.2).

Результат измерений считают приемлемым при выполнении условия:

                                |X  - X |
                                  1    2

200 --------- <= r.

                                 X  + X
                                  1    2

Значения r приведены в таблице 4.

12.2 При получении результатов измерений в двух лабораториях (X ,

                                                                  лаб1

X ) проводят проверку приемлемости результатов измерений в соответствии лаб2

Результат измерений считают приемлемым при выполнении условия:

                         |X     - X    |

                           лаб1    лаб2

                              X     + X

                               лаб1    лаб2

13. КОНТРОЛЬ ТОЧНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

13.1 Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории предусматривает:

Контроль стабильности результатов измерений путем контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости, среднеквадратического отклонения промежуточной прецизионности и погрешности в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 5725, часть 6 (образец для контроля, приготовленный с использованием ГСО или вещества гарантированной чистоты и дистиллированной воды).

Оперативный контроль процедуры измерения путем оценки погрешности (при необходимости), например, с использованием образцов для контроля (см. п. 13.2).

13.2 Оперативный контроль процедуры измерений с применением образцов для контроля

В качестве образцов для контроля используют водные растворы, приготовленные с использованием ГСО или вещества гарантированной чистоты.

Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры Кк с нормативом контроля К.

Кк = |X — C|,

X — результат анализа, (мг/куб. дм);

C — аттестованное значение определяемого компонента в образце для контроля (мг/куб. дм).

K = \Delta_{\text{л}},

где \Delta_{\text{л}} — характеристика погрешности результатов анализа, установленная в лаборатории при реализации методики.

Примечание: На первом этапе проведения контроля после внедрения методики допускается считать \Delta_{\text{л}} = 0,84\Delta , где \Delta — приписанная характеристика погрешности методики, которую рассчитывают по формуле:

\Delta = 0,01 \times C \times \delta.

Значения \delta приведены в таблице 1.

При невыполнении условия контроль повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам.

Приложение 1

БЛОК-СХЕМА ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА

Приложение 2

<*> Массовая концентрация глифосата и АМФК составляла 0,040 мг/куб. дм. Раствор приготовлен на деионизированной воде.