МУК 4.1.3876-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов в экскретах (моче и кале) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
Актуально на 02.11.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.3876-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов в экскретах (моче и кале) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания". МУК 4.1.3876-23. https://bukva.ai/docs/metodika-muk-4-1-3876-23
(утв. Роспотребнадзором 26.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 26.09.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 26 июня 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕНЗ(А)ПИРЕНА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В ЭКСКРЕТАХ (МОЧЕ И КАЛЕ) МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3876-23
Дата введения 26 сентября 2023 года
1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (В.Б. Гурвич, Э.Г. Плотко, Т.Н. Штин, Т.А. Береснева).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 июня 2023 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим и диодноматричным детекторами для определения массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов в экскретах (моче и кале) в диапазонах измерений:
- бенз(а)пирен: от 0,12 до 12,00 мкг/100 см3;
- 3-гидроксибенз(а)пирен: от 0,15 до 15,00 мкг/100 см3;
- бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол: от 0,15 до 15,00 мкг/100 см3;
- бенз(а)пирен: от 11,50 до 1200,0 мкг/100 см3;
- 3-гидроксибенз(а)пирен: от 15,00 до 15 000,0 мкг/100 см3;
- бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол: от 15,00 до 15 000,0 мкг/100 см3;
- в кале
- бенз(а)пирен: от 0,70 до 70,00 мкг/100 г;
- 3-гидроксибенз(а)пирен: от 1,00 до 100,00 мкг/100 г;
- бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол: от 1,00 до 100,00 мкг/100 г;
- бенз(а)пирен: от 70,00 до 7000,0 мкг/100 г;
- 3-гидроксибенз(а)пирен: от 100,00 до 10 000,0 мкг/100 г;
- бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол: от 100,00 до 10 000,0 мкг/100 г.
1.2. Метод основан на разрушении стенок клеток экскретов щелочным гидролизом анализируемых проб, жидкость-жидкостной экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов из обработанных проб экскретов хлористым метиленом, концентрировании экстрактов по технологии упаривания в вихревом потоке газа и анализе экстракта на жидкостном хроматографе с использованием флуориметрического и диодноматричного детекторов.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. ПОКАЗАТЕЛИ ТОЧНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ
2.1. Метод измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностями, не превышающими значений, приведенных в таблицах 1 и 2.
Диапазоны измерений массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов в моче, значения показателей внутрилабораторной прецизионности, правильности и точности измерений при доверительной вероятности P = 0,95
Диапазоны измерений массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов в кале, значения показателей внутрилабораторной прецизионности, правильности и точности измерений при доверительной вероятности P = 0,95
III. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
3.1. При выполнении измерений применяют средства измерений, стандартные образцы, вспомогательные устройства, реактивы, материалы (таблица 3).
Средства измерений, стандартные образцы, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
| Наименование средств измерений, стандартных образцов, вспомогательных устройств, реактивов и материалов | Обозначение и наименование документов, в соответствии с которыми выпускают СИ, стандартные образцы, вспомогательные устройства, реактивы и материалы | Метрологические, технические характеристики. Качество реактивов |
| 1 | 2 | 3 |
| Средства измерений | ||
| Весы высокого (II) класса точности | ГОСТ Р 53228 | Наибольший предел взвешивания 220 г; дискретность 0,1 мг |
| Система высокоэффективная жидкостная хроматографическая с флуориметрическим и диодноматричным детектированием, состоящая из градиентного насоса, термостата хроматографической колонки и автосемплера | Выпускается в соответствии с технической документацией фирмы-изготовителя | - |
| Прибор для измерения постоянного и переменного напряжения, постоянной силы тока, сопротивления | Выпускается в соответствии с технической документацией фирмы-изготовителя | - |
| Пипетки одноканальные переменного объема 10 — 100 мм3; 40 — 200 мм3; 200 — 1000 мм3; 1 — 5 см3 | - | Допустимая относительная погрешность дозирования по гексану не более +/- 2% |
| Пипетки градуированные исполнения 1-1-2-5 | ГОСТ 29227 | Вместимость 5 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,05\text{см}^{3} |
| Пипетки градуированные исполнения 1-1-2-10 | ГОСТ 29227 | Вместимость 10 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,10\text{см}^{3} |
| Пипетки с одной отметкой исполнения 2-2-1 | ГОСТ 29169 | Вместимость 1 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,015\text{см}^{3} |
| Пипетки с одной отметкой исполнения 2-2-5 | ГОСТ 29169 | Вместимость 5 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,03\text{см}^{3} |
| Колбы мерные 2-10-2 | ГОСТ 1770 | Вместимость 10 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,05\text{см}^{3} |
| Колбы мерные 2-50-2 | ГОСТ 1770 | Вместимость 50 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,12\text{см}^{3} |
| Колбы мерные 2-100-2 | ГОСТ 1770 | Вместимость 100 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,20\text{см}^{3} |
| Колбы мерные 2-200-2 | ГОСТ 1770 | Вместимость 200 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,30\text{см}^{3} |
| Колбы мерные 2-1000-2 | ГОСТ 1770 | Вместимость 1000 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 0,80\text{см}^{3} |
| Цилиндр 1-250-2 | ГОСТ 1770 | Вместимость 250 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 2,0\text{см}^{3} |
| Цилиндр 1-500-2 | ГОСТ 1770 | Вместимость 250 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 5,0\text{см}^{3} |
| Цилиндр 1-1000-2 | ГОСТ 1770 | Вместимость 250 см3. Предел допускаемой погрешности вместимости: \Delta = \pm 10,0\text{см}^{3} |
| Стандартные образцы | ||
| Государственный стандартный образец (далее — ГСО) состава раствора бенз(а)пирена в гексане | ГСО 7515 | Аттестованное значение 100 мкг/см3. Предел допускаемой относительной погрешности (при P = 0,95): +/- 2,0% |
| Реактивы | ||
| Бенз(а)пирен | CAS № 50-32-8 | Содержание основного вещества не менее 98% |
| 3-гидроксибенз(а)пирен | CAS № 13345-21-6 | Содержание основного вещества не менее 95% |
| Бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол | CAS № 57404-88-3 | Содержание основного вещества не менее 98% |
| Метилен хлористый для спектроскопии | СТП ТУ СОМР 3-102-09 | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Этилацетат | ГОСТ 8981 | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Ацетон | ГОСТ 2768 | Содержание основного вещества не менее 99,75% |
| Метанол | ГОСТ 2222-95 | Марки А или Б |
| Калия гидроокись | ГОСТ 24363 | х.ч., массовая доля гидроокиси калия (KOH) не менее 86% |
| Этанол для хроматографии (этиловый спирт) | ТУ 6-09-1710 | х.ч. |
| Ацетонитрил | ТУ 2634-002-04715285 | о.с.ч. |
| н-Гексан | ТУ 2631-001-54260861 | о.с.ч. |
| Диметилсульфоксид | ТУ 6-09-3818-89 | х.ч. |
| Натрий хлористый | ГОСТ 4233 | х.ч. |
| Вода для лабораторного анализа | ГОСТ Р 52501 | - |
| Калий хлористый | ГОСТ 4568 | 1 сорт |
| Кальций хлористый | ГОСТ 450 | высший сорт |
| Азотная кислота | ГОСТ 4461 | х.ч. |
| Вспомогательные устройства, материалы | ||
| Сушильный шкаф | Выпускается в соответствии с технической документацией фирмы-изготовителя | Рабочий диапазон температур от 50 °C до 200 °C |
| Стакан В-1-100 ТС | ГОСТ 25336 | Вместимость 100 см3 |
| Стакан В-1-1000 ТС | ГОСТ 25336 | Вместимость 1000 см3 |
| Пластиковая лабораторная посуда | - | - |
| Колонка хроматографическая обращенно-фазная | - | Колонка заполнена силикагелем с привитым октадицилом длиной 150 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм |
| Предколонка хроматографическая обращенно-фазная | - | Предколонка заполнена силикагелем с привитым октадицилом длиной 12,5 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм |
| Контейнер для анализов | - | - |
| Стеклянная виала с крышкой | - | Вместимость 2 см3 |
| Фильтры мембранные | - | Размер пор не более 0,45 мкм |
| Воронка | ГОСТ 25336 | - |
| Стаканчик для взвешивания СВ-14/8 | ГОСТ 25336 | - |
| Груша резиновая (спринцовка) № 1 | - | - |
| Шприц инъекционный однократного применения стерильный «Луер» | ГОСТ ISO 7886-1-2011 | Вместимость 1 см3, 50 см3 |
| Запорный кран для шприца инъекционного | - | - |
| Баня-термостат | - | - |
| Микрошприц МШ-10 | - | Вместимость 10 мкл <1> |
| Микрошприц МШ-50 | - | Вместимость 50 мкл |
| Микрошприц МШ-100 | - | Вместимость 100 мкл |
| Устройство для очистки воды | - | - |
| Плитка электрическая | - | - |
| Ультразвуковая баня | - | Рабочая частота не менее 20 Гц, объем не менее 1 дм3 |
| Камера лабораторная морозильная с цифровым контроллером температуры | - | Рабочий диапазон температур от минус 18 °C до минус 24 °C |
| Измельчитель — гомогенизатор лабораторный | - | - |
| Метаболическая клетка для мелких животных для сбора экскретов | - | - |
| Примечания. Допускается использование средств измерений (далее — СИ) утвержденных типов с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками. Допускается использование стандартных образцов утвержденных типов с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками. Допускается использование испытательного оборудования (далее — ИО) с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками. Допускается применение вспомогательного оборудования, отличного от указанного, с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. Допускается применение реактивов с характеристиками не хуже указанных. Метрологическое обеспечение СИ и ИО (поверку СИ и аттестации ИО) осуществляют аккредитованные организации на данный вид деятельности. | ||
<1> 10 мкл = 10 мм3 = 0,01 см3.
IV. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
4.1. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004, а также соблюдаться требования по электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019.
4.2. Общие санитарно-гигиенические положения к воздуху рабочей зоны определены в ГОСТ 12.1.005.
4.3. К выполнению измерений допускаются специалисты, имеющие высшие или средне-специальное образование, прошедшие специальную подготовку по выполнению химических и аналитических работ, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод в процессе стажировки.
V. УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
5.1 При выполнении измерений в лаборатории соблюдаются следующие условия:
- температура окружающего воздуха, °C плюс (20 +/- 5);
- атмосферное давление, кПа (мм рт. ст.) 84,0 — 106,7 (630 — 800);
- относительная влажность воздуха, %, не более 80.
5.2 Электропитание при выполнении измерений в лаборатории и проведении отбора проб:
VI. ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ
6.1. Чистота воды. При выполнении измерений используют воду для лабораторного анализа 1 степени чистоты по ГОСТ Р 52501.
6.2 Подготовка посуды.
Мойку и сушку посуды следует проводить в помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией.
Всю используемую для хранения и измерений проб посуду промывают азотной кислотой, разбавленной водой для лабораторного анализа 1 степени чистоты в соотношении 1:1 (п. 6.3.1), затем большим количеством водопроводной воды и в заключении ополаскивают три-четыре раза водой для лабораторного анализа 1 степени чистоты, с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).
Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую ванну. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от плюс 105 °C до плюс 110 °C.
6.3 Приготовление растворов реактивов.
6.3.1 Раствор азотной кислоты с объемной долей 1:1.
Раствор азотной кислоты готовят разбавлением концентрированной кислоты. Для приготовления 1000 см3 раствора берут 500 см3 концентрированной азотной кислоты (удельный вес 1,51 г/см3), отмеренной цилиндром. Отмеренный объем кислоты осторожно при перемешивании вливают в 500 см3 воды для лабораторного анализа 1 степени чистоты в термостойком стакане вместимостью 1000 см3 при охлаждении. Тщательно перемешивают.
Раствор хранят до изменения внешнего вида (изменение цвета, включая мутность, образование хлопьев, осадка).
6.3.2 Изотонический раствор Рингера.
Помещают 7,5 г хлорида натрия, 0,37 г хлорида калия, 0,17 г хлорида кальция в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют примерно в 400 см3 воды для лабораторного анализа 1 степени чистоты. После растворения солей доводят до 1000 см3 водой для лабораторного анализа 1 степени чистоты.
Раствор хранят при комнатной температуре 1 месяц.
6.3.3 Спиртовой раствор гидроксида калия, 0,73 моль/дм3.
В стакан вместимостью 100 см3 помещают 8,20 г гидроксида калия, растворяют примерно в 30 см3 воды для лабораторного анализа 1 степени чистоты при нагревании на электроплитке. Раствор охлаждают до комнатной температуры и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 см3. Объем доводят до метки этиловым спиртом.
Раствор хранят до изменения внешнего вида в пластиковой посуде.
6.3.4. Элюент для хроматографии (водный раствор ацетонитрила с объемной долей 4:1).
Для приготовления 1000 см3 раствора берут 800 см3 ацетонитрила, отмеренного цилиндром. Отмеренный объем ацетонитрила при перемешивании вливают в 200 см3 воды для лабораторного анализа 1 степени чистоты в стакане вместимостью 1000 см3 при охлаждении. Тщательно перемешивают.
Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.
6.3.5. Основной градуировочный раствор бенз(а)пирена с массовой концентрацией 100 мкг/см3 (раствор № 1).
Для приготовления градуировочного раствора на аналитических весах взвешивают 10,0 мг <2> чистого вещества и переносят количественно н-гексаном в мерную колбу вместимостью 100 см3. Доводят полученный раствор н-гексаном до метки.
<2> Масса навески для чистого вещества бенз(а)пирена с содержанием основного вещества 98% составляет 10,2 мг соответственно.
Концентрация бенз(а)пирена в полученном градуировочном растворе № 1 — (100,0 +/- 2,3) мкг/см3.
Раствор хранят в посуде из стекла в течение 3 месяцев при температуре от плюс 2 °C до плюс 10 °C.
6.3.6. Рабочий градуировочный раствор бенз(а)пирена с массовой концентрацией 10 мкг/см3 (раствор № 2).
6.3.6.1. Рабочий градуировочный раствор (N 2) готовят из соответствующего ГСО раствора бенз(а)пирена в соответствии с рекомендацией в инструкции по применению.
Вскрывают ампулу ГСО, содержащего 100 мкг/см3 бенз(а)пирена. Осторожно пипеткой переносят 5,00 см3 ГСО в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки н-гексаном и перемешивают.
Полученный рабочий градуировочный раствор № 2 содержит (10,0 +/- 0,2) мкг/см3 бенз(а)пирена.
Раствор хранят в посуде из стекла в течение 2 месяцев при температуре от плюс 2 °C до плюс 10 °C.
6.3.6.2. Рабочий градуировочный раствор (N 2) готовят соответствующим разбавлением основного градуировочного раствора (N 1).
5,00 см3 раствора № 1 с помощью пипетки переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки н-гексаном и перемешивают.
Полученный рабочий градуировочный раствор № 2 содержит (10,0 +/- 0,2) мкг/см3 бенз(а)пирена.
Раствор хранят в посуде из стекла в течение 2 месяцев при температуре от плюс 2 °C до плюс 10 °C.
6.3.7. Основной градуировочный раствор 3-гидроксибенз(а)пирена с массовой концентрацией 100 мкг/см3 (раствор № 3).
Для приготовления градуировочного раствора на аналитических весах взвешивают 10,0 мг <3> чистого вещества и переносят количественно метанолом или диметилсульфоксидом (далее — ДМСО) в мерную колбу вместимостью 100 см3. Доводят полученный раствор метанолом или ДМСО до метки.
<3> Масса навески для чистого вещества 3-гидроксибенз(а)пирена с содержанием основного вещества 95% составляет 10,5 мг соответственно.
Концентрация 3-гидроксибенз(а)пирена в полученном градуировочном растворе № 3 — (100,0 +/- 5,3) мкг/см3.
Приготовленный раствор хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °C в течение 3 месяцев. Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
6.3.8. Рабочий градуировочный раствор 3-гидроксибенз(а)пирена с массовой концентрацией 10 мкг/см3 (раствор № 4).
1,00 см3 раствора № 3 с помощью пипетки переносят в стаканчики для взвешивания и упаривают в вихревом потоке газа при комнатной температуре.
Содержимое стаканчика для взвешивания количественно н-гексаном переносят в мерную колбу вместимостью 10 см3, доводят до метки н-гексаном и перемешивают. Концентрация 3-гидроксибенз(а)пирена в полученном градуировочном растворе № 4 — (10,0 +/- 0,6) мкг/см3. Приготовленный раствор хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °C в течение 2 месяцев. Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
6.3.9. Основной градуировочный раствор бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с массовой концентрацией 100 мкг/см3 (раствор № 5).
Для приготовления градуировочного раствора на аналитических весах взвешивают 10,0 мг <4> чистого вещества и переносят количественно метанолом или ДМСО в мерную колбу вместимостью 100 см3. Доводят полученный раствор метанолом или ДМСО до метки.
<4> Масса навески для чистого вещества бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с содержанием основного вещества 98% составляет 10,2 мг соответственно.
Концентрация бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола в полученном градуировочном растворе № 5 — (100,0 +/- 2,3) мкг/см3.
Приготовленный раствор хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °C в течение 3 месяцев. Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
6.3.10. Рабочий градуировочный раствор бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с массовой концентрацией 10 мкг/см3 (раствор № 6).
1,00 см3 раствора № 5 с помощью пипетки переносят в стаканчики для взвешивания и упаривают в вихревом потоке газа на воздухе при комнатной температуре.
Содержимое стаканчика для взвешивания количественно н-гексаном переносят мерную колбу вместимостью 10 см3, доводят до метки н-гексаном и перемешивают. Концентрация бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола в полученном градуировочном растворе № 6 — (10,0 +/- 0,3) мкг/см3.
Приготовленный раствор хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °C в течение 2 месяцев. Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
6.4 Подготовка хроматографической колонки к работе.
Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюент со скоростью 1,5 см3/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.
Подготовку хроматографической колонки к работе проводят в соответствии с рекомендациями руководства по эксплуатации ВЭЖХ. Скорость подачи элюента (в данном случае) установлена производителем прибора.
6.5 Установление градуировочных зависимостей.
Градуировочные растворы бенз(а)пирена и его метаболитов, используемые для построения градуировочной характеристики, готовят в соответствии с таблицами 4 - 5.
Приготовление градуировочных растворов бенз(а)пирена и его метаболитов для флуориметрического детектора
Приготовление градуировочных растворов бенз(а)пирена и его метаболитов для диодноматричного детектора
| Номер градуировочного раствора | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Объем государственного стандартного образца (ГСО) состава раствора бенз(а)пирена в гексане, с аттестованным значением СО 100,0 мкг/см3 (или основного градуировочного раствора (N 1) с массовой концентрацией 100,0 мкг/см3), см3 | - | - | - | - | 10 |
| Объем основного градуировочного раствора 3-гидроксибенз(а)пирена с массовой концентрацией 100,0 мкг/см3 (основной градуировочный раствор № 3), см3 | - | - | - | - | 10 <5> |
| Объем основного градуировочного раствора бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с массовой концентрацией 100,0 мкг/см3 (основной градуировочный раствор № 5), см3 | - | - | - | - | 10 <6> |
| Объем рабочего градуировочного раствора бенз(а)пирена с массовой концентрацией 10,0 мкг/см3 (рабочий градуировочный раствор № 2), см3 | - | - | - | 10 | - |
| Объем рабочего градуировочного раствора 3-гидроксибенз(а)пирена с массовой концентрацией 10,0 мкг/см3 (рабочий градуировочный раствор № 4), см3 | - | - | - | 10 | - |
| Объем рабочего градуировочного раствора бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с массовой концентрацией 10,0 мкг/см3 (рабочий градуировочный раствор № 6), см3 | - | - | - | 10 | - |
| Объем градуировочного раствора бенз(а)пирена с массовой концентрацией 10,0 мкг/см3 (градуировочный раствор № 4), см3 | - | - | 5 | - | - |
| Объем градуировочного раствора бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с массовой концентрацией 10,0 мкг/см3 (градуировочный раствор № 4), см3 | - | - | 5 | - | - |
| Объем градуировочного раствора 3-гидроксибенз(а)пирена с массовой концентрацией 10,0 мкг/см3 (градуировочный раствор № 4), см3 | - | - | 5 | - | - |
| Объем градуировочного раствора бенз(а)пирена с массовой концентрацией 5,0 мкг/см3 (градуировочный раствор № 3), см3 | - | 2 | - | - | - |
| Объем градуировочного раствора бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с массовой концентрацией 5,0 мкг/см3 (градуировочный раствор № 3), см3 | - | 2 | - | - | - |
| Объем градуировочного раствора 3-гидроксибенз(а)пирена с массовой концентрацией 5,0 мкг/см3 (градуировочный раствор № 3), см3 | - | 2 | - | - | - |
| Концентрация бенз(а)пирена и его метаболитов в градуировочном растворе, мкг/см3 | - | 1,0 | 5,0 | 10,0 | 100,0 |
<5> Во избежание нарушения равновесия жидкость — жидкость (плотность метанола: \rho^{20} = 0,7925\text{г}/\text{см}^{3} , плотность гексана: \rho^{20} = 0,6594\text{г}/\text{см}^{3} , плотность ДМСО: \rho^{20} = 1,1000\text{г}/\text{см}^{3} ) 10,00 см3 основного градуировочного раствора № 3 (N 5) с помощью пипетки переносят в стаканчик для взвешивания и упаривают в вихревом потоке газа при комнатной температуре. Содержимое стаканчика для взвешивания количественно н-гексаном переносят в мерную колбу вместимостью 10,00 см3, доводят до метки н-гексаном и перемешивают.
Растворы для градуировки готовят в мерных колбах вместимостью 10,00 см3.
После добавления каждого реактива содержимое колб тщательно перемешивают.
Объем раствора в каждой колбе доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.
Растворы готовят в день использования.
Градуировочные характеристики строят при помощи «матричной» градуировки. Для этого проводят обработку «чистых» проб («чистые» пробы выбирают среди проб того же вида биосубстратов — экскреты (моча, кал), проанализированных тем же методом ранее, и не содержащих бенз(а)пирена и его метаболитов) в соответствии с главами VIII, IX. На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в стаканчики для взвешивания с обработанной пробой экскретов добавляют по 1 см3 градуировочных растворов бенз(а)пирена и его метаболитов (таблицы 3 - 4), тщательно перемешивают. Полученные растворы фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм, используя медицинский шприц «Луер», в стеклянную виалу вместимостью 2 см3 и анализируют на жидкостном хроматографе в условиях:
- инжектируемый объем 5 мм3;
- колонка хроматографическая обращенно-фазная, заполненная силикагелем с привитым октадицилом длиной 150 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм;
- режим подачи элюента (80% ацетонитрила и 20% воды) — изократический;
- скорость подачи элюента 1,0 см3/мин;
Инструментальные параметры и программа хроматографирования подобрана экспериментально. Скорость подачи элюента при построении градуировочной зависимости и проведении исследований с использованием рабочих проб составляет 1,0 см3/мин.
- температура термостата колонки 40 °C;
- флуориметрический детектор (таблица 3):
б) для бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола
в) для 3-гидроксибенз(а)пирена
- длина волны возбуждения 260 нм;
- длина волны эмиссии 445 нм;
- диодноматричный детектор (таблица 4):
а) для бенз(а)пирена, бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола, 3-гидроксибенз(а)пирена
Для установления градуировочных зависимостей выполняют измерения аналитического сигнала холостого опыта (градуировочный раствор № 1), представляющего собой «чистую» пробу, выбранную из проб того же вида биосубстрата — экскреты (моча, кал), проанализированную тем же методом ранее, и не содержащую бенз(а)пирен и его метаболиты в соответствии с главами VIII, IX. Далее выполняют измерения градуировочных образцов различных уровней концентраций в порядке их возрастания в соответствии с таблицами 4, 5.
Затем, используя программное обеспечение для сбора и обработки хроматографических данных, устанавливают градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика на хроматограмме (в единицах оптической плотности для диодноматричного детектора и в единицах флуоресценции для флуориметрического детектора) от массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов (мкг/см3).
Построение графиков допускается проводить при помощи программы обработки данных ВЭЖХ или при помощи компьютерной программы (например, электронные таблицы).
Примечание. Если программным обеспечением хроматографа предусмотрен автоматический расчет, при построении градуировочной зависимости руководствуются инструкцией по эксплуатации применяемого средства измерений.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят по п. 12.2.
VII. ОТБОР ПРОБ
7.1 Отбор проб экскретов у человека.
Пробы экскретов отбирают в специальные одноразовые контейнеры для анализов по общепринятым правилам взятия экскретов в соответствии с ГОСТ Р 53079.4.
Оптимальный объем пробы мочи на химическое исследование (1 — 10) см3.
Оптимальная масса пробы кала на химическое исследование (0,2 — 2) г.
Допускается хранение проб экскретов в пластиковой посуде с плотно закрывающейся крышкой в холодильной камере при минус 20 °C в течение 1 — 2 лет. В ходе проведения анализа допускается кратковременное хранение (в течение 1 — 3 дней) в холодильнике при минус 4 °C.
7.2 Отбор проб экскретов у животных.
Пробы экскретов отбирают в утренние часы перед кормлением, обычно при самопроизвольном мочеиспускании и испражнении по общепринятым правилам взятия экскретов у животных.
Собирают экскреты в чистые сосуды с широким «горлом».
Когда невозможно получить мочу самопроизвольно, ее берут из мочевого пузыря путем катетеризации.
Для сбора суточной мочи или за 6 — 12 ч у крупных животных используют мочеприемники.
Для сбора экскретов у мелких животных используют специальные метаболические клетки.
Оптимальный объем пробы мочи на химическое исследование (1 — 10) см3.
Оптимальная масса пробы кала на химическое исследование (0,2 — 2) г.
Допускается хранение проб экскретов в пластиковой посуде с плотно закрывающейся крышкой в холодильной камере при минус 20 °C в течение 1 — 2 лет. В ходе проведения анализа допускается кратковременное хранение (в течение 1 — 3 дней) в холодильнике при минус 4 °C.
VIII. ОБРАБОТКА ПРОБ ЭКСКРЕТОВ
8.1 Обработка проб мочи.
(1 — 10) см3 анализируемой мочи в зависимости от ожидаемого содержания определяемых аналитов в пробе из одноразового контейнера для анализов помещают в одноразовый медицинский шприц типа «Луер» вместимостью 50 см3 с надетым на наконечник шприца запорным краном, прибавляют 5 см3 0,73 моль/дм3 раствора гидроксида калия в этиловом спирте (п. 6.3.3). Раствор тщательно перемешивают, закрывают воронкой и помещают на кипящую водную баню на 40 мин. После окончания процесса щелочного гидролиза медицинский шприц типа «Луер» с анализируемой пробой снимают с водяной бани, охлаждают до комнатной температуры.
Для экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов к содержимому медицинского шприца типа «Луер» добавляют 5 см3 хлористого метилена и интенсивно перемешивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев органический слой экстракта переносят в стаканчик для взвешивания. Для улучшения разделения слоев к анализируемому образцу допускается добавлять несколько капель этилового спирта. Описанную процедуру экстракции повторяют еще дважды, объем хлористого метилена для второй экстракции — 3 см3, для третьей экстракции — 2 см3. Объединенные экстракты упаривают в вихревом потоке газа на воздухе при комнатной температуре.
8.2 Обработка проб кала.
Перед исследованиями пробы кала замораживают при температуре не выше минус 20 °C для разрушения стенок клеток и извлечения из клеток белков, в которые встраивается бенз(а)пирен и его метаболиты.
После заморозки пробы кала выдерживают при комнатной температуре в темном месте не более 1 часа.
(0,2 - 2) г анализируемого кала в зависимости от ожидаемого содержания определяемых аналитов в пробе из одноразового контейнера для анализов помещают в одноразовый медицинский шприц типа «Луер» вместимостью 50 см3 с надетым на наконечник шприца запорным краном, прибавляют 5 см3 изотонического раствора Рингера п. 6.3.2 и 5 см3 0,73 моль/дм3 раствора гидроксида калия в этиловом спирте (п. 6.3.3). Раствор тщательно перемешивают, закрывают воронкой и помещают на кипящую водную баню на 1 час. После окончания процесса щелочного гидролиза медицинский шприц типа «Луер» с анализируемой пробой снимают с водяной бани, охлаждают до комнатной температуры.
Для экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов к содержимому медицинского шприца типа «Луер» добавляют 5 см3 хлористого метилена и интенсивно перемешивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев органический слой экстракта переносят в стаканчик для взвешивания. Для улучшения разделения слоев к анализируемому образцу допускается добавлять несколько капель этилового спирта. Описанную процедуру экстракции повторяют еще дважды, объем хлористого метилена для второй экстракции — 3 см3, для третьей экстракции — 2 см3. Объединенные экстракты упаривают в вихревом потоке газа при комнатной температуре.
IX. ВЫПОЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ
9.1. В стаканчики для взвешивания с обработанной пробой экскретов добавляют 1 см3 н-гексана, тщательно перемешивают. Полученный раствор (концентрат) объемом 1 см3 фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм, используя медицинский шприц типа «Луер» вместимостью 1 см3, в стеклянную виалу вместимостью 2 см3 и хроматографируют на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 6.5.
9.2. Идентификацию бенз(а)пирена и его метаболитов проводят путем сравнения абсолютных времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и градуировочных растворах.
X. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
10.1. Содержание бенз(а)пирена и его метаболитов, приходящееся на 100 см3 анализируемой пробы мочи (X, мкг/100 см3), рассчитывают по формуле:
где C — массовая концентрация бенз(а)пирена или его метаболитов, найденная по градуировочной зависимости в соответствии с п. 6.5, мкг/см3;
100 — коэффициент пересчета анализируемой пробы мочи на 100 см3;
V — анализируемый объем пробы мочи, полученный в соответствии с п. 8.1, см3;
К — коэффициент, учитывающий степень экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов из мочи:
К = 0,50 — для метаболитов (бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола и 3-гидроксибенз(а)пирена).
10.2. Содержание бенз(а)пирена и его метаболитов, приходящееся на 100 г анализируемой пробы кала (X, мкг/100 г), рассчитывают по формуле:
где C — массовая концентрация бенз(а)пирена или его метаболитов, найденная по градуировочной зависимости в соответствии с п. 6.5, мкг/см3;
100 — коэффициент пересчета анализируемой пробы кала на 100 г;
m — анализируемая масса пробы кала, полученная в соответствии с п. 8.2, г;
К — коэффициент, учитывающий степень экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов из кала:
К = 0,50 — для метаболитов (бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола и 3 гидроксибенз(а)пирена).
XI. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1 Результат измерений по настоящей методике в документах, предусматривающих ее использование, представляют в виде:
(X \pm \Delta_{\text{л}})\text{мкг}/100\text{см}^{3},(\text{Р } = 0,95); (3)
где X — содержание бенз(а)пирена или его метаболитов в анализируемой пробе, мкг/100 см3;
\Delta_{\text{л}} — значение абсолютной погрешности, мкг/100 см3, рассчитанное по формуле:
\Delta_{\text{л}} = 0,01 \cdot \delta_{\text{л}} \cdot X; (4)
где \delta_{\text{л}} — показатель точности (границы относительной погрешности), приведенный в таблице 1, %.
11.2. Численные значения результатов измерений должны оканчиваться цифрой того же разряда, что и значения характеристики погрешности, которые не должны содержать более двух значащих цифр.
XII. КОНТРОЛЬ ТОЧНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
12.1 Общие сведения.
12.1.1 Контроль точности результатов измерений при реализации методики в лаборатории предусматривает:
- контроль стабильности градуировочной характеристики;
- оперативный контроль исполнителем процедуры выполнения измерений на основе оценки погрешности при реализации отдельно взятой контрольной процедуры;
- проверка приемлемости результатов, полученных в условиях внутрилабораторной прецизионности.
12.1.2. Периодичность контроля исполнителем процедуры выполнения измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений проводятся в соответствии с руководством по качеству аккредитованной лаборатории.
12.2 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
12.2.1. Стабильность градуировочной характеристики контролируют не реже, чем через каждые 15 проб.
12.2.2. Для этого дважды проводят измерения аналитического сигнала одного и того же градуировочного раствора, приготовленного по п. 6.5, вычисляют относительное отклонение средней концентрации, найденной по градуировочной характеристике, от номинального значения концентрации градуировочного раствора. Используют не менее двух градуировочных растворов бенз(а)пирена или его метаболитов с массовой концентрацией, близкой к началу и концу градуировочной характеристики.
12.2.3 Градуировочная зависимость признается стабильной, если для обоих градуировочных растворов выполняется условие:
|\text{С } - \text{С}_{\text{к}}| \leq \delta_{\text{гр}.} \cdot \text{С } \cdot 0,01; (5)
где C — действительное значение массовой концентрации бенз(а)пирена или его метаболитов в градуировочном растворе, мкг/см3;
Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации бенз(а)пирена или его метаболитов в этом же градуировочном растворе, мкг/см3;
\delta_{\text{гр}.} — относительная погрешность построения градуировочной характеристики:
для флуорометрического детектора:
\delta_{\text{гр}.} = 15\% — для бенз(а)пирена
\delta_{\text{гр}.} = 19\% — для бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола
\delta_{\text{гр}.} = 17\% — для 3-гидроксибенз(а)пирена
для диодноматричного детектора:
\delta_{\text{гр}.} = 14\% — для бенз(а)пирена
\delta_{\text{гр}.} = 19\% — для бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола
\delta_{\text{гр}.} = 18\% — для 3-гидроксибенз(а)пирена.
В случае невыполнения условия (4) для выбранных градуировочных растворов с массовой концентрацией, близкой к началу и концу градуировочной характеристики, проводят повторную градуировку прибора. Если условие (5) не выполняется только для одного градуировочного раствора, то этот раствор измеряют повторно. Если при повторном измерении условие (5) выполняется, то градуировочная характеристика считается стабильной, если условие не выполняется, то проводят повторную градуировку прибора.
Градуировочная характеристика в таком случае соответствует линейной зависимости с коэффициентом корреляции не менее 0,95.
12.3. Алгоритм оперативного контроля процедуры выполнения измерений с использованием образца для контроля.
12.3.1. Образец для контроля (далее — ОК) представляет собой матричный раствор для градуировки.
На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в стаканчики для взвешивания с обработанной пробой экскретов добавляют 1 см3 градуировочного раствора бенз(а)пирена и его метаболитов, тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм, используя медицинский шприц «Луер», в стеклянную виалу вместимостью 2 см3 и анализируют на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 6.5.
12.3.2 Результат контрольной процедуры Кк, мкг/100 см3, рассчитывают по формуле:
где X — содержание бенз(а)пирена или его метаболитов в ОК, мкг/100 см3;
C — рассчитанное содержание бенз(а)пирена или его метаболитов в ОК, мкг/100 см3.
12.3.3 Норматив контроля погрешности Кn рассчитывают по формуле
\text{К}_{n} = \Delta_{\text{л}}, (7)
где \Delta_{\text{л}} — абсолютное значение характеристики погрешности результата измерений, соответствующее массовой концентрации бенз(а)пирена или его метаболитов в исследуемой пробе, мкг/100 см3:
\Delta_{\text{л}} = 0,01 \cdot \delta_{\text{л}} \cdot \text{С}. (8)
12.3.4 Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию:
процедуру признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (9) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (9) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
12.4. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле внутрилабораторной прецизионности.
12.4.1. Контроль внутрилабораторной прецизионности осуществляют для результатов измерений, полученных в соответствии с методикой в условиях внутрилабораторной прецизионности (разные исполнители и (или) разное время, и (или) разные наборы средств измерений и т.д.). В качестве образца для контроля используют рабочие пробы экскретов.
12.4.2 Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:
где X1 и X2 - результаты контрольных измерений содержания бенз(а)пирена или его метаболитов в образце для контроля, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, мкг/100 см3;
Rл — абсолютное значение допускаемого расхождения между двумя результатами, полученными в одной лаборатории в условиях внутрилабораторной прецизионности, мкг/100 см3, рассчитываемое по формуле:
R_{\text{л}} = 0,01 \cdot \sigma_{R\text{л}} \cdot 2,77 \cdot X, (11)
где X — среднее арифметическое значение контрольных результатов измерений содержания бенз(а)пирена или его метаболитов в образце для контроля, мкг/100 см3;
\sigma_{R\text{л}} — относительное значение показателя внутрилабораторной прецизионности (таблица 1), %.
12.4.3. При выполнении условия (10) говорят об удовлетворительной внутрилабораторной прецизионности результатов измерений.
При превышении предела внутрилабораторной прецизионности анализ повторяют. При повторном превышении указанного предела выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты.
3. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
4. ГОСТ Р 53079.4 «Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа».
5. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
6. ГОСТ Р ИСО 5725-1 — ГОСТ Р ИСО 5725-6 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
7. ГОСТ 8.315 «Государственная система обеспечения единства измерений. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов. Основные положения».
8. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
9. ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».
10. ГОСТ 450 «Кальций хлористый технический. Технические условия».
11. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 2222 «Метанол технический. Технические условия».
13. ГОСТ 2768 «Ацетон технический. Технические условия».
14. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
15. ГОСТ 4461 «Реактивы. Кислота азотная. Технические условия».
16. ГОСТ 4568 «Калий хлористый. Технические условия».
17. ГОСТ 8981 «Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия».
18. ГОСТ 24363 «Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия».
19. ГОСТ 23932 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия».
20. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
21. ГОСТ 28311 «Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».
22. ГОСТ 29169 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой».
23. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
24. ГОСТ ISO 7886-1 «Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования (с Поправками)».
25. ТУ 6-09-1710 «Этанол для хроматографии (этиловый спирт) химически чистый. Технические условия».
26. ТУ 6-09-3818 «Диметилсульфоксид (метилсульфоксид). Технические условия».
27. ТУ 2631-001-54260861 «Гексан для хроматографии».
28. ТУ 2634-002-04715285 «Ацетонитрил».
29. СТП ТУ СОМР 3-102 «Дихлорметан для спектроскопии (метилен хлористый)».