Методические рекомендации по постановке реакции пассивной гемагглютинации с цистеиновой пробой с целью диагностики брюшного тифа, паратифов, других сальмонеллезов и выявления бактерионосителей

Каждое нажатие пальцем на головку поршня до упора позволяет внести 0,5 мл раствора в лунку, после чего пружина отводит поршень в исходное положение и шприц вновь заполняется 0,5 мл раствора. В первые лунки каждого ряда вносят по 0,5 мл исследуемых сывороток, обработанных и не обработанных цистеином (в разведении 1:10), и тем же шприцем (с ограничителем на 0,5 мл), на головку которого вместо тройника надета изогнутая игла с отверстием диаметром примерно 0,8 — 1,0 мм, перемешивают 3 раза содержимое первой лунки и переносят 0,5 мл во вторую лунку, а из второй после трехкратного перемешивания — в третью и т.д. Из последней лунки 0,5 мл содержимого выливают и тщательно (не менее 4 — 5 раз) промывают шприц чистым 0,85% раствором хлористого натрия. Таким образом последовательно разводят до предполагаемого титра исследуемые сыворотки и во все лунки вносят необходимое количество диагностикума (согласно соответствующему наставлению). При отсутствии указанного шприца и пластмассовых планшетов с лунками можно пользоваться мерными пипетками и биологическими пробирками.

В качестве основы для титрования сывороток, обработанных цистеином, необходимо использовать забуференный 0,85% раствор хлористого натрия (фосфатный буфер, pH 7,0 — 7,2), однако предпочтительнее готовить 0,85% раствор хлористого натрия на нормальной, прогретой при 56 °C в течение 30 минут сыворотке (кроличьей, лошадиной, крупного рогатого скота). Нормальную сыворотку добавляют из расчета 1 мл на 100 мл 0,85% раствора хлористого натрия (pH 7,0 — 7,2) при условии: в принятом разведении нормальной сыворотки отсутствуют антитела к применяемым диагостикумам, что проверяют предварительно для каждой новой серии нормальной сыворотки. Стабильность используемых диагностикумов периодически (1 раз в 2 — 3 месяца) проверяют титрованием одной серии иммунной сыворотки с известным титром. Такая сыворотка в лиофилизированном состоянии прилагается к диагностикуму и служит рабочим стандартом. Каждый опыт должен сопровождаться контролем диагностикума в растворе для титрования.

После внесения диагностикума пластинки или пробирки осторожно встряхивают для равномерного перемешивания содержимого и помещают либо в термостат при 37 °C на 3 часа, либо оставляют на 18 — 20 часов при комнатной температуре.

Реакция гемагглютинации считается положительной в том случае, если эритроциты полностью агглютинировались и расположены равномерно по дну лунки либо при почти полной агглютинации небольшая часть эритроцитов оседает в центре лунки в виде ровного колечка или пуговки. Иногда при положительной реакции края агглютината в лунках могут слегка сползать и он принимает вид «зонтика». При отрицательном результате агглютинанта нет, все эритроциты оседают на дне в центре в виде пуговки или ровного колечка.

В современных условиях при относительно частом контакте организма человека с сальмонеллами и некоторыми другими бактериями семейства кишечных, а также с их антигенами нарастание IgM и IgG-антител у многих заболевших происходит быстро — по типу вторичного иммунного ответа. Это особенно характерно для взрослых. Поэтому первое взятие сыворотки с целью диагностики заболевания необходимо проводить немедленно после поступления больного в стационар, а второй раз сыворотку можно брать в конце первой — начале второй недели болезни при подозрении на сальмонеллез и в конце второй недели — при подозрении на брюшной тиф и паратифы. Целесообразно исследовать сыворотку и в периоде реконвалесценции, если результаты бактериологического обследования больного оказались отрицательными. При таком подходе к серологическому исследованию, как правило, удается выявить достоверное нарастание титра суммарных антител, т.е. цистеиночувствительные + цистеиноустойчивые, и установить характерную для заболеваний <...> путем обработки сывороток цистеином. Именно эти показатели должны быть основными при постановке серологического диагноза заболевания. Понимание «диагностического» титра антител (особенно суммарных) является весьма условным. Так называемый «диагностический» титр может быть обусловлен профилактической вакцинацией, перенесенным в прошлом (от нескольких месяцев до 3-х лет) заболеванием в стертой или субклинической форме или встречей с антигенами (которые могут попадать в организм с загрязненной пищей или водой), даже подвергшимися термической обработке, поскольку некоторые соматические антигены термоустойчивы. Следует учитывать также и то, что для разных районов страны (в связи с особенностями эпидемической ситуации и др.) величина «диагностического» титра будет различной. Она устанавливается эмпирически в результате титрования сывороток от 100 — 200 здоровых лиц. Большое значение имеет условно-диагностический титр IgG-антител, т.к. их наличие свидетельствует о значительном специфическом антигенном стимуле.

При подозрении на тиф и паратифы сыворотки следует титровать с помощью О-диагностикумов серогрупп А, В и Д, а также Н-диагностикумов 1 фазы a, b, d и Ви-диагностикума. Если выявляется четкое нарастание (в 4 раза и более) титра суммарных антител к определенным антигенам и особенно увеличение уровня IgG-антител, устойчивых к цистеину, то это дает веские основания для подтверждения клинического диагноза. Необходимо при этом учитывать, что при паратифе А титры О-антител на протяжении заболевания бывают более низкими, чем при брюшном тифе и паратифе В. В случае позднего поступления больного в стационар (в разгаре болезни) условно-диагностическим титром суммарных О-антител следует считать положительный результат в разведении не ниже 1:640. Минимальным условно-диагностическим титром IgG О- и Н-антител считается разведение 1:80, а для Ви-антител — 1:40 (при паратифе А «диагностические» титры могут быть в 2 раза ниже).

В такой ситуации при отсутствии бактериологического подтверждения рекомендуется исследовать сыворотку в периоде поздней реконвалесценции, чтобы уловить снижение общего титра антител и уменьшение удельного содержания цистеиноустойчивых IgG-антител, что также может служить определенным основанием для постановки диагноза.

При подозрении на сальмонеллез сыворотки вначале титруют с комплексным диагностикумом без цистеина. Если будет выявлено нарастание уровня антител или титр окажется достаточно высоким (не ниже 1:320), то следует перетитровать сыворотки в РПГА с цистеином со всеми групповыми О-диагностикумами (при отрицательном результате бактериологического обследования). Это необходимо не только для уточнения этиологии заболевания, но и потому что РПГА с комплексным диагностикумом недостаточно специфична. При сальмонеллезах и особенно пищевых токсикоинфекциях сальмонеллезной этиологии уже в конце первой недели в сыворотке обычно определяется довольно высокоудельное содержание IgG-антител. Поэтому при обработке такой сыворотки цистеином титр может снижаться не очень резко.

Реакция пассивной гемагглютинации с цистеином может оказаться полезной для постановки правильного диагноза в случаях смешанной инфекции или при выделении двух или нескольких видов возбудителей, этиологическая роль каждого из которых не ясна. При истинной микст-инфекции антитела и особенно цистеиноустойчивые будут нарастать к каждому возбудителю. Если же к какому-то микробу нарастание антител, и в том числе IgG, не будет выявлено, то можно предполагать, что выделение этого микроба носит случайный, транзиторный характер. Транзиторное носительство сальмонелл нередко имеет место у взрослых, т.к. они значительно более устойчивы к заражению, чем дети.

РПГА с цистеином можно использовать с целью установления ретроспективного диагноза, т.к. у переболевших даже субклинической формой заболевания в течение 1 — 2 месяцев в большинстве случаев сохраняется повышенный титр суммарных IgG-антител к соответствующему антигену.

В случае формирования острого и особенно хронического бактерионосительства происходит выраженное нарастание IgG-антител и при этом основное значение имеет не абсолютный титр антител, а удельное содержание в сыворотке цистеиноустойчивых антител. Если обработка цистеином не снижает титр либо снижает его только на одно, максимум два разведения, то это говорит о значительном содержании в сыворотке IgG-антител и у такого человека следует заподозрить острое или хроническое бактерионосительство. Необходимо отметить, что при длительном бактерионосительстве титр О-антител может быть низким (иногда 1:20 — 1:40), но эти антитела практически целиком определяются IgG-антителами. В то же время у хронических носителей тифозных бактерий определяется также сравнительно высокий уровень (в большинстве случаев выше 1:80) Ви-антител, который <...> при обработке цистеином.

Отмеченная закономерность может нарушаться у хронических носителей тифозных бактерий, инвазированных онисторхами. В сыворотках у значительного процента таких лиц относительно невелико удельное содержание IgG О-антител, однако выявляются высокие титры IgG Ви-антител. Это необходимо принимать во внимание при обследовании на бактерионосительство различных контингентов населения, главным образом, на некоторых территориях Обь-Иртышского бассейна, где описторхоз встречается в качестве краевой патологии.

У транзиторных бактерионосителей при относительно невысоком титре антител все они, как правило, принадлежат к IgM и полностью инактивируются цистеином. Если этого не наблюдается и в сыворотке остаются антитела (выше 1:20) после обработки ее цистеином, то у такого лица можно предполагать наличие либо субклинической формы инфекции, либо продолжающееся бактерионосительство. Некоторое повышение уровня IgG-антител может происходить в результате многократной специфической вакцинации, поэтому при анализе результатов реакции следует учитывать прививочный анамнез.

Постановка РПГА с цистеиновой пробой может быть использована с целью контроля возможного прекращения бактерионосительства. Известно, что у бактерионосителей выделение возбудителей может происходить не постоянно, а с более или менее длительными перерывами. У такого лица серологические показатели будут характерными для длительного бактерионосителя. Если же на фоне прекратившегося бактериовыделения значительно снизится титр антител и особенно цистеиноустойчивых IgG, то можно предположить об освобождении организма от возбудителя. Освобождение от бактерионосительства чаще наблюдается при сальмонеллезах, реже — при брюшном тифе.