ГОСТ Р 54637-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина D3

(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2011 № 786-ст)

от 12 декабря 2011 г. № 786-ст

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА D_{3}

Functional food products. Method of vitamin D_{3} determination

ГОСТ Р 54637-2011

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом № 184-ФЗ «О техническом регулировании» от 27 декабря 2002 г., а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».

Сведения о стандарте

1. Разработан Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания РАМН.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 36 «Функциональные пищевые продукты».

3 Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2011 г. № 786-ст.

4. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на функциональные пищевые продукты и устанавливает метод определения массовой доли витамина D_{3} (холекальциферола) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой доли витамина D_{3} составляет от 0,1 до 1,0\text{млн}^{- 1} .

Примечание. Настоящий стандарт допускается распространять на пищевые продукты при условии соблюдения диапазона измерений.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27025-86 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52349, а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1. Содержание витамина D_{3} : массовая доля холекальциферола, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в миллионных долях (\text{млн}^{- 1}) .

4. Сущность метода

Витамин D_{3} экстрагируют после омыления анализируемой пробы с использованием раствора гидроксида калия. Полученный экстракт используют для выделения методом полупрепаративной нормально-фазной (далее — НФ) ВЭЖХ фракции, содержащей витамин D_{3} , и затем проводят анализ с использованием аналитической обращенно-фазной (далее — ОФ) ВЭЖХ. Витамин D_{3} детектируют по поглощению в ультрафиолетовой области спектра, пики идентифицируют по их времени удерживания и спектру.

Количественный анализ проводят с помощью метода внутреннего стандарта, используя площадь или высоту пиков. В качестве внутреннего стандарта для определения витамина D_{3} используется витамин D_{2} .

5. Требования безопасности

5.1 Условия безопасного проведения работ

При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования пожарной безопасности, установленные ГОСТ 12.1.004, электробезопасности — ГОСТ Р 12.1.019, техники безопасности при работе с реактивами — ГОСТ 12.1.007, а также требования, изложенные в технической документации на спектрофотометр, хроматограф, другие приборы и оборудование.

Помещение, в котором проводят испытания, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005.

При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться [1].

5.2 Требования к квалификации оператора

К выполнению испытаний и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием по профессиям химик, инженер-химик, техник, лаборант, имеющие опыт работы в химической лаборатории. Первое применение метода в лаборатории следует проводить под наблюдением квалифицированного специалиста в области ВЭЖХ.

6. Условия выполнения испытания

6.1 Общие условия

Испытания проводят в нормальных лабораторных условиях: температура окружающей среды — (25 +/- 5) °C; относительная влажность — (65 +/- 15)%; частота переменного тока — (50 +/- 5) Гц; напряжение в сети — (220 +/- 10) В.

Хранение стандартных веществ проводят в защищенном от света месте и при температуре не выше 4 °C.

При приготовлении и хранении растворов следует выполнять требования ГОСТ 27025, ГОСТ 4517.

Для предотвращения разрушения витамина D_{3} анализ испытуемой пробы и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта (L-аскорбиновой кислоты, гидрохинона, пирогаллола), предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

6.2 Условия хроматографического анализа

Температура колонки: 25 °C или температура окружающей среды.

Объемная скорость подачи подвижной фазы для НФ и ОФ ВЭЖХ: 0,7 — 1,0 см3/мин.

Объем вводимой пробы для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ: 0,20 — 0,25 см3.

Объем вводимой пробы для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ: 0,1 см3.

Подвижная фаза для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ (в объемном соотношении): н-гексан:2-пропанол (98:2) или н-гексан:2-пропанол:тетрагидрофуран (98:1:1).

Подвижная фаза для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ (в объемном соотношении): ацетонитрил:метиловый спирт (80:20) или ацетонитрил:метиловый спирт:метилен хлористый (50:45:5).

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения в условиях полупрепаративной НФ ВЭЖХ осуществляют путем хроматографического анализа раствора анализируемой пробы по 8.2.5. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения пика витамина D от пиков токоферолов матрицы составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других подвижных фаз и колонок.

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения в условиях аналитической ОФ ВЭЖХ осуществляют путем хроматографического анализа смешанного раствора витаминов D_{2} и D_{3} с массовой концентрацией каждого вещества не менее 0,5 мкг/см3. Данный раствор готовят из основных растворов по аналогии с методикой приготовления рабочих растворов по 8.1.2.1 и 8.1.2.2. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения соседних пиков витаминов D_{2} и D_{3} составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других подвижных фаз и колонок.

7. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

7.1. Для определения массовой доли витамина D_{3} применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

• весы по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,1 мг;
• спектрофотометр со спектральным рабочим диапазоном от 190 до 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%;
• кюветы кварцевые с длиной оптического пути 1 см;
• хроматограф для проведения анализа методом полупрепаративной ВЭЖХ, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода пробы; колонку для проведения анализа методом полупрепаративной НФ ВЭЖХ диаметром 0,4 — 0,46 см, длиной 25 — 30 см, заполненную силикагелем или силикагелем, модифицированным CN- или NH_{2} - \text{группами} с размером частиц 5 мкм; спектрофотометрический (длина волны детектирования 265 нм) или диодно-матричный детектор с погрешностью измерений не более 10% отн., устройство для сбора фракций, регистрирующее устройство (самописец или интегратор), позволяющее проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1%; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;
• хроматограф для проведения анализа методом аналитической ВЭЖХ, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода проб; колонку для проведения анализа методом аналитической ОФ ВЭЖХ диаметром 0,40 — 0,46 см, длиной 25 — 30 см, заполненную октадецилсиликагелем, с размером частиц 5 мкм; спектрофотометрический (длина волны детектирования 265 нм) или диодно-матричный детектор с погрешностью измерений не более 10% отн., регистрирующее устройство (самописец или интегратор), позволяющее проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1%; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;
• фильтры для фильтрования подвижной фазы и анализируемых растворов (например, с размером пор 0,45 мкм);
• микрошприцы типа «Гамильтон» вместимостью 0,2 см3 и 0,5 см3 для ввода проб в жидкостный хроматограф;
• пипетки градуированные 1(2,3)-1(2)-1-0,5(1,2,5,10,25) по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более +/- 1%;
• цилиндры 1-50(100,250)-1(2) по ГОСТ 1770;
• колбы мерные 2-50(100,250,500,1000)-2 по ГОСТ 1770;
• пробирки мерные с притертыми пробками П-2-5(10,15,20,25)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770;
• стаканы В(Н)-1-50(100,150,250)ТХС по ГОСТ 25336;
• колбы круглодонные К-1-100(250,500)-29/32ТС по ГОСТ 25336;
• воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС по ГОСТ 25336;
• линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427;
• встряхиватель для колб и пробирок с диапазоном частот колебаний платформ 100 — 150 колебаний в минуту;
• центрифуга, обеспечивающая 4 — 6 тыс. об/мин;
• баня водяная с регулятором нагрева, поддерживающая температуру от 30 °C до 100 °C;
• баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм3;
• испаритель ротационный с диапазоном рабочего давления от 7 мм рт. ст. до 760 мм рт. ст. (от 9 \cdot 10^{2}\text{Па} до 10 \cdot 10^{4}\text{Па} ) или насос водоструйный по ГОСТ 25336;
• холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;
• термометр лабораторный жидкостный с диапазоном температур от 0 до 100 °C, ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498;
• баллон с газообразным азотом по ГОСТ 9293, ос.ч. и [1];
• бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026;
• плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919;
• мельница лабораторная электрическая;
• холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

• абсолютный этиловый спирт (C_{2}H_{5}OH) массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
• ректификованный этиловый спирт (C_{2}H_{5}OH) массовой долей основного вещества не менее 96% или по ГОСТ Р 51652, ГОСТ 18300;
• метиловый спирт (CH_{3}OH) массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
• ацетонитрил (CH_{3}CN) массовой долей основного вещества не менее 99,8%;
• метилен хлористый (CH_{2}Cl_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99,8%;
• н-гексан (C_{6}H_{14}) массовой долей основного вещества не менее 99,5%;
• этилацетат (C_{4}H_{8}O_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 8981;
• 2-пропанол (C_{3}H_{8}O) массовой долей основного вещества не менее 99,5%;
• тетрагидрофуран (C_{4}H_{8}O) массовой долей основного вещества не менее 99,5%;
• петролейный эфир, перегнанный при температуре (50 +/- 10) °C, очищенный от перекисей;
• диэтиловый эфир, очищенный от перекисей, содержащий 0,1% пирогаллола по [2];
• калия гидроокись (KOH) по ГОСТ 24363, х.ч. или ч.д.а., раствор KOH массовой долей 50%;
• натрий сернокислый (Na_{2}SO_{4}) безводный массовой долей основного вещества не менее 99,5% или по ГОСТ 4166, х.ч.;
• дистиллированную воду по ГОСТ 6709;
• кислоту аскорбиновую (C_{6}H_{8}O_{6}) по [3] или [4], х.ч.;
• гидрохинон (C_{6}H_{6}O_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 19627;
• пирогаллол (C_{6}H_{6}O_{3}) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• бутилгидрокситолуол — БГТ (C_{15}H_{24}O) массовой долей основного вещества не менее 99%, раствор БГТ в н-гексане массовой концентрацией 2 мг/см3;
• эргокальциферол (витамин D_{2} ), M(C_{28}H_{44}O) = 396,7\text{г}/\text{моль} , массовой долей основного вещества не менее 98%;
• холекальциферол (витамин D_{3} ), M(C_{27}H_{44}O) = 384,6\text{г}/\text{моль} , массовой долей основного вещества не менее 98%.

7.3. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерений, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

8. Подготовка к выполнению измерений

8.1. Приготовление растворов

8.1.1 Исходные растворы стандартов

8.1.1.1. Для приготовления исходного раствора витамина D_{2} в мерную колбу объемом 100 см3 помещают около 100 мг витамина D_{2} , растворяют в этиловом ректификованном спирте и доводят до метки спиртом. Этот раствор содержит около 1 мг/см3 витамина D_{2} . Массовую концентрацию исходного раствора витамина D_{2} уточняют по 8.1.2.1.

8.1.1.2. Для приготовления исходного раствора витамина D_{3} в мерную колбу объемом 100 см3 помещают около 100 мг витамина D_{3} , растворяют в этиловом ректификованном спирте и доводят до метки спиртом. Этот раствор содержит около 1 мг/см3 витамина D_{3} . Массовую концентрацию исходного раствора витамина D_{2} уточняют по 8.1.2.2.

Приготовленные растворы хранят в темноте при температуре не выше 4 °C.

8.1.2 Рабочие растворы стандартов

8.1.2.1. 1 см3 исходного раствора витамина D_{2} , приготовленного по 8.1.1.1, с помощью пипетки переносят в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки этиловым ректификованным спиртом. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. Массовая концентрация рабочего раствора витамина D_{2} составляет 10 мкг/см3.

Измерение оптической плотности стандартного раствора витамина D_{2} проводят в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при 265 нм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый ректификованный. Для расчета массовой концентрации раствора витамина D_{2} ( \text{С}_{D_{2}} , мкг/см3) используют уравнение:

где A_{265} — значение оптической плотности рабочего раствора витамина D_{2} при 265 нм;

475 — значение оптической плотности раствора витамина D_{2} массовой концентрации 1 г в 100 см3 при 265 нм в спирте этиловом при толщине поглощающего слоя 1 см (E_{1\text{см}}^{1\%}) ;

10^{6} — коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

100 — коэффициент пересчета на 1 см3.

8.1.2.2. 1 см3 исходного раствора витамина D_{3} , приготовленного по 8.1.1.2, с помощью пипетки переносят в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки спиртом этиловым ректификованным. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. Массовая концентрация рабочего раствора витамина D_{3} составляет 10 мкг/см3.

Измерение оптической плотности стандартного раствора витамина D_{3} проводят в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при 265 нм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый ректификованный. Для расчета массовой концентрации раствора витамина D_{3} ( \text{С}_{D_{3}} , мкг/см3) используют уравнение:

где A_{265} — значение оптической плотности рабочего раствора витамина D_{3} при 265 нм;

485 — значение оптической плотности раствора витамина D_{3} массовой концентрации 1 г в 100 см3 при 265 нм в спирте этиловом при толщине поглощающего слоя 1 см (E_{1\text{см}}^{1\%}) ;

10^{6} — коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

100 — коэффициент пересчета на 1 см3.

8.1.2.3. Для приготовления рабочего раствора внутреннего стандарта витамина D_{2} 10 см3 стандартного раствора витамина D_{2} по 8.1.1.1 с помощью пипетки помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки спиртом этиловым ректификованным. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Массовая концентрация рабочего раствора витамина D_{2} составляет 1 мкг/см3.

8.1.2.4. Для приготовления рабочего раствора смеси витаминов D_{2} и D_{3} , необходимого для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ, помещают 5 см3 рабочего раствора витамина D_{2} по 8.1.2.1 и 5 см3 рабочего раствора витамина D_{3} по 8.1.2.2 в колбу роторного испарителя. Растворитель тщательно упаривают на водяной бане при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток перерастворяют в 50 см3 н-гексана или подвижной фазы, используемой для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ. Массовая концентрация витамина D_{2} (D_{3}) в растворе составляет 1 мкг/см3.

8.1.2.5. Из исходных растворов готовят не менее четырех рабочих растворов витамина D_{3} в диапазоне концентраций 0,1 — 10,0 мкг/см3, используемых для построения градуировочного графика по 8.4. Для этого 1,0 см3 и 10,0 см3 рабочего раствора витамина D_{3} по 8.1.2.2 с помощью пипетки помещают в мерную колбу на 100 см3 и растворы доводят до метки спиртом этиловым абсолютным (массовая концентрация полученных растворов витамина D_{3} составляет 0,1 мкг/см3 и 1,0 мкг/см3), а также 0,5 см3 и 1,0 см3 исходного раствора витамина D_{3} по 8.1.1.2 помещают в мерную колбу на 100 см3 и растворы доводят до метки спиртом этиловым абсолютным (массовая концентрация полученных растворов витамина D_{3} составляет 5,0 мкг/см3 и 10,0 мкг/см3).

8.2. Отбор и подготовка проб

8.2.1. Отбор проб проводят по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 26809, ГОСТ Р 52062, ГОСТ Р 52179.

8.2.2. Крупные частицы средней пробы, выделенной методом квартования из лабораторной пробы, измельчают с использованием подходящего оборудования (например, лабораторной мельницы) до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.

8.2.3. Для омыления испытуемой пробы, содержащей менее 30% жира, 5 — 20 г исследуемого материала помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 — 500 см3, добавляют 90 — 100 см3 этилового ректификованного спирта, 1 г аскорбиновой кислоты (или 1 г пирогаллола), 50 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия. Перед омылением в колбу вносят соответствующее количество раствора внутреннего стандарта. Количество витамина D_{2} должно быть близким к ожидаемому количеству витамина D_{3} в анализируемом образце. Омыление проводят в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником (желательно в токе азота) при температуре 70 °C — 80 °C.

При проведении щелочного гидролиза при комнатной температуре в течение не менее 16 ч используют вышеуказанные соотношения материала и реактивов.

8.2.4. Для омыления испытуемой пробы, содержащей более 30% жира, в колбу для омыления вносят 5 — 20 г исследуемого материала, добавляют 90 — 100 см3 спирта этилового, примерно 1 г аскорбиновой кислоты (или 1 г пирогаллола), 50 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия. Перед омылением в колбу вносят соответствующее количество раствора внутреннего стандарта витамина D_{2} , количество которого должно быть близким к ожидаемому количеству витамина D_{3} в анализируемом образце. Омыление проводят на водяной бане в течение 30 — 45 мин (желательно в токе азота) при температуре 95 °C — 100 °C.

Рекомендуемое добавляемое количество внутреннего стандарта приведено в таблице 1.

Количество добавляемого внутреннего стандарта витамина D_{2}

Заявленное содержание витамина D_{3} , \text{млн}^{- 1}	Навеска пробы, г	Количество вносимого раствора внутреннего стандарта, см3
От 0,1 до 0,3 включ.	20	3
Св. 0,3 до 0,6 включ.	10	3
Св. 0,6 до 1,0 включ.	5	2

Если после омыления и охлаждения жир или масло остаются на поверхности омыляемой смеси, то вновь приливают 50 см3 50%-ного раствора KOH и омыление повторяют.

После окончания гидролиза, проведенного по 8.2.3 (8.2.4), содержимое колбы быстро охлаждают до (20 +/- 5) °C и количественно переносят в делительную воронку. Витамин D экстрагируют 100 см3 н-гексана (этилацетата, петролейного или диэтилового эфира).

Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2 — 5 г безводного сульфата натрия. Фильтр промывают 20 см3 н-гексана, затем добавляют в фильтрат 1 см3 раствора (2 мг/см3) БГТ в н-гексане. Экстракт промывают 3 — 5 раз порциями воды по 50 — 100 см3 до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге) и затем упаривают с помощью роторного испарителя при пониженном давлении и при температуре не выше 40 °C.

8.2.5. Для приготовления раствора исследуемого образца для анализа с помощью полупрепаративной НФ ВЭЖХ к сухому остатку после упаривания экстракта приливают 2 см3 н-гексана (или другого растворителя или смеси растворителей, которые используются в качестве подвижной фазы в системе полупрепаративной ВЭЖХ).

8.2.6. Для выделения фракции, содержащей витамин D, 0,2 — 0,5 см3 раствора по 8.2.5 элюируют в условиях полупрепаративной ВЭЖХ и собирают элюат, содержащий смесь витаминов D_{2} и D_{3} (в условиях НФ ВЭЖХ эти соединения элюируются одновременно), предварительно определив время удерживания этих соединений по 8.3. Время удерживания витамина D зависит от используемых подвижных и неподвижных фаз и обычно составляет 10 — 15 мин. Общее время хроматографического разделения составляет 25 — 30 мин.

8.2.7. Фракцию элюата, полученную по 8.2.6, упаривают на роторном испарителе при пониженном давлении и температуре не более 40 °C, и сухой остаток перерастворяют в 0,5 см3 подвижной фазы для аналитической ОФ ВЭЖХ.

8.3. Подготовка жидкостных хроматографов

Подготовку жидкостных хроматографов к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонки промывают элюентом.

Раствор смеси витаминов D_{2} и D_{3} по 8.1.2.4 несколько раз вводят в хроматограф для полупрепаративного анализа и проверяют повторяемость времени удерживания витамина D (в варианте НФ ВЭЖХ витамины D_{2} и D_{3} элюируются одновременно). Хроматографические условия оптимизируют для оптимального разделения пика витамина D от пиков токоферолов и других соединений матрицы.

Раствор смеси витаминов D_{2} и D_{3} по 8.1.2.6 несколько раз вводят в хроматограф для варианта аналитической ОФ ВЭЖХ и проверяют повторяемость полного разделения пиков витаминов D_{2} и D_{3} (степень разделения пиков должна быть не менее 1,0). Условия хроматографирования также должны обеспечивать оптимальное отделение пиков витаминов D_{2} и D_{3} от пиков других соединений матрицы.

8.4. Построение градуировочной зависимости

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя по программному обеспечению.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал, mAU \cdot \text{с} (AU \cdot \text{с}) или мм» — «массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см3». Для каждого анализируемого градуировочного раствора проводят два параллельных измерения и находят среднеарифметическое значение. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удерживания не должно превышать 5% средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций витамина D_{3} . Коэффициент градуировочного графика k_{\text{гр}} определяют как среднеарифметическое значение коэффициентов k_{i} , вычисляемых по формуле

где C_{i} — массовая концентрация микронутриентов в i-м градуировочном растворе, мкг/см3;

S_{i} — площадь пика i-го градуировочного раствора, mAU \cdot \text{с} (AU \cdot \text{с}) , или высота, мм.

Проводят хроматографический анализ не менее четырех рабочих стандартных растворов витамина D_{3} , приготовленных по 8.1.2.5.

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверной аппроксимации R^{2} \geq 0,997 .

Градуировка проводится в следующих случаях: на этапе освоения метода, при изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

9. Выполнение измерений

В колонку хроматографа для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ последовательно вводят равные объемы испытуемого раствора по 8.2.7 и одного из градуировочных растворов по 8.1.2.5.

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя время удерживания, спектры в УФ-диапазоне длин волн или соотношения интенсивности сигнала детектора при различных длинах волн для соответствующих пиков стандартов и определяемых соединений.

10. Обработка и оформление результатов

Поправочный коэффициент k рассчитывают с помощью метода внутреннего стандарта по формуле

где S_{\text{вн}.\text{ст}} — площадь ( mAU \cdot \text{с} или AU \cdot \text{с} ) или высота (мм) пика внутреннего стандарта витамина D_{2} ;

S_{x} — площадь ( mAU \cdot \text{с} или AU \cdot \text{с} ) или высота (мм) пика определяемого витамина D_{3} ;

C_{\text{вн}.\text{ст}} — массовая концентрация внутреннего стандарта витамина D_{2} по 8.1.2.3, мкг/см3;

Массовую долю витамина D_{3} в анализируемом образце X, \text{млн}^{- 1} , рассчитывают по формуле

X = k \cdot \frac{m_{\text{вн}.\text{ст}} \cdot S_{x}}{m_{\text{пр}} \cdot C_{\text{вн}.\text{ст}}} , (5)

где m_{\text{вн}.\text{ст}} — масса внутреннего стандарта (витамина D_{2} ), добавленного к навеске пробы анализируемого образца, мг;

m_{\text{пр}} — масса пробы, взятой для омыления, кг;

S_{\text{вн}.\text{ст}} — площадь ( mAU \cdot \text{с} или AU \cdot \text{с} ) или высота (мм) пика внутреннего стандарта витамина D_{2} ;

k — поправочный коэффициент, рассчитанный по формуле 4.

Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений X_{1} , X_{2} (в процентах от среднего значения X_{\text{ср}} ), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать норматива контроля сходимости r с доверительной вероятностью 95%.

При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение X_{\text{ср}} .

Границы относительной погрешности определения массовой доли витамина D_{3} \pm \delta , в процентах от результата испытания, и при доверительной вероятности 95% не должны превышать значений, указанных в таблице 2.

Таблица 2

Основные метрологические характеристики метода

Метрологическая характеристика (P = 0,95)	Диапазон измерений, \text{млн}^{- 1}
	от 0,1 до 0,5 включ.	св. 0,5 до 1,0 включ.
Стандартное отклонение повторяемости s_{r} , %	8,8	7,1
Предел повторяемости r, %	25	20
Стандартное отклонение воспроизводимости s_{R} , %	10,6	8,8
Предел воспроизводимости R, %	30	25
Границы относительной погрешности ( \pm \delta) , %	25	20
Предел обнаружения, \text{млн}^{- 1}	0,03

Результат определения витамина D_{3} представляют в следующем виде:

X_{\text{ср}} \pm \Delta,\text{млн}^{- 1}\text{при }P = 95\% , (6)

где X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, \text{млн}^{- 1} ;

\Delta — значение границы абсолютной погрешности определений, \text{млн}^{- 1} , рассчитанное по формуле

\Delta = \frac{\delta \cdot X_{\text{ср}}}{100} , (7)

где \delta — значение границы относительной погрешности измерений, % (таблица 2).

11. Метрологические характеристики метода

11.1 Повторяемость

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений ( X_{1} , X_{2} ), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, считают удовлетворительным, если |X_{1} - X_{2}| \leq 0,01 \cdot r \cdot X_{\text{ср}} , где X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение. Значение r (предел повторяемости) приведено в таблице 2.

При превышении r испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.2 Воспроизводимость

Пробу делят на две равные части. Расхождение между результатами двух определений ( X_{1} , X_{2} ), выполненными разными операторами в разное время с использованием различных реактивов и оборудования, считают удовлетворительным, если |X_{1} - X_{2}| \leq 0,01 \cdot R \cdot X , где X — среднеарифметическое значение. Значение R (предел воспроизводимости) приведено в таблице 2.

При превышении R испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.3 Контроль погрешности результатов испытаний

Контроль погрешности (точности) результатов испытаний проводят методом добавок. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют стандарт витамина D_{3} в количестве, составляющем 50% — 150% от исходного содержания компонента в пробе, и проводят испытания в соответствии с настоящим стандартом.

Результаты испытаний признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой доли витамина D_{3} в добавке не превышает норматива оперативного контроля погрешности K_{\text{доб}} , \text{млн}^{- 1} :

|X_{\text{доб}} - X_{\text{ср}} - c_{\text{доб}}| \leq K_{\text{доб}} , (8)

где X_{\text{доб}} — среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы с добавкой, \text{млн}^{- 1} ;

X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы без внесения добавки, \text{млн}^{- 1} ;

c_{\text{доб}} — массовая доля добавки, \text{млн}^{- 1} .

При проведении внутрилабораторного контроля значение K_{\text{доб}} рассчитывают (при доверительной вероятности 90%) по формуле

K_{\text{доб}} = 0,84 \cdot \frac{\delta}{100} \cdot \sqrt{X_{\text{доб}}^{2} + X_{\text{ср}}^{2}} , (9)

где \delta — значение границы относительной погрешности определения массовой доли витамина D_{3} , указанное в таблице 2.

При проведении межлабораторного контроля значение K_{\text{доб}} рассчитывают (при доверительной вероятности 95%) по формуле

11.4 Контроль стабильности результатов при реализации методики в лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя метод контроля стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3) с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений должны быть предусмотрены в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 (подраздел 4.2) и ГОСТ Р 8.563 (пункт 7.1.1).

БИБЛИОГРАФИЯ

1. ПВ 10-115-96 Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением

2. ГФ СССР X, ст. 34 Эфир медицинский

3. ГФ СССР X, ст. 6 Кислота аскорбиновая (витамин C)

4. ФС 42-2668-95 Кислота аскорбиновая (витамин C)

------------------------------------------------------------------