ГОСТ Р 54635-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина A

(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2011 № 784-ст)

от 12 декабря 2011 г. № 784-ст

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА A

Functional food products. Method of vitamin A determination

ГОСТ Р 54635-2011

Группа Н59

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом № 184-ФЗ «О техническом регулировании» от 27 декабря 2002 г., а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».

Сведения о стандарте

1. Разработан Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 36 «Функциональные пищевые продукты».

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2011 г. № 784-ст.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на функциональные пищевые продукты и устанавливает метод определения массовой доли витамина A в виде ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой доли витамина A составляет от 0,5 до 10,0\text{млн}^{- 1} .

Примечание. Настоящий стандарт допускается распространять на пищевые продукты при условии соблюдения диапазона измерений.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27025-86 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52349, а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1. Содержание витамина A: массовая доля ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в миллионных долях (\text{млн}^{- 1}) .

4. Сущность метода

Определение витамина A в экстракте, полученном из анализируемой пробы, проводят разделением методом ВЭЖХ с последующим фотометрическим или флуориметрическим детектированием. При необходимости экстракт получают после щелочного гидролиза анализируемой пробы.

Количественный анализ проводят методом внешнего стандарта с использованием площади или высоты пиков ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола.

5. Требования безопасности

5.1 Условия безопасного проведения работ

При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования пожарной безопасности, установленные ГОСТ 12.1.004, электробезопасности — ГОСТ Р 12.1.019, техники безопасности при работе с реактивами — ГОСТ 12.1.007, а также требования, изложенные в технической документации на спектрофотометр, хроматограф, другие приборы и оборудование.

Помещение, в котором проводят испытания, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны следует проводить в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005.

При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться [1].

5.2 Требования к квалификации оператора

К выполнению испытаний и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием по профессиям: химик, инженер-химик, техник, лаборант, с опытом работы в химической лаборатории. Первое применение метода в лаборатории следует проводить под наблюдением квалифицированного специалиста в области ВЭЖХ.

6. Условия выполнения испытания

6.1 Общие условия

Испытания проводят в нормальных лабораторных условиях: температура окружающей среды — (25 +/- 5) °C; относительная влажность — (65 +/- 15)%; частота переменного тока — (50 +/- 5) Гц; напряжение в сети — (220 +/- 10) В.

При приготовлении и хранении растворов следует выполнять требования ГОСТ 27025, ГОСТ 4517.

Для предотвращения разрушения витамина A анализ испытуемого материала и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, пирогаллола), предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

6.2 Условия фотометрических измерений

Условия фотометрических измерений приведены в таблице 1.

Таблица 1

Условия фотометрических измерений

Витамин A	Растворитель	Длина волны, нм	Удельный коэффициент поглощения E_{1\text{см}}^{1\%}
Ретинол	Этанол	325	1832
Ретинола ацетат	Этанол	328	1550
Ретинола пальмитат	2-пропанол	328	975

6.3 Условия хроматографического анализа

Температура хроматографической колонки: 25 °C или температура окружающей среды.

Скорость потока подвижной фазы: 0,7 см3/мин (ориентировочное значение).

Объем вводимой пробы: 50 \cdot 10^{- 3}\text{см}^{3} .

Подвижная фаза: смесь ацетонитрила, метилового спирта, метилена хлористого в объемном соотношении 50:45:5.

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения осуществляют путем хроматографического анализа смешанного раствора ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола с массовой концентрацией каждого вещества не менее 0,4 мкг/см3. Данный смешанный раствор готовят из основных растворов ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола по аналогии с методикой приготовления рабочих растворов по 8.1.2. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения соседних пиков ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других колонок.

7. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

7.1. Для определения содержания массовой доли витамина A применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

• весы по ГОСТ Р 53228, обеспечивающие точность взвешивания с пределами допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,1 мг;
• спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 190 до 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%;
• кюветы кварцевые с длиной оптического пути 1 см;
• хроматограф высокоэффективный жидкостный, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода проб; флуориметрический детектор (длины волн, нм: возбуждения — 325 нм, эмиссии — 470 нм) или спектрофотометрический детектор (длина волны детектирования — 325 нм) с уровнем шумов не более 10^{- 4} единиц оптической плотности и относительной погрешностью измерений не более 10%; колонку аналитическую для ВЭЖХ диаметром 0,30 — 0,46 см, длиной 10 — 25 см, заполненную октадецилсиликагелем с размером частиц 5 мкм; регистрирующее устройство — интегратор или самописец, позволяющий проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1%; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;
• фильтры для фильтрования подвижной фазы и анализируемых растворов (например, с размером пор 0,45 мкм);
• микрошприц типа «Гамильтон» вместимостью 0,1 см3 для ввода проб в жидкостный хроматограф;
• пипетки градуированные 1(2, 3)-1(2)-1-0,5(1, 2, 5, 10, 25) по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более +/- 1%;
• цилиндры 1-50(100, 250)-1(2) по ГОСТ 1770;
• колбы мерные 2-50(100, 250, 500, 1000)-2 по ГОСТ 1770;
• пробирки мерные с притертыми пробками П-2-5(10, 15, 20, 25)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770;
• стаканы В(Н)-1-50(100, 150, 250)ТХС по ГОСТ 25336;
• колбы круглодонные К-1-100(250, 500)-29/32ТС по ГОСТ 25336;
• воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС по ГОСТ 25336;
• линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427;
• встряхиватель для колб и пробирок с диапазоном частот колебаний платформ 100 — 150 колебаний в минуту;
• центрифуга, обеспечивающая 4 — 6 тыс. об/мин;
• баня водяная с регулятором нагрева, поддерживающая температуру от 40° до 100 °C;
• баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм3;
• испаритель ротационный с диапазоном рабочего давления от 7 мм рт. ст. до 760 мм рт. ст. (от 9 \cdot 10^{2}\text{Па} до 10 \cdot 10^{4}\text{Па} ) или насос водоструйный по ГОСТ 25336;
• холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;
• термометр лабораторный жидкостный диапазоном температур от 0 °C до 100 °C, ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498;
• баллон с газообразным азотом по ГОСТ 9293, ос.ч., и по [1];
• бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026;
• плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919;
• мельница лабораторная электрическая;
• холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

• спирт этиловый абсолютный (C_{2}H_{5}OH) массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
• спирт этиловый ректификованный (C_{2}H_{5}OH) массовой долей основного вещества не менее 96% или по ГОСТ Р 51652, ГОСТ 18300;
• спирт метиловый (CH_{3}OH) массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
• ацетонитрил (CH_{3}CN) массовой долей основного вещества не менее 99,8%;
• метилен хлористый (CH_{2}Cl_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99,8%;
• н-гексан (C_{6}H_{14}) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• этилацетат (C_{4}H_{8}O_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 8981;
• пропанол-2 (C_{3}H_{8}O) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• эфир петролейный, перегнанный при температуре (50 +/- 10) °C, очищенный от перекисей;
• эфир диэтиловый, очищенный от перекисей, содержащий 0,1% пирогаллола, по [2];
• калия гидроокись (KOH) по ГОСТ 24363, х.ч. или ч.д.а., раствор KOH массовой долей 50%;
• натрий сернокислый (Na_{2}SO_{4}) безводный массовой долей основного вещества не менее 99,5% или по ГОСТ 4166, х.ч.;
• воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
• кислоту аскорбиновую (C_{6}H_{8}O_{6}) по [3] или [4], х.ч.;
• гидрохинон (C_{6}H_{6}O_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 19627;
• пирогаллол (C_{6}H_{6}O_{3}) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• бутилгидрокситолуол (C_{15}H_{24}O) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• ретинол M(C_{20}H_{30}O) = 286,5\text{г}/\text{моль} , массовой долей основного вещества не менее 90%;
• ретинола ацетат M(C_{22}H_{32}O_{2}) = 328,5\text{г}/\text{моль} , массовой долей основного вещества не менее 90% или по [5];
• ретинола пальмитат M(C_{36}H_{60}O_{2}) = 524,9\text{г}/\text{моль} , массовой долей основного вещества не менее 90% или по [6].

7.3. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

8. Подготовка к выполнению измерений

8.1. Приготовление растворов

8.1.1 Основные стандартные растворы

Растворяют около 50 мг ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в 50 см3 абсолютного этилового спирта. Массовая концентрация ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в растворе составляет примерно 1,0 мг/см3. Далее 2 см3 раствора ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) с помощью пипетки помещают в мерную колбу объемом 50 см3 и доводят до метки спиртом этиловым абсолютным. Массовая концентрация соединений в полученных основных стандартных растворах составляет примерно 40 мкг/см3.

8.1.2 Градуировочные растворы

Из основных стандартных растворов готовят не менее четырех градуировочных растворов ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в диапазоне массовых концентраций 0,4 — 4,0 мкг/см3 путем точного разведения основных стандартных растворов спиртом этиловым абсолютным в мерной колбе вместимостью 50 см3.

Определение массовой концентрации ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата), c (мкг/см3), проводят после измерения оптической плотности градуировочных растворов в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см на спектрофотометре при оптимальной длине волны и вычисляют по формуле

где A — значение оптической плотности градуировочного раствора;

E_{1\text{см}}^{1\%} — значение оптической плотности градуировочного раствора в абсолютном этиловом спирте или 2-пропаноле массовой концентрации 1 г в 100 см3 при толщине поглощающего слоя 1 см, приведенное в таблице 1;

10^{4} — коэффициент пересчета;

K — коэффициент, учитывающий поглощение сопутствующих компонентов при измерении A, вычисляемый по формуле

где S_{\text{ст}} — площадь пика стандартного вещества при проведении ВЭЖХ анализа, mAU \cdot \text{с} (AU \cdot \text{с}) ;

S_{\text{общ}} — сумма площадей пиков сопутствующих компонентов при проведении ВЭЖХ анализа стандартного вещества, mAU \cdot \text{с} (AU \cdot \text{с}) .

Все растворы в ходе приготовления и анализа тщательно защищают от воздействия ультрафиолетового излучения. Растворы ретинола хранят при температуре ниже 4 °C в течение 2 мес. Свежеприготовленные растворы ретинола ацетата или ретинола пальмитата используют для измерений в течение 2 — 3 ч при комнатной температуре.

8.2. Отбор и подготовка проб

8.2.1. Отбор проб проводят по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 26809, ГОСТ Р 52062, ГОСТ Р 52179.

8.2.2. Крупные частицы средней пробы, выделенной методом квартования из лабораторной пробы, измельчают с использованием подходящего оборудования (например, лабораторной мельницы) до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.

8.2.3. Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды 1% и менее, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

2 — 5 г анализируемой пробы переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3, растворяют в 10 — 15 см3 н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Раствор доводят до метки н-гексаном. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения н-гексаном. Затем аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте.

8.2.4. Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды не более 20%, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

2 — 5 г анализируемой пробы растворяют при интенсивном перемешивании в 10 — 15 см3 н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Удаляют избыток воды добавлением безводного сульфата натрия. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр для отделения нерастворившегося осадка. Колбу промывают дважды 5 см3 н-гексана. Фильтраты собирают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Раствор доводят до метки н-гексаном. Затем аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте.

8.2.5 Другие пищевые продукты, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

Для проведения щелочного гидролиза 1 — 30 г анализируемой пробы сухого или жидкого материала помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 — 500 см3. К сухому материалу добавляют 5 — 20 см3 воды и нагревают на водяной бане при температуре 60 °C — 70 °C при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 50 — 150 см3 этилового ректификованного спирта (или метилового спирта), 0,2 — 1,0 г антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, бутилгидрокситолуола), 4 — 40 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 15 — 45 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 80 °C — 100 °C.

Рекомендуемые соотношения испытуемого материала и реактивов приведены в таблице 2.

Таблица 2

Массовая доля витамина A, \text{млн}^{- 1}	Навеска испытуемого материала, г	Объем этанола, см3	Объем 50%-ного раствора KOH, см3
От 0,1 — 1,0 включ.	15 — 30	100	40
Св. 1,0 — 5,0 включ.	5 — 15	60	20
Св. 5,0 — 10,0 включ.	1 — 5	30	4

При проведении щелочного гидролиза при комнатной температуре в течение не менее 16 ч используют вышеуказанные соотношения материала и реактивов.

Если после охлаждения на поверхности смеси остается слой масла или жира, то объем добавленного раствора KOH и время проведения щелочного гидролиза увеличивают.

После окончания гидролиза содержимое колбы быстро охлаждают до (20 +/- 5) °C и количественно переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают водой, объем которой равен объему добавленного этилового спирта (или метилового), и воду сливают в ту же воронку. Витамин A экстрагируют диэтиловым (или петролейным) эфиром, н-гексаном, н-гексаном с добавкой диэтилового (или петролейного) эфира в объемном соотношении 1:1 в течение двух минут. Для учета возможной неполной экстракции витамина A следует использовать метод добавок стандартов.

Экстракцию повторяют три-четыре раза порциями экстрагента 50 — 100 см3. Объединенный экстракт отмывают от щелочи три-четыре раза порциями воды 50 — 150 см3 до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге).

Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2 — 5 г безводного сульфата натрия. Далее экстракт упаривают досуха, используя роторный испаритель при температуре не выше 50 °C и затем перерастворяют в элюенте. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения.

Раствор, полученный по 8.2.3 (8.2.4, 8.2.5), анализируют методом ВЭЖХ. Массу анализируемой пробы и объем растворителя подбирают таким образом, чтобы концентрация определяемых веществ в анализируемом растворе находилась в диапазоне от 0,4 до 4,0 мкг/см3.

8.3. Подготовка жидкостного хроматографа

Подготовку жидкостного хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонку промывают элюентом.

8.4. Построение градуировочной зависимости

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования. Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов, приготовленных по 8.1.2.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» — «массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см3». Для каждого анализируемого градуировочного раствора проводят два параллельных измерения и находят среднеарифметическое значение. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и значениями времени удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых массовых концентраций витамина A.

Коэффициент градуировочного графика k_{\text{гр}} , мкг/см3/ (mAU \cdot \text{с}) или мкг/см3/ (AU \cdot \text{с}) , определяют как среднеарифметическое значение коэффициентов k_{i} , вычисляемых по формуле

k_{i} = \frac{C_{i}}{S_{i}} , (3)

где C_{i} — массовая концентрация стандартных веществ в i-м градуировочном растворе, мкг/см3;

S_{i} — площадь (высота) аналитического сигнала при анализе i-го градуировочного раствора, mAU \cdot \text{с} (AU \cdot \text{с}) , или высота пика, мм.

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверной аппроксимации R^{2} \geq 0,997 .

Градуировка проводится в следующих случаях: на этапе освоения метода, при изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

9. Выполнение измерений

В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов. В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора. Концентрацию витамина A (C_{\text{гр}}) в растворе, используемом для градуировки, уточняют в день его использования по 8.1.2.

Для идентификации пиков сопоставляют время удерживания ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) испытуемого раствора и раствора стандарта, а также добавляют к испытуемому раствору раствор стандарта с близким содержанием витамина A.

10. Обработка и оформление результатов

Массовую долю витамина A X, \text{млн}^{- 1} , вычисляют по формулам:

X = \frac{k_{\text{гр}} \cdot S_{\text{обр}} \cdot V}{m} , (4)

где k_{\text{гр}} — коэффициент градуировочного графика по 8.4;

S_{\text{обр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов испытуемого раствора, mAU \cdot \text{с} (AU \cdot \text{с}) , или высота пика, мм;

V — объем разведения, см3;

m — масса анализируемой пробы, г.

С использованием градуировочного раствора

X = \frac{C_{\text{гр}} \cdot S_{\text{обр}} \cdot V}{S_{\text{гр}} \cdot m} , (5)

где C_{\text{гр}} — массовая концентрация градуировочного раствора, мкг/см3;

V — объем разведения, см3;

S_{\text{обр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов испытуемого раствора, mAU \cdot \text{с} (AU \cdot \text{с}) , или высота пика, мм;

m — масса анализируемой пробы, г;

S_{\text{гр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов градуировочного раствора, mAU \cdot \text{с} (AU \cdot \text{с}) , или высота пика, мм.

Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы.

Расхождение между результатами двух параллельных измерений X_{1} , X_{2} (в процентах от среднего значения X_{\text{ср}} ), выполненных одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать r (предел повторяемости приведен в таблице 3) с доверительной вероятностью P = 95%.

Таблица 3

Метрологические характеристики

Метрологическая характеристика (P = 0,95)	Диапазон измерений массовой доли, \text{млн}^{- 1}
	От 0,5 до 5,0 включ.	Св. 5,0 до 10,0 включ.
Стандартное отклонение повторяемости s_{r} , %	5,4	4,3
Предел повторяемости r, %	15	12
Стандартное отклонение воспроизводимости s_{R} , %	8,9	7,1
Предел воспроизводимости R, %	25	20
Границы относительной погрешности ( \pm \delta) , %	20	15
Предел обнаружения, \text{млн}^{- 1}	0,1

При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение X_{\text{ср}} .

Границы относительной погрешности определения массовой доли витамина A ( \pm \delta) в процентах от результата испытания и при доверительной вероятности 95% не должны превышать значений, указанных в таблице 3.

X_{\text{ср}} \pm \Delta,\text{млн}^{- 1}\text{при }P = 95\% , (6)

где X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, \text{млн}^{- 1} ;

\Delta — значение границы абсолютной погрешности определений, \text{млн}^{- 1} , вычисляемое по формуле

\Delta = \frac{\delta \cdot X_{\text{ср}}}{100} . (7)

Результаты испытаний заносят в протокол, в котором указывают:

• вид, происхождение и название пробы;
• способ и дату отбора пробы;
• дату поступления и испытания пробы;
• результаты исследования;
• причины отклонений в процедуре определения от установленных условий.

11. Метрологические характеристики метода

11.1 Повторяемость

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений ( X_{1} , X_{2} ), выполненных одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, считают удовлетворительным, если |X_{1} - X_{2}| \leq 0,01 \cdot r \cdot X_{\text{ср}} , где X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение, r — предел повторяемости (расхождение между двумя параллельными определениями, выполненными в условиях повторяемости). Значение r приведено в таблице 3.

При превышении предела повторяемости (сходимости) испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.2 Воспроизводимость

Пробу делят на две равные части. Расхождение между результатами двух определений ( X_{1} , X_{2} ), выполненных разными операторами в разное время с использованием различных реактивов и оборудования, считают удовлетворительным, если |X_{1} - X_{2}| \leq 0,01R \cdot X , где X — среднеарифметическое значение, R — предел воспроизводимости (расхождение между двумя определениями, выполненными в условиях воспроизводимости). Значение R приведено в таблице 3.

При превышении предела воспроизводимости испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.3 Контроль погрешности результатов испытаний

Контроль погрешности (точности) результатов испытаний проводят методом добавок. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют стандарт витамина A в количестве, составляющем 50% — 150% от исходного содержания компонента в пробе, и проводят испытания в соответствии с настоящим стандартом.

Результаты испытаний признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой доли витамина A в добавке не превышает норматива контроля погрешности K_{\text{доб}} , \text{млн}^{- 1} :

где X_{\text{доб}} — среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы с добавкой, \text{млн}^{- 1} ;

X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы без внесения добавки, \text{млн}^{- 1} ;

c_{\text{доб}} — массовая доля добавки, \text{млн}^{- 1} .

При проведении внутрилабораторного контроля значение K_{\text{доб}} вычисляют (при доверительной вероятности 90%) по формуле

где \delta — значение границы относительной погрешности определения массовой доли витамина A, указанное в таблице 3.

При проведении внешнего контроля значение K_{\text{доб}} вычисляют (при доверительной вероятности 95%) по формуле

K_{\text{доб}} = \frac{\delta}{100} \sqrt{X_{\text{доб}}^{2} + X_{\text{ср}}^{2}} . (10)

11.4 Контроль стабильности результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя метод контроля стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3) с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений должны быть предусмотрены в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 (подраздел 4.2) и ГОСТ Р 8.563 (пункт 7.1.1).

БИБЛИОГРАФИЯ

1. ПВ 10-115-96 Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением

2. ГФ СССР X, ст. 34 Эфир медицинский

3. ГФ СССР X, ст. 6 Кислота аскорбиновая (витамин C)

4. ФС 42-2668-95 Кислота аскорбиновая (витамин C)

5. ГФ СССР X, ст. 578 Ретинола ацетат

6. ФС 42-2229-84 Ретинола пальмитат

------------------------------------------------------------------