ГОСТ Р 54634-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина E

(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2011 № 783-ст)

от 12 декабря 2011 г. № 783-ст

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА E

Functional food products. Method of vitamin E determination

ГОСТ Р 54634-2011

Группа Н59

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом № 184-ФЗ «О техническом регулировании» от 27 декабря 2002 г., а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».

Сведения о стандарте

1. Разработан Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 36 «Функциональные пищевые продукты».

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2011 г. № 783-ст.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на функциональные пищевые продукты и устанавливает метод определения массовой доли витамина E в виде \alpha - , \beta - , \gamma - , \delta - \text{токоферолов} , ацетата \alpha - \text{токоферола} с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой доли витамина E составляет от 5 до 500\text{млн}^{- 1} .

Примечание. Настоящий стандарт допускается распространять на пищевые продукты при условии соблюдения диапазона измерений.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27025-86 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52349, а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1. Содержание витамина E: массовая доля токоферолов ( \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} , ацетата \alpha - \text{токоферола} ), определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в миллионных долях, \text{млн}^{- 1} .

Примечание. При вычислении содержания витамина E в единицах токофероловых эквивалентов (один токофероловый эквивалент соответствует 1 мг d - \alpha - \text{токоферола} ), количество мг токоферолов следует умножить на соответствующий коэффициент пересчета: для dl - \alpha - \text{токоферола} — 0,74, dl - \alpha - \text{токоферола} ацетата — 0,67, d - \beta - \text{токоферола} — 0,5, d - \gamma - \text{токоферола} — 0,1, d - \delta - \text{токоферола} — 0,03.

4. Сущность метода

Определение витамина E в экстракте, полученном из анализируемой пробы, проводят разделением токоферолов методом нормально-фазной (далее — НФ) или обращенно-фазной (далее — ОФ) ВЭЖХ с последующим фотометрическим или флуориметрическим детектированием. При необходимости экстракт получают после щелочного гидролиза анализируемой пробы.

Количественный анализ проводят методом внешнего стандарта с использованием площади или высоты пиков токоферолов.

5. Требования безопасности

5.1 Условия безопасного проведения работ

При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования пожарной безопасности, установленные ГОСТ 12.1.004, электробезопасности — ГОСТ Р 12.1.019, техники безопасности при работе с реактивами — ГОСТ 12.1.007, а также требования, изложенные в технической документации на спектрофотометр, хроматограф, другие приборы и оборудование.

Помещение, в котором проводят испытания, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны следует проводить в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005.

При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться [1].

5.2 Требования к квалификации оператора

6. Условия выполнения испытания

6.1 Общие условия

Испытания проводят в нормальных лабораторных условиях: температура окружающей среды — (25 +/- 5) °C; относительная влажность — (65 +/- 15)%; частота переменного тока — (50 +/- 5) Гц; напряжение в сети — (220 +/- 10) В.

При приготовлении и хранении растворов следует выполнять требования ГОСТ 27025, ГОСТ 4517.

Для предотвращения разрушения токоферолов анализ испытуемого материала и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, пирогаллола), предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

6.2 Условия фотометрических измерений

Таблица 1

Условия фотометрических измерений

Токоферолы	Растворитель	Длина волны, нм	Удельный коэффициент поглощения E_{1\text{см}}^{1\%}
\alpha - \text{токоферол}	Метанол	292	76
\beta - \text{токоферол}	Метанол	296	89
\gamma - \text{токоферол}	Метанол	298	91
\delta - \text{токоферол}	Метанол	298	87
Ацетат \alpha - \text{токоферола}	Этанол	285	44

6.3 Условия хроматографического анализа

Температура хроматографической колонки: 25 °C или окружающей среды.

Скорость потока подвижной фазы: 0,7 см3/мин (ориентировочное значение).

Объем вводимой пробы: от 10 \cdot 10^{- 3} до 50 \cdot 10^{- 3}\text{см}^{3} .

Подвижная фаза для ОФ ВЭЖХ: смесь ацетонитрила, метилового спирта, метилена хлористого в объемном соотношении 50:45:5.

Подвижная фаза для НФ ВЭЖХ: смесь н-гексана и 2-пропанола в объемном соотношении 98:2.

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения осуществляют путем хроматографического анализа смешанного раствора токоферолов с массовой концентрацией каждого токоферола не менее 10 мкг/см3. Данный раствор готовят из основных растворов \alpha - (\beta - ,\gamma - \text{и }\delta - )\text{токоферола} и ацетата \alpha - \text{токоферола} по аналогии с методикой приготовления рабочих растворов по 8.1.2. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения соседних пиков токоферолов (за исключением пиков \beta - и \gamma - \text{токоферолов} , которые не разделяются в режиме ОФ ВЭЖХ) составляет 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других колонок.

7. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

7.1. Для определения содержания массовой доли витамина E применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

• весы по ГОСТ Р 53228, обеспечивающие точность взвешивания с пределами допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,1 мг;
• спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 190 до 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%;
• кюветы кварцевые с длиной оптического пути 1 см;
• хроматограф высокоэффективный жидкостный, включающий следующие элементы: насос, устройство для ввода проб, колонку аналитическую для НФ ВЭЖХ диаметром 0,30 — 0,46 см, длиной 10 — 25 см, заполненную силикагелем или силикагелем, модифицированным диол-, CN- или NH_{2} - \text{группами} , или колонку аналитическую для ОФ ВЭЖХ диаметром 0,30 — 0,46 см, длиной 10 — 25 см, заполненную октадецилсиликагелем с размером частиц 5 мкм; флуориметрический детектор (длины волн, нм: возбуждения — 295 нм, эмиссии — 330 нм) или спектрофотометрический детектор (длина волны детектирования — 292 нм) и погрешностью измерений не более 10% отн.; регистрирующее устройство: интегратор или самописец, позволяющий проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1%; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;
• фильтры для фильтрования подвижной фазы и анализируемых растворов (например, с размером пор 0,45 мкм);
• микрошприц типа «Гамильтон» вместимостью 0,1 см3 для ввода проб в жидкостный хроматограф;
• пипетки градуированные 1(2, 3)-1(2)-1-0,5(1, 2, 5, 10, 25) по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более +/- 1%;
• цилиндры 1-50(100, 250)-1(2) по ГОСТ 1770;
• колбы мерные 2-50(100, 250, 500, 1000)-2 по ГОСТ 1770;
• пробирки мерные с притертыми пробками П-2-5(10, 15, 20, 25)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770;
• стаканы В(Н)-1-50(100, 150, 250)ТХС по ГОСТ 25336;
• колбы круглодонные К-1-100(250, 500)-29/32ТС по ГОСТ 25336;
• воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС по ГОСТ 25336;
• линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427;
• встряхиватель для колб и пробирок с диапазоном частот колебаний платформ 100 — 150 колебаний в минуту;
• центрифуга, обеспечивающая 4 — 6 тыс. об/мин;
• баня водяная с регулятором нагрева, способная поддерживать температуру от 40 °C до 100 °C;
• баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм3;
• испаритель ротационный с диапазоном рабочего давления от 7 до 760 мм рт. ст. (от 9 \cdot 10^{2} до 10 \cdot 10^{4}\text{Па} ) или насос водоструйный по ГОСТ 25336;
• холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;
• термометр лабораторный жидкостный, диапазон измерений от 0 °C до 100 °C, цена деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498;
• баллон с газообразным азотом по ГОСТ 9293, ос.ч., или по [1];
• бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026;
• плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919;
• мельница лабораторная электрическая;
• холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

• спирт этиловый абсолютный (C_{2}H_{5}OH) массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
• спирт этиловый ректификованный (C_{2}H_{5}OH) массовой долей основного вещества не менее 96% или по ГОСТ Р 51652, ГОСТ 18300;
• спирт метиловый (CH_{3}OH) массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
• ацетонитрил (CH_{3}CN) массовой долей основного вещества не менее 99,8%;
• метилен хлористый (CH_{2}Cl_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99,8%;
• н-гексан (C_{6}H_{14}) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• этилацетат (C_{4}H_{8}O_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 8981;
• 2-пропанол (C_{3}H_{8}O) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• эфир петролейный, перегнанный при температуре (50 +/- 10) °C, очищенный от перекисей;
• эфир диэтиловый, очищенный от перекисей, содержащий 0,1% пирогаллола по [2];
• калия гидроокись (KOH) по ГОСТ 24363, х.ч. или ч.д.а., раствор KOH массовой долей 50%;
• натрий сернокислый (Na_{2}SO_{4}) безводный массовой долей основного вещества не менее 99,5% или по ГОСТ 4166, х.ч.;
• воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
• кислоту аскорбиновую (C_{6}H_{8}O_{6}) по [3] или [4], х.ч.;
• гидрохинон (C_{6}H_{6}O_{2}) массовой долей основного вещества не менее 99% или по ГОСТ 19627;
• пирогаллол (C_{6}H_{6}O_{3}) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• бутилгидрокситолуол (C_{15}H_{24}O) массовой долей основного вещества не менее 99%;
• \alpha - \text{токоферол} M(C_{29}H_{50}O_{2}) = 430,7\text{г}/\text{моль} массовой долей основного вещества не менее 95%;
• \alpha - \text{токоферола} ацетат M(C_{31}H_{52}O_{3}) = 472,7\text{г}/\text{моль} массовой долей основного вещества не менее 95% или по [5], или по [6];
• \beta - \text{токоферол} M(C_{28}H_{48}O_{2}) = 416,7\text{г}/\text{моль} массовой долей основного вещества не менее 90%;
• \gamma - \text{токоферол} M(C_{28}H_{48}O_{2}) = 416,7\text{г}/\text{моль} массовой долей основного вещества не менее 90%;
• \delta - \text{токоферол} M(C_{27}H_{46}O_{2}) = 402,7\text{г}/\text{моль} массовой долей основного вещества не менее 90%.

7.3. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

8. Подготовка к выполнению измерений

8.1. Приготовление растворов

8.1.1 Исходные растворы стандартов

8.1.1.1. Исходные растворы стандартов токоферолов готовят растворением около 10 мг \alpha - \text{токоферола} ( \beta - \text{токоферола} , \gamma - \text{токоферола} , \delta - \text{токоферола} ) в 100 см3 метилового спирта. Массовые концентрации \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} составляют 0,1 мг/см3.

8.1.1.2. Исходные растворы стандартов ацетата \alpha - \text{токоферола} готовят растворением около 20 мг \alpha - \text{токоферола} ацетата в 100 см3 этилового спирта абсолютного (для проведения ОФ хроматографии) или в 100 см3 н-гексана (для проведения НФ хроматографии). Массовая концентрация ацетата \alpha - \text{токоферола} составляет 0,2 мг/см3.

8.1.1.3. Определение концентрации стандартных веществ в исходных растворах (c, мкг/см3) проводят после измерения их оптической плотности при оптимальной длине волны на спектрофотометре и вычисляют по формуле

где A — оптическая плотность стандартного раствора;

E_{1\text{см}}^{1\%} — оптическая плотность раствора стандартных веществ в метиловом спирте или этиловом спирте абсолютном массовой концентрации 1 г в 100 см3 при толщине поглощающего слоя 1 см, представленная в таблице 1;

10^{6} — коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

100 — коэффициент пересчета на 1 см3.

8.1.2 Рабочие растворы стандартов

8.1.2.1. Из исходных растворов готовят не менее четырех рабочих растворов каждого ( \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - ) токоферола в диапазоне концентрации 1 — 10 мкг/см3 при использовании флуориметрического детектора. Для этого точный объем 1 — 10 см3 исходного раствора \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферола} , приготовленного по 8.1.1.1 для НФ или ОФ ВЭЖХ, с помощью пипетки или дозатора помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки соответствующим растворителем (н-гексаном для анализа в варианте НФ ВЭЖХ и метиловым спиртом — для ОФ ВЭЖХ). Если анализ проводят с помощью спектрофотометрического детектора, концентрация \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферола} в градуировочных растворах должна находиться в диапазоне 2 — 20 мкг/см3. Для этого точный объем 2 — 20 см3 исходного раствора \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферола} , приготовленного по 8.1.1.1 для НФ или ОФ ВЭЖХ, помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки соответствующим растворителем (н-гексаном для анализа в варианте НФ ВЭЖХ и метиловым спиртом — для ОФ ВЭЖХ).

8.1.2.2. Из исходных растворов готовят не менее четырех рабочих растворов \alpha - \text{токоферола} ацетата в диапазоне концентрации 5 — 50 мкг/см3 при использовании спектрофотометрического детектора. Для этого точный объем 2,5 — 25 см3 исходного раствора, приготовленного по 8.1.1.2 для НФ или ОФ ВЭЖХ, с помощью пипетки или дозатора помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки соответствующим растворителем (н-гексаном для анализа в варианте НФ ВЭЖХ и метиловым спиртом — для ОФ ВЭЖХ). Если анализ проводят с помощью флуориметрического детектора, из исходных растворов готовят не менее четырех градуировочных растворов \alpha - \text{токоферола} ацетата в диапазоне концентрации 20 — 100 мкг/см3. Для этого точный объем 10 — 50 см3 исходного раствора \alpha - \text{токоферола} ацетата, приготовленного по 8.1.1.2 для НФ или ОФ ВЭЖХ, с помощью пипетки или дозатора помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки соответствующим растворителем (н-гексаном для анализа в варианте НФ ВЭЖХ и метиловым спиртом — для ОФ ВЭЖХ).

Все растворы в ходе приготовления и анализа защищают от воздействия ультрафиолетового излучения. Растворы токоферолов хранят при температуре не выше 4 °C в течение 2 мес.

8.2. Отбор и подготовка проб

8.2.1. Отбор проб проводят по нормативным документам на конкретные виды продукции и по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 26809, ГОСТ Р 52062, ГОСТ Р 52179.

8.2.2. Крупные частицы средней пробы, выделенной методом квартования из лабораторной пробы, измельчают с использованием подходящего оборудования (например, лабораторной мельницы) до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.

8.2.3. Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды не более 1%, обогащенные \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолами} , а также ацетатом \alpha - \text{токоферола}

2 — 5 г анализируемой пробы переносят в мерную колбу на 25 см3, растворяют в 10 — 15 см3 н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Раствор доводят до метки н-гексаном. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения н-гексаном.

8.2.4. Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды не более 20%, обогащенные \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолами} , а также ацетатом \alpha - \text{токоферола}

2 — 5 г анализируемой пробы переносят в колбу и растворяют при интенсивном перемешивании в 10 см3 н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Удаляют избыток воды добавлением безводного сульфата натрия. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр для отделения нерастворившегося осадка. Колбу промывают дважды 5 см3 н-гексана. Фильтраты собирают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Раствор доводят до метки н-гексаном.

8.2.5. Другие пищевые продукты, обогащенные \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолами} , а также ацетатом \alpha - \text{токоферола}

Для проведения щелочного гидролиза 5 — 20 г анализируемой сухой или жидкой пробы помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 — 500 см3. К сухому материалу добавляют 5 — 20 см3 воды и нагревают на водяной бане при температуре от 60 °C до 70 °C при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 50 — 150 см3 этилового ректификованного спирта, 0,2 — 2,0 г антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, бутилгидрокситолуола), 3 — 40 см3 50% раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 15 — 40 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 80 °C — 100 °C. Рекомендуемые соотношения испытуемой пробы и реактивов приведены в таблице 2.

Массовая доля витамина E, \text{млн}^{- 1}	Навеска испытуемого материала, г	Объем этанола, см3	Объем 50%-ного раствора KOH, см3
От 5 до 100 включ.	10 — 20	150	40
Св. 100 до 1000 включ.	5 — 10	100	15
Св. 1000 до 5000 включ.	1 — 5	50	3

Если после охлаждения на поверхности смеси остается слой масла или жира, то объем добавленного раствора KOH и время щелочного гидролиза увеличивают.

После окончания гидролиза содержимое колбы быстро охлаждают до (20 +/- 5) °C и количественно переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают водой, объем которой равен объему добавленного этилового спирта, и воду сливают в ту же воронку. Токоферолы экстрагируют диэтиловым (или петролейным) эфиром, этилацетатом, н-гексаном, н-гексаном с добавкой диэтилового (или петролейного) эфира в объемном соотношении 1:1 в течение 2 мин. Если в качестве экстрагента используется н-гексан или н-гексан с добавкой диэтилового (или петролейного) эфира, то для учета возможной неполной экстракции токоферолов следует применять метод добавок стандартов.

Экстракцию повторяют три-четыре раза порциями экстрагента 50 — 100 см3. Объединенный экстракт отмывают от щелочи три-четыре раза порциями воды 50 — 150 см3 до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге).

Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2 — 5 г безводного сульфата натрия. Далее экстракт упаривают досуха, используя роторный испаритель, и перерастворяют в н-гексане. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения.

8.2.6. Раствор, полученный по 8.2.3 (8.2.4, 8.2.5), анализируют методом НФ ВЭЖХ. Для анализа методом ОФ ВЭЖХ аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте для ОФ ВЭЖХ. Навеску испытуемого материала и объем растворителя подбирают таким образом, чтобы массовая концентрация токоферолов в анализируемом растворе находилась в диапазоне, соответствующем диапазону массовых концентраций рабочих растворов стандартных веществ, используемых при построении градуировочного графика по 8.4.

8.3. Подготовка жидкостного хроматографа

Подготовку жидкостного хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонку промывают элюентом.

8.4. Построение градуировочной зависимости

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя по программному обеспечению. Проводят хроматографический анализ не менее четырех рабочих растворов витамина E, приготовленных по 8.1.2.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» — «массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см3». Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднеарифметическое значение. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций витамина E. Коэффициент градуировочного графика ( k_{\text{гр}} , мкг/см3/ (mAU \cdot \text{с}) или мкг/см3/ (AU \cdot \text{с}) ) определяют как среднеарифметическое значение коэффициентов k_{i} , вычисляемых по формуле

k_{i} = \frac{C_{i}}{S_{i}} , (2)

где C_{i} — массовая концентрация стандартных веществ в i-м градуировочном растворе, мкг/см3;

S_{i} — площадь аналитического сигнала при анализе i-го градуировочного раствора, mAU \cdot \text{с} или AU \cdot \text{с} .

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверной аппроксимации R^{2} \geq 0,997 .

Градуировка проводится в следующих случаях: на этапе освоения метода, при изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

9. Выполнение измерений

В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов. В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора. Концентрацию витамина E (C_{\text{гр}}) в растворе, используемом для градуировки, уточняют в день его использования по 8.1.1.3.

Для идентификации пиков сопоставляют время удерживания \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} , ацетата \alpha - \text{токоферола} испытуемого раствора и раствора стандарта, а также добавляют к испытуемому раствору раствор стандарта с близким содержанием соответствующего токоферола.

10. Обработка и оформление результатов

Массовую долю \alpha - , \beta - , \gamma - и \delta - \text{токоферолов} , ацетата \alpha - \text{токоферола} X, \text{млн}^{- 1} , вычисляют с использованием градуировочной зависимости по формуле

X = \frac{k_{\text{гр}} \cdot S_{\text{обр}} \cdot V}{m} , (3)

где k_{\text{гр}} — коэффициент градуировочного графика по 8.4;

S_{\text{обр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений площади пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов испытуемого раствора, mAU \cdot \text{с} или AU \cdot \text{с} ;

V — объем разведения, см3;

m — масса анализируемой пробы, г.

С использованием градуировочного раствора

X = \frac{C_{\text{гр}} \cdot S_{\text{обр}} \cdot V}{S_{\text{гр}} \cdot m} , (4)

где C_{\text{гр}} — массовая концентрация градуировочного раствора, мкг/см3;

S_{\text{гр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов градуировочного раствора, мм2 (мм).

Результат вычисляют до второго десятичного знака и округляют до первого десятичного знака.

При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы.

Расхождение между результатами двух параллельных измерений X_{1} , X_{2} (в процентах от среднего значения X_{\text{ср}} ), выполненных одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать r (предел повторяемости приведен в таблице 3) с доверительной вероятностью P = 95%.

Таблица 3

Метрологические характеристики

Метрологическая характеристика (P = 0,95)	Диапазон измерений массовой доли, \text{млн}^{- 1}
	от 5 до 100 включ.	св. 100 до 500 включ.
Стандартное отклонение повторяемости s_{r} , %	5,4	4,3
Предел повторяемости r, %	15	12
Стандартное отклонение воспроизводимости s_{R} , %	8,9	7,1
Предел воспроизводимости R, %	25	20
Границы относительной погрешности ( \pm \delta) , %	20	15
Предел обнаружения, \text{млн}^{- 1}	1

При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение X_{\text{ср}} .

Границы относительной погрешности определения массовой доли витамина E ( \pm \delta) в процентах от результата испытания и при доверительной вероятности P = 95% не должны превышать значений, указанных в таблице 3.

X_{\text{ср}} \pm \Delta,\text{млн}^{- 1},P = 95\% , (5)

где X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, \text{млн}^{- 1} ;

\Delta — значение границы абсолютной погрешности определений, \text{млн}^{- 1} , вычисляемое по формуле

\Delta = \frac{\delta X_{\text{ср}}}{100} . (6)

Результаты испытаний заносят в протокол, в котором указывают:

• вид, происхождение и название пробы;
• способ и дату отбора пробы;
• дату поступления и испытания пробы;
• результаты исследования;
• причины отклонений в процедуре определения от установленных условий.

11. Метрологические характеристики метода

11.1 Повторяемость

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений ( X_{1} , X_{2} ), выполненных одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, считают удовлетворительным, если |X_{1} - X_{2}| \leq 0,01 \cdot r \cdot X_{\text{ср}} , где X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение. Значение r (предел повторяемости) приведено в таблице 3.

При превышении норматива оперативного контроля сходимости испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.2 Воспроизводимость

Пробу делят на две равные части. Расхождение между результатами двух определений ( X_{1} , X_{2} ), выполненных разными операторами в разное время с использованием различных реактивов и оборудования, считают удовлетворительным, если |X_{1} - X_{2}| \leq 0,01 \cdot R \cdot X , где X — среднеарифметическое значение. Значение R (предел воспроизводимости) приведено в таблице 3.

При превышении норматива оперативного контроля воспроизводимости испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.3 Контроль погрешности результатов испытаний

Контроль погрешности (точности) результатов испытаний проводят методом добавок. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют стандарт витамина E в количестве, составляющем 50% — 150% от исходного содержания компонента в пробе, и проводят испытания в соответствии с настоящим стандартом.

Результаты испытаний признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой доли витамина E в добавке не превышает норматива оперативного контроля погрешности K_{\text{доб}} , \text{млн}^{- 1} :

где X_{\text{доб}} — среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы с добавкой, \text{млн}^{- 1} ;

X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы без внесения добавки, \text{млн}^{- 1} ;

c_{\text{доб}} — массовая доля добавки, \text{млн}^{- 1} .

При проведении внутрилабораторного контроля значение K_{\text{доб}} рассчитывают (при доверительной вероятности 90%) по формуле

где \delta — значение границы относительной погрешности определения массовой доли витамина E, указанное в таблице 3.

При проведении внешнего контроля значение K_{\text{доб}} рассчитывают (при доверительной вероятности 95%) по формуле

K_{\text{доб}} = \frac{\delta}{100} \cdot \sqrt{X_{\text{доб}}^{2} + X_{\text{ср}}^{2}} . (9)

11.4 Контроль стабильности результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя метод контроля стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3) с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений должны быть предусмотрены в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 (подраздел 4.2) и ГОСТ Р 8.563 (пункт 7.1.1).

БИБЛИОГРАФИЯ

1. ПВ 10-115-96 Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением

2. ГФ СССР X, ст. 34 Эфир медицинский

3. ГФ СССР X, ст. 6 Кислота аскорбиновая (витамин C)

4. ФС 42-2668-95 Кислота аскорбиновая (витамин C)

5. ФС 42-2495-87 Токоферола ацетат

7. ГФ СССР X, ст. 695 Токоферола ацетат (витамина E ацетат)

------------------------------------------------------------------