ГОСТ Р 53162-2008 (ИСО 16050:2003). Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. и введен в действие Приказом Ростехрегулирования от 18.12.2008 № 600-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 53162-2008"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-53162-2008" "ГОСТ Р 53162-2008. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых... (утв. и в"
  n1["ГОСТ 31748-2012"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-31748-2012" "ГОСТ 31748-2012. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНА B1 И ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ АФЛАТОКСИНОВ B1, B2, G1 и G2 В ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУРАХ, ОРЕХАХ И ПРОДУКТАХ ИХ ПЕРЕРАБОТКИ

МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

(ИСО 16050:2003) Foodstuffs. Determination of aflatoxin B1 and the total content of aflatoxin B1, B2, G1 and G2 in cereals, nuts and derived products High-performance liquid chromatographic method (MOD)

ГОСТ Р 53162-2008

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».

Сведения о стандарте

1. Подготовлен ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») на основе русской версии стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность».

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 декабря 2008 г. № 600-ст.

4. Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 16050:2003 «Продукты пищевые. Определение афлатоксина B_{1} и общего содержания афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1} и G_{2} в зерновых культурах, орехах и продуктах переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии» (ISO 16050:2003 «Foodstuffs — Determination of aflatoxin B_{1} and the total content of aflatoxin B_{1}, B_{2}, G_{1} and G_{2} in cereals, nuts and derived products — High-performance liquid chromatographic method»). При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст национального стандарта, приведены для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации и выделены курсивом.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации, сведения о которых приведены в дополнительном Приложении B.

5. Введен впервые.

#Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.#

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

#Настоящий стандарт устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой, с очисткой на иммуноаффинной колонке и послеколоночной дериватизацией, для определения афлатоксинов в зерновых культурах, орехах и продуктах переработки.

Предел количественного определения афлатоксина B_{1} и суммы афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1} и G_{2} — 8 мкг/кг.#

Данный метод применим в отношении кукурузы с содержанием 24,5 мкг/кг, арахисового масла с содержанием 8,4 мкг/кг и сырых арахисовых орехов с содержанием 16 мкг/кг общей суммы афлатоксинов. Метод допускается использовать для масличных культур, сушеных фруктов и продуктов их переработки.

#Настоящий стандарт допустимо использовать только после уточнения условий измерений в конкретной лаборатории, валидации полученной процедуры измерений применительно к решению поставленной аналитической задачи (к конкретным объектам, конкретным диапазонам измерений и т.п.), разработки документа на методику и ее аттестации в соответствии с ГОСТ Р 8.563.#

2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

#В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 8.563-96 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696-1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4159-79 Реактивы. Йод. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 22524-77 Пикнометры стеклянные. Технические условия

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.#

Анализируемый образец экстрагируют смесью метанола и воды. Экстракт образца фильтруют, разбавляют водой и вводят в колонку для аффинной хроматографии, содержащую антитела, специфичные для афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1} и G_{2}. Афлатоксины выделяют, очищают и концентрируют на колонке, после чего отделяют от антител при помощи метанола. Афлатоксины определяют количественно при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой с определением флуоресценции и послеколоночной дериватизацией.

4. РЕАКТИВЫ

#При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок квалификации х.ч. или ч.д.а.#

4.1. Вода, соответствующая #не ниже 1-й степени по ГОСТ Р 52501.

Вода не должна содержать органические примеси.#

4.2 Хлорид натрия #по ГОСТ 4233.#

4.3 Йод кристаллический по #ГОСТ 4159.#

4.4 Афлатоксин, кристаллический или в виде пленочной ампулы.

Предупреждение. Афлатоксины канцерогенны для человека. Следует принимать во внимание заявление, сделанное Международным агентством по исследованиям в области рака (ВОЗ) (см. [1], [2]).

Необходимо надлежащим образом предохранять лабораторию, в которой проводятся анализы, от дневного света. Для этого закрывают окна фольгой, поглощающей ультрафиолетовое излучение. Допускается использовать в комбинации с затемненным освещением (когда отсутствует прямое солнечное освещение) занавески или шторы в комбинации с искусственным освещением.

4.5 Ацетонитрил, степень чистоты для ВЭЖХ.

4.6 Метанол, #ГОСТ 6995,# степень чистоты ВЭЖХ.

4.7 Толуол, #ГОСТ 5789.#

Предупреждение. Толуол огнеопасен и токсичен. Приготовление стандартов с использованием данного растворителя следует проводить в вытяжном шкафу. Операции за пределами вытяжного шкафа, такие как измерение эталонов методом УФ спектрометрии, следует проводить с использованием эталонов в закрытых контейнерах.

4.8 Смесь толуол/ацетонитрил

Смешивают 98 объемных частей толуола (4.7) с двумя объемными частями ацетонитрила (4.5) (см. предупреждение в 4.7).

4.9 Растворитель для экстракции

Смешивают семь объемных частей метанола (4.6) с тремя объемными частями воды (4.1).

Другие смеси — растворители для экстракции, которые совместимы с подвижной фазой, могут также использоваться, если покажут себя более эффективными или будут рекомендованы производителем иммуноаффинной колонки.

4.10 Подвижная фаза

Смешивают три объемные части воды (4.1) с одной объемной частью ацетонитрила (4.5) и одной объемной частью метанола (4.6). Перед использованием проводят дегазацию раствора.

4.11 Реагент для послеколоночной дериватизации

Растворяют 100 мг йода (4.3) в 2 #см3# метанола (4.6). Добавляют 200 #см3# воды (4.1), перемешивают в течение 1 ч, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.8). Раствор готовят на неделю использования и хранят в темноте или в склянке из коричневого стекла. Перед использованием раствор встряхивают в течение 10 мин.

4.12 Основные стандартные растворы афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1} и G_{2}.

Предупреждение. Предохраняйте растворы, содержащие афлатоксины, от действия света (храните в темноте, используйте алюминиевую фольгу или затемненную стеклянную посуду).

Афлатоксины B_{1} B_{2}, G_{1}, и G_{2} растворяют по отдельности в смеси толуол/ацетонитрил (4.8), для получения индивидуальных растворов с массовой концентрацией вещества 10 мкг/#см3.#

Для определения точной концентрации афлатоксина в каждом исходном растворе регистрируют спектр поглощения при длинах волн от 330 до 370 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см (5.7), используя спектрометр (5.6). Рассчитывают концентрацию каждого афлатоксина \rho_{i}, мкг/#см3#, используя уравнение (1):

где \text{А}_{\text{макс}} — оптическая плотность, определяемая в максимуме спектра поглощения;

\text{М}_{i} — молекулярная масса каждого афлатоксина, г/моль;

\epsilon_{i} — коэффициент молярного поглощения каждого афлатоксина в смеси толуол/ацетонитрил.

Примечание. Это значение определено для раствора, который содержит c = 1 моль/дм3 афлатоксина и находится в кюветах с длиной оптического пути d = 1 см. Коэффициент молярного поглощения (\epsilon) применяют без единиц измерения, допускается применять уравнение A = \epsilon·c·d, ему соответствует единица измерений: \text{дм}^{3}·\text{моль}^{- 1}·\text{см}^{- 1};

d — длина оптического пути кюветы, см.

\text{М}_{i} и \epsilon_{i} приведены в таблице 1.

4.13 Основной стандартный раствор смеси афлатоксинов

Готовят исходный раствор, содержащий 500 нг/#см3# афлатоксина B_{1}, 125 нг/#см3# афлатоксина B_{2}, 250 нг/#см3# афлатоксина G_{1} и 125 нг/#см3# афлатоксина G_{2} в смеси толуол/ацетонитрил (4.8). При необходимости хранения раствора взвешивают колбу. Колбу плотно оборачивают алюминиевой фольгой и хранят при температуре около 4 °C. Непосредственно перед использованием колбу взвешивают снова и отмечают любые изменения в массе после хранения.

Примечание. Обычное воздействие УФ-излучения во время измерения оптической плотности не приводит к заметной конверсии с образованием продуктов фотолиза.

4.14 Градуировочный раствор смеси афлатоксинов

Каждую порцию основного стандартного раствора смеси афлатоксинов (4.13), как это указано в таблице 2, переносят в четыре мерные колбы вместимостью 2 #см3# (5.5). Растворы выпаривают до сухого остатка в токе азота при комнатной температуре. В каждую колбу добавляют 1 см3 метанола (4.6). Растворяют в нем сухой остаток, разбавляют раствор до метки водой (4.1) и перемешивают. Растворы готовят непосредственно в день использования.

4.15. Серная кислота по #ГОСТ 4204#, раствор c (H_{2}SO_{4}) = 2 моль/дм3.

5. ОБОРУДОВАНИЕ

Лабораторную стеклянную посуду, которая контактирует с водными растворами афлатоксинов в серной кислоте (4.15), погружают в воду на несколько часов, затем тщательно промывают (например, три раза) водой, чтобы удалить все следы кислоты. Отсутствие кислоты проверяют с помощью индикаторной бумаги.

Примечание. Данная обработка является необходимой, так как использование стеклянной посуды, промытой не кислотой, может привести к потере афлатоксинов. На практике данная обработка необходима для круглодонных колб, мерных колб, мерных цилиндров, склянок или пробирок, используемых для градуировочных растворов и конечных экстрактов (особенно автоматических пипеток), а также пастеровских пипеток, если они используются для переноса градуировочных растворов или экстрактов.

Обычное лабораторное оборудование и, в частности, то, которое приводится ниже.

5.1 Иммуноаффинная (IA) колонка

IA колонка содержит антитела, предназначенные для афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1} и G_{2}. Колонка должна иметь минимальную емкость не менее 100 нг афлатоксина B_{1} и должна давать выход не менее 80% для афлатоксинов B_{1}, B_{2} и G_{1} и не менее 60% для афлатоксина G_{2} при внесении в колонку 15 #см3# градуировочного раствора, содержащего 5 нг каждого афлатоксина в смеси метанол/вода [одна часть метанола (4.6) и три — четыре части воды (4.1) по объему]. Колонка должна быть оборудована подходящей емкостью для растворителя (например, шприцем с переходной насадкой).

5.2 Блендер, с баком смесителя на 500 мл и крышкой

Рекомендуется использование высокоскоростного блендера.

5.3 Рифленая фильтровальная бумага, например, диаметром 24 см.

5.4. Фильтровальная бумага из стеклянного микроволокна, например, диаметром 11 см.

5.5 Мерные колбы #по ГОСТ 1770#, вместимостью 2 #см3 или пикнометры по ГОСТ 22524.#

Примечание. При использовании пикнометров рекомендуется измерять фактическое значение вместимости и использовать его при обработке результатов измерений в качестве величины V_{5} [см. формулу (3)].

5.6. Спектрофотометр, #предназначенный для измерения оптической плотности в диапазоне# длин волн от 200 до 400 нм.

5.7. Кюветы из кварцевого стекла толщиной 1 см, не имеющие существенного поглощения в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм.

5.8. Мембранный фильтр для водных растворов, изготовленный из политетрафторэтилена, диаметром 4 мм и размером пор 0,45 мкм.

5.9 Оборудование для ВЭЖХ

5.9.1 Насос ВЭЖХ, способный производить скорость потока 1 #см3#/мин.

5.9.2. Система ввода (инжектор) со шприцевой загрузкой и петлей 50 мкл или эквивалентным.

5.9.3. Аналитическая разделяющая колонка с обращенной фазой, например, С18, которая обеспечивает разрешение пиков афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1} и G_{2} до базовой линии от всех остальных пиков и которая имеет следующие характеристики:

• длина: 250 мм;
• внутренний диаметр: 4,6 мм;
• размер сферических частиц: 5 мкм.

Допускается использование колонки меньшей длины.

5.9.4. Система послеколоночной дериватизации, состоящая из безпульсационного насоса и тройника, имеющего очень малый мертвый объем, системы труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали длиной от 3000 до 5000 мм и внутренним диаметром 0,5 мм, а также водяной бани или послеколоночного реактора для реакции с участием йода.

5.10. Флуоресцентный детектор, пригодный для работы при длине волны возбуждения 365 нм и излучении при длине волны эмиссии 435 нм (для фильтровых приборов длина волны регистрации излучения > 400 нм), #с пределом детектирования не более# 0,05 нг афлатоксина В1 в объеме ввода (в данном случае он равен 50 мкл).

6.1 Общие замечания

Растворы проб и стандартные растворы для определения с помощью ВЭЖХ должны содержать одинаковый растворитель или смесь растворителей.

6.2 Экстракция

Взвешивают 25 г гомогенизированной пробы, с точностью 0,1 г в сосуде блендера (см. 5.2). Добавляют 5 г хлорида натрия (см. 4.2) и 125 #см3# растворителя для экстракции (см. 4.10) и гомогенизируют с помощью перемешивающего устройства в течение 2 мин при высокой скорости. Контролируют, чтобы время и скорость перемешивания не оказывали негативного влияния на эффективность экстракции. Смесь фильтруют через рифленую фильтровальную бумагу (см. 5.3) (V_{1}).

Отбирают пипеткой 15 #см3# (V_{2}) фильтрата в коническую колбу подходящего размера со стеклянной пробкой. Добавляют 30 #см3# воды, закрывают колбу пробкой и перемешивают. Перед проведением аффинной колоночной хроматографии разбавленный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу из стеклянного микроволокна (5.4). Фильтрат (V_{3}) должен быть прозрачным. Если это не так, проводят повторную фильтрацию. Незамедлительно следуют процедурам в соответствии с 6.3.

Для получения прозрачного раствора можно также использовать центрифугу.

6.3 Очистка

Готовят IA колонку (см. 5.1) и осуществляют процедуру очистки в соответствии с инструкциями производителя. Отбирают пипеткой 15 #см3# (V_{4}) второго фильтрата (V_{3}) в емкость для растворителя IA колонки. Пропускают его через разделяющую колонку, затем промывают колонку, как это описано в инструкциях производителя, и удаляют элюаты. Начинают проводить элюирование афлатоксинов. Собирают этанольный или ацетонитрильный элюат (в зависимости от продукта или инструкций производителя) в мерной колбе вместимостью 2 #см3# (см. 5.5) (или другого объема, установленного производителем). Разбавляют до метки водой (V_{5}). Перемешивают и действуют в соответствии с 6.4.

Методы ввода в IA колонки, промывания и элюирования немного отличаются в зависимости от производителя колонки, и необходимо четко следовать конкретным инструкциям, прилагаемым к колонкам.

Примечание. В целом процедуры включают экстракцию образца смесью метанола и воды, фильтрацию или центрифугирование, возможное разбавление образца раствором фосфатного буфера или водой, загрузку под давлением в предварительно промытую колонку, промывку колонки дистиллированной водой и элюирование афлатоксинов метанолом или ацетонитрилом (в зависимости от продукта и инструкций производителя).

Допускается использовать традиционные колонки с силикагелем или колонки твердофазной экстракции. В этих случаях также необходимо четко следовать инструкциям производителя. Если растворитель, применяемый для элюирования афлатоксинов, несовместим с подвижной фазой, то элюат необходимо выпарить до сухого остатка в токе азота при температуре ниже 40 °C. Остаток необходимо растворить в подвижной фазе и разбавить до 2 #см3# или до того объема, который установлен производителем.

Необходимо предусмотреть, чтобы максимальная емкость колонки не была превышена.

6.4 Условия работы при выполнении ВЭЖХ

Выход разделительной колонки подсоединяют к одному ответвлению тройника системы послеколоночной дериватизации (5.9.4) с помощью короткого фрагмента системы труб с внутренним диаметром, например, 0,25 мм. Ко второму ответвлению тройника подсоединяют выход насоса, который поставляет реагент для послеколоночной дериватизации. Один конец витка труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали (см. 5.9.4) присоединяют к третьему ответвлению тройника и другой конец присоединяют к детектору (см. 5.10). Используя термостат или водяную баню, поддерживают температуру реакционного змеевика на уровне 70 °C.

В случае использования колонки, указанной в 5.9.3, подходящими являются следующие параметры:

• скорость потока подвижной фазы (колонка): 1,0 #см3#/мин;
• скорость потока послеколоночного реагента: 0,3 #см3#/мин;
• впрыскиваемый объем: 50 мкл.

Дают всей системе функционировать 10 — 20 мин для ее стабилизации. Если используется интегратор, настраивают регулировку чувствительности флуоресцентного детектора или интегратора, чтобы получить соответствующий сигнал: шум 5:1 для 0,125 нг афлатоксина G_{2} в 50 мкл. Если используется регистрирующий прибор с ленточной диаграммой, настраивают регулировку флуоресцентного детектора таким образом, чтобы получить для 0,125 нг афлатоксина G_{2} в 50 мкл от 30% до 40% шкалы #регистрирующего прибора.#

6.5 Идентификация

Проводят идентификацию каждого пика афлатоксина на хроматограмме образца путем сравнения значений времени удерживания со значениями соответствующих стандартов.

Афлатоксины можно идентифицировать одновременным вводом раствора испытуемой пробы и градуировочных растворов. Кроме того, при идентификации помогает исчезновение пиков афлатоксинов B_{1} и G_{1} в случае, когда не проводится добавка реагента для дериватизации.

6.6. #Построение градуировочной зависимости#

Для каждого афлатоксина строят градуировочную зависимость путем ввода 50 мкл стандартных растворов 1, 2, 3 и 4 (см. таблицу 2). Проверяют линейность зависимости (см. [3]).

6.7 Определение

Количественное определение проводится методом внешнего стандарта с интегрированием площади пика или измерением высоты пика, которые далее соотносятся с соответствующими значениями для стандарта.

В петлю инжектора вводят 50 мкл стандартного раствора в соответствии с инструкциями производителя инжектора. Афлатоксины элюируют в порядке G_{2}, G_{1}, B_{2} и B_{1} с временем удерживания приблизительно 6, 8, 9 и 11 мин соответственно. Пики должны быть разделены до базовой линии. При необходимости регулируют значения времени удерживания путем изменения концентрации метанола подвижной фазы (4.11).

Вводят 50 мкл (V_{6}) очищенного экстракта образца (см. 6.3) в инжекторную петлю.

Рассчитывают массу m_{t}, г, анализируемой пробы, присутствующей во фракции второго фильтрата, взятого для IA колонки (V_{4}), по формуле

где m_{0} — масса пробы образца (см. 6.2), г ( m_{0} = 25 г);

V_{1} — общий объем первого фильтрата (см. 6.2), #см3# ( V_{1} = 125 #см3#); <*>

V_{2} — объем фракции первого фильтрата (см. 6.2), взятый для разбавления, #см3# ( V_{2} = 15 #см3#);

V_{3} — общий объем второго фильтрата (см. 6.2), #см3# ( V_{3} = 45 #см3#);

V_{4} — объем фракции второго фильтрата (см. 6.3), #см3# ( V_{4} = 15 #см3#).

Рассчитывают массовую долю каждого афлатоксина w_{i}, в микрограммах на килограмм пробы, вычисляют по формуле (метод внешнего стандарта)

где V_{5} — объем элюата (6.3), мкл ( V_{5} = 2000 мкл);

V_{6} — объем очищенного и введенного экстракта образца (6.7), мкл ( V_{6} = 50 мкл);

m_{i} — масса #данного# афлатоксина, присутствующего в введенном объеме, соответствующая измеренной площади пика или высоте пика, определяемая по градуировочной характеристике, в нанограммах;

m_{t} — масса #анализируемой# пробы, г, соответствующей фракции второго фильтрата, взятого для IA колонки (V_{4}) [см. формулу (2)].

Для получения массовой доли суммы афлатоксинов суммируют массовые доли четырех афлатоксинов.

<*> Принимая во внимание данные по точности метода, V_{1} может рассматриваться как эквивалент объема растворителя экстракции.

8. ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

8.1 Межлабораторное сравнительное испытание

Детали межлабораторного сравнительного испытания прецизионности данного метода приведены в Приложении A. Значения, полученные в результате межлабораторного сравнительного испытания, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от тех, которые приведены в Приложении A.

8.2 Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными при использовании одного и того же метода, идентичных материалов для испытаний в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием того же оборудования в течение короткого интервала времени, будет превышать предел повторяемости r, значения которого приведены ниже, не более чем в 5% случаев.

a) Значения для кукурузы:

• афлатоксин B_{1}: \overline{x} = 14,9 мкг/кг, r = 2,4 мкг/кг,
• афлатоксин B_{2}: \overline{x} = 1,4 мкг/кг, r = 1,0 мкг/кг,
• афлатоксин G_{1}: \overline{x} = 7,2 мкг/кг, r = 1,9 мкг/кг,
• афлатоксин G_{2}: \overline{x} = 1,0 мкг/кг, r = 0,6 мкг/кг,
• общее содержание афлатоксинов: \overline{x} = 24,5 мкг/кг.

b) Значения для арахисового масла:

• афлатоксин B_{1}: \overline{x} = 5,3 мкг/кг, r = 2,2 мкг/кг,
• афлатоксин B_{2}: \overline{x} = 0,6 мкг/кг, r = 0,3 мкг/кг,
• афлатоксин G_{1}: \overline{x} = 2,3 мкг/кг, r = 1,5 мкг/кг,
• афлатоксин G_{2}: \overline{x} = 0,2 мкг/кг, r = 0,5 мкг/кг,
• общее содержание афлатоксинов: \overline{x} = 8,4 мкг/кг.

c) Значения для арахиса:

• афлатоксин B_{1}: \overline{x} = 9,7 мкг/кг, r = 1,5 мкг/кг,
• афлатоксин B_{2}: \overline{x} = 1,1 мкг/кг, r = 0,7 мкг/кг,
• афлатоксин G_{1}: \overline{x} = 4,5 мкг/кг, r = 0,8 мкг/кг,
• афлатоксин G_{2}: \overline{x} = 0,6 мкг/кг, r = 0,8 мкг/кг,
• общее содержание афлатоксинов: \overline{x} = 16 мкг/кг.

Основываясь на полученных результатах, содержание афлатоксинов в арахисовом масле можно только оценить. В случае кукурузы и арахисовых орехов афлатоксины B_{1} и G_{1} могут быть определены, а афлатоксины B_{2} и G_{2} могут быть только обнаружены, и их содержание может быть оценено качественно.

8.3 Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя отдельными результатами испытаний, полученными при использовании одинакового метода, идентичных материалов для испытаний, в различных лабораториях, различными операторами и с использованием различного оборудования, будет превышать предел воспроизводимости R, значения которого приводятся ниже, не более чем в 5% случаев.

a) Значения для кукурузы:

• афлатоксин B_{1}: \overline{x} = 14,9 мкг/кг, R = 4,2 мкг/кг,
• афлатоксин B_{2}: \overline{x} = 1,4 мкг/кг, R = 1,2 мкг/кг,
• афлатоксин G_{1}: \overline{x} = 7,2 мкг/кг, R = 1,9 мкг/кг,
• афлатоксин G_{2}: \overline{x} = 1,0 мкг/кг, R = 1,5 мкг/кг,
• общее содержание афлатоксинов: \overline{x} = 24,5 мкг/кг.

b) Значения для арахисового масла:

• афлатоксин B_{1}: \overline{x} = 5,3 мкг/кг, R = 4,4 мкг/кг,
• афлатоксин B_{2}: \overline{x} = 0,6 мкг/кг, R = 0,6 мкг/кг,
• афлатоксин G_{1}: \overline{x} = 2,3 мкг/кг, R = 2,0 мкг/кг,
• афлатоксин G_{2}: \overline{x} = 0,2 мкг/кг, R = 0,7 мкг/кг,
• общее содержание афлатоксинов: \overline{x} = 8,4 мкг/кг.

c) Значения для арахиса:

• афлатоксин B_{1}: \overline{x} = 9,7 мкг/кг, R = 4,5 мкг/кг,
• афлатоксин B_{2}: \overline{x} = 1,1 мкг/кг, R = 1,2 мкг/кг,
• афлатоксин G_{1}: \overline{x} = 4,5 мкг/кг, R = 1,8 мкг/кг,
• афлатоксин G_{2}: \overline{x} = 0,6 мкг/кг, R = 1,4 мкг/кг,
• общее содержание афлатоксинов: \overline{x} = 16 мкг/кг.

Основываясь на полученных результатах, содержание афлатоксинов в арахисовом масле можно только оценить качественно. В случае кукурузы и арахиса афлатоксины B_{1} и G_{1} могут быть определены, а афлатоксины B_{2} и G_{2} могут быть только обнаружены, и их содержание может быть оценено качественно.

9. ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ

Протокол испытаний должен содержать:

• всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;
• используемый метод отбора образцов, если он известен;
• используемый метод испытаний, со ссылкой на настоящий стандарт;
• детали проведения работ, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, а также все факторы, влияющие на результат(ы) испытаний;
• полученные результат(ы) испытаний или, если была проведена проверка повторяемости, полученный окончательный результат.

Нижеприведенные данные получены в процессе межлабораторного сравнительного испытания, которое проводилось в 1999 г. и было организовано АОАС и ИЮПАК (Международный союз теоретической и прикладной химии) в соответствии с #ГОСТ Р ИСО 5725-1.# Были исследованы образцы кукурузы, арахисовых орехов и арахисового масла, имеющие естественное загрязнение и зафиксированные на уровне 10, 20 и 30 мкг/кг общей суммы афлатоксинов с соотношением афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1}, и G_{2} — 7:1:3:1 соответственно.

В исследовании участвовало десять лабораторий, имелся один экземпляр каждого образца. Во время проведения данного межлабораторного сравнительного испытания в качестве реагента послеколоночной дериватизации использовался йод.

Среднее значение \overline{x}, мкг/кг 14,88 1,38 7,18 1,05 24,49

Стандартное отклонение сходимости s , 0,68 0,35 0,68 0,20 1,79 r мкг/кг

Коэффициент вариации сходимости, %          5,8    25   9,5     19   7,3
Предел сходимости r (r=2,8s ), мкг/кг       2,4   0,98  1,90   0,56  5,0

                       r

Стандартное отклонение воспроизводимости 1,50 0,41 0,68 0,53 2,86 s , мкг/кг R

Коэффициент вариации воспроизводимости, %    10    30   9,5     51  11,7
Предел воспроизводимости R (R=2,8S ),       4,20  1,15  1,90   1,48  8,01

                              R

мкг/кг

Выход, % 85 55 96 42 81

Среднее значение \overline{x}, мкг/кг 5,26 0,58 2,34 0,24 8,42

Стандартное отклонение сходимости 0,78 0,12 0,55 0,19 1,45 s , мкг/кг r

Коэффициент  вариации  сходимости, %   14,9    21      24     79      17
Предел   сходимости   r   (r=2,8s ),    2,2   0,34    1,54   0,53    4,06

                             r

мкг/кг

Стандартное               отклонение   1,56   0,22    0,71   0,24    2,54
воспроизводимости s  мкг/кг

               R

Коэффициент вариации 30 38 31 101 30 воспроизводимости, %

Предел воспроизводимости 4,37 0,62 1,99 0,67 7,11 R (R = 2,8s ), мкг/кг R

Выход, % 90 70 93 29 84

Среднее значение \overline{x}, мкг/кг 9,71 1,07 4,54 0,65 16

Стандартное отклонение сходимости 0,53 0,25 0,28 0,27 0,83 s , мкг/кг r

Коэффициент  вариации сходимости, %   5,5      23     6,2     42     5,2
Предел   сходимости   r  (r=2,8s ),
                                r     1,48    0,70    0,78   0,76    2,3

мкг/кг

Стандартное отклонение 1,62 0,41 0,66 0,5 2,58 воспроизводимости s , мкг/кг R

Коэффициент вариации 17 38 15 77 16 воспроизводимости, %

Предел воспроизводимости 4,54 1,15 1,85 1,4 7,22 R(R = 2,8R ), мкг/кг s

Выход, % 83 64 91 39 80

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Castegnaro M., Hunt D.C., Sansone Е.В., Schuller P.L, Siriwardana M.G., Telling G.M., van Egmond Н.Р. и Walker E.A. Лабораторная очистка и разрушение афлатоксинов B_{1} B_{2}, G_{1} и G_{2} в лабораторных отходах. Научная публикация IARC № 37, Международное агентство по исследованиям в области рака (ВОЗ), Лион (Франция), 1980 г., стр. 59

2. Castegnaro M., Barek J., Fremy J.M., Lafontaine M., Miraglia M., Sansone E.B. и Telling G.M. Лабораторная очистка и разрушение канцерогенов в лабораторных отходах: некоторые микотоксины. Публикация IARC № 113, Международное агентство по исследованиям в области рака (ВОЗ), Лион (Франция), 1991 г., стр. 63

3. Van Trijp J.M.P. и Roos A.H. Модель для расчета калибровочных кривых, доклад RIKILT, 91,02, январь 1991 г.

4. Trucksess M.W. и др. Иммуноаффинная колоночная хроматография

   в   сочетании   с   флуорометрией    раствора    или   послеколоночной
   дериватизацией  жидкой  хроматографии   для  определения  афлатоксинов
   в зерне, арахисе и арахисовом масле. Журнал Ассоциации  уполномоченных

химиков-аналитиков, 74 (1), 1991 г., стр. 81 — 88

5. ИСО 31-0:1992 Величины и единицы. Часть 0. Основные принципы

6. ЕН 12955:1999 Пищевые продукты. Определение афлатоксина B_{1} и общего содержания афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1} и G_{2} в зерновых

   культурах, плодах с кожурой  и  продуктах  переработки.
   Метод   высокоэффективной    жидкостной   хроматографии
   с    послеколоночной     дериватизацией    и    чисткой

иммуноаффинной колонки

7. ЕН 14123:2003 Пищевые продукты. Определение афлатоксина B_{1} и общего содержания афлатоксинов B_{1}, B_{2}, G_{1} и G_{2} в арахисе,

   фисташках,    инжире    и   порошке    паприки.   Метод
   высокоэффективной       жидкостной        хроматографии
   с    послеколоночной     дериватизацией    и    чисткой

иммуноаффинной колонки

------------------------------------------------------------------