ГОСТ 33607-2015. Межгосударственный стандарт. Мясо и мясные продукты. Определение бета-агонистов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором
(введен в действие Приказом Росстандарта от 03.03.2016 № 118-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности мяса птицы и продукции его переработки» (ТР ЕАЭС 051/2021) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 29.11.2022 № 188). Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 5, 2025. Документ введен в действие с 01.01.2017.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 3 марта 2016 г. № 118-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕТА-АГОНИСТОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТОРОМ
Meat and meat products. Determination of beta-agonists using high performance liquid chromatography with mass spectrometry detection
Дата введения 1 января 2017 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности имени В.М. Горбатова» (ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 октября 2015 г. № 81-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 3 марта 2016 г. № 118-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33607-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо, включая мясо птицы, печень и почки <*>, а также субпродукты, мясные и мясосодержащие продукты и устанавливает метод измерения (анализа) массового содержания бета-агонистов (кленбутерола, сальбутамола, рактопамина, тербуталина, сальметерола, тулобутерола, циматерола, мабутерола, мапентерола, зилпатерола) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/МС). Диапазон измерений бета-агонистов составляет от 0,1 до 100,0 мкг/кг.
<*> Настоящий стандарт распространяется на мясо, включая мясо птицы, печень и почки в части определения сальметерола, прочие бета-агонисты в мясе, мясе птицы, печени и почках определяют по ГОСТ 33486-2015.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 <**> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3760-79 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия
ГОСТ 4025-95 Мясорубки бытовые. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-2-2003 <*> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <**> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 7269-79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести
ГОСТ 7702.2.0-95 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям
ГОСТ 9245-79 Потенциометры постоянного тока измерительные. Общие технические условия
ГОСТ 9792-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия
ГОСТ 20469-95 Электромясорубки бытовые. Технические условия
ГОСТ 22300-76 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26272-98 Часы электронно-механические кварцевые наручные и карманные. Общие технические требования
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 28165-89 Приборы и аппараты лабораторные из стекла. Аквадистилляторы. Испарители. Установки ректификационные. Общие технические требования
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 бета-агонисты: Группа гормональных препаратов, стимулирующих \beta - \text{адренергические} рецепторы и используемых в качестве стимуляторов роста животных (кленбутерол, сальбутамол, рактопамин, тербуталин, сальметерол, тулобутерол, циматерол, мабутерол, мапентерол, зилпатерол).
3.2 супернатант: Жидкость, располагающаяся над твердым слоем (осадком, седиментом) после центрифугирования пробы.
3.3 элюент: Подвижная фаза (растворитель или смесь растворителей).
3.4 аналит: Компонент, искомый или определяемый в пробе.
4 Сущность метода
Метод основан на ферментативном гидролизе пробы, извлечении бета-агонистов смесью изопропилового спирта с этилацетатом и очистке пробы методом твердофазной экстракции (ТФЭ), и последующем ВЭЖХ-МС/МС анализе.
5 Требования безопасности
5.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
5.2 Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть оснащено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
5.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.
6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный, укомплектованный:
- трехквадрупольным масс-спектрометрическим детектором с источником ионизации распылением в электрическом поле (ESI)]
- изократическим насосом;
- хроматографической колонкой для ВЭЖХ длиной 50 — 150 мм и диаметром 2,1 — 4,6 мм с обращенной фазой C18 размером частиц 1,8 — 5,0 мкм;
- блоком термостатирования колонок с поддержанием температуры 40 °C с точностью +/- 0,1 °C;
- записывающим устройством с компьютерным управлением и автоматической программой обработки хроматографических данных в соответствии с комплектацией хроматографа.
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 специального (I) класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,001 г.
pH-метр по ГОСТ 9245 со стеклянным и хлорсеребряным электродами (или комбинированным стеклянным электродом) с диапазоном измерений от 0 до 14 ед. pH, с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,01 ед.
Баня водяная лабораторная, имеющая диапазон температур от 20 °C до 100 °C с точностью поддержания температуры +/- 0,5 °C.
Баня ультразвуковая лабораторная.
Вакуумная установка для твердофазной экстракции с регулировкой скорости потока.
Испаритель роторный по ГОСТ 28165.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по ГОСТ 20469.
Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.
Часы электронно-механические по ГОСТ 26272.
Центрифуга лабораторная, с центробежным ускорением 4000 g.
Банки стеклянные вместимостью 250 — 500 см3.
Пипетки градуированные 1-2-1-5, 1-2-1-10 по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с переменным объемом дозирования от 1 до 10 см3 и относительной погрешностью дозирования не более +/- 1%.
Пробирки центрифужные из полипропилена вместимостью 15 и 50 см3.
Фильтр мембранный из политетрафторэтилена с диаметром пор 0,45 мкм.
Колбы круглодонные К-1-50-29/32 по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 по ГОСТ 1770.
Цилиндр мерный 2-100-1 по ГОСТ 1770.
Колба коническая Кн-1-100(1000)-24/29 ТС по ГОСТ 25336.
Флаконы — виалы хроматографические из темного стекла вместимостью 2,0 см3.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Ацетат натрия по ГОСТ 199, ч.д.а.
Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч.
Кислота хлорная, с содержанием основного вещества не менее 70,0%.
Гидроокись натрия по ГОСТ 4328, х.ч.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.
Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, абсолютированный.
Этилацетат по ГОСТ 22300, х.ч.
Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, ч.д.а.
Аммиак водный по ГОСТ 3760, х.ч.
Кленбутерол с содержанием основного вещества не менее 95,0%.
Сальбутамол с содержанием основного вещества не менее 96,0%.
Рактопамин с содержанием основного вещества не менее 99,9%.
Тербуталин с содержанием основного вещества не менее 98,0%.
Сальметерол с содержанием основного вещества не менее 98,0%.
Тулобутерол с содержанием основного вещества не менее 99,9%.
Циматерол с содержанием основного вещества не менее 99,9%.
Мабутерол с содержанием основного вещества не менее 99,9%.
Мапентерол с содержанием основного вещества не менее 99,9%.
Зилпатерол с содержанием основного вещества не менее 98,0%.
Картриджи ТФЭ на основе полимерного катионообменного сорбента <*>.
<*> Примером патрона на основе полимерного катионообменного сорбента может быть патрон ТФЭ Agilent Bond Elut Plexa PCX 60 mg, 3 mL (N 12108603). Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования другой аппаратуры с аналогичными свойствами.
Бета-глюкуронидаза из виноградной улитки активностью 1000 ед./см3 <**>.
<**> Примером ферментативного препарата на основе бета-глюкуронидазы может быть \beta - Glucuronidase from Helixpomatia (SigmaG8885) CAS 9001-45-0. Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования другого препарата с аналогичными свойствами.
7 Отбор проб
7.1 Отбор проб по ГОСТ 9792, ГОСТ 7269, ГОСТ 7702.2.0.
7.2 Пробу измельчают, дважды пропуская через мясорубку с диаметром отверстий решетки 2 — 4 мм, и тщательно перемешивают.
7.3 Подготовленную пробу помещают в стеклянную банку вместимостью 250 — 500 см3 и закрывают крышкой.
Допускается хранить подготовленную пробу в замороженном состоянии без доступа кислорода при температуре не выше минус 18 °C не более 7 сут.
8 Подготовка к измерению
8.1 Приготовление растворов бета-агонистов
8.1.1 Приготовление индивидуальных растворов бета-агонистов с массовой концентрацией 0,1 мг/см3
Взвешивают 5,0 мг индивидуального бета-агониста (кленбутерола, сальбутамола, рактопамина, тербуталина, сальметерола, тулобутерола, циматерола, мабутерола, мапентерола, зилпатерола), переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят до метки метанолом.
Растворы хранят в холодильнике при температуре минус (18 +/- 2) °C в течение месяца.
8.1.2 Приготовление градуировочных растворов бета-агонистов
Для определения бета-агонистов из индивидуальных растворов массовой концентрации 0,1 мг/см3 готовят градуировочные растворы массовой концентрации 1000 нг/см3 (раствор 1), 500 нг/см3 (раствор 2), 100 нг/см3 (раствор 3), 50 нг/см3 (раствор 4), 10 нг/см3 (раствор 5).
Для приготовления раствора 1 градуированной пипеткой в мерные колбы вместимостью 100 см3 переносят соответственно по 1 см3 индивидуального раствора бета-агониста и доводят до метки 1%-ным раствором муравьиной кислоты (см. 8.2.8).
Для приготовления градуировочного раствора 2 в хроматографическую виалу переносят 0,5 см3 градуировочного раствора 1 и 0,5 см3 1%-ного раствора муравьиной кислоты (см. 8.2.8).
Для приготовления градуировочного раствора 3 в хроматографическую виалу переносят 0,1 см3 градуировочного раствора 1 и 0,9 см3 1%-ного раствора муравьиной кислоты (см. 8.2.8).
Для приготовления градуировочного раствора 4 в хроматографическую виалу переносят 0,5 см3 градуировочного раствора 3 и 0,5 см3 1%-ного раствора муравьиной кислоты (см. 8.2.8).
Для приготовления градуировочного раствора 5 в хроматографическую виалу переносят 0,1 см3 градуировочного раствора 3 и 0,9 см3 1%-ного раствора муравьиной кислоты (см. 8.2.8).
Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 7 сут.
8.2 Приготовление растворов
8.2.1 Приготовление раствора ацетата натрия молярной концентрации c(C2H3O2Na) = 0,2 моль/дм3 (pH = 5,2)
Взвешивают 1,64 г ацетата натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до метки. По каплям добавляют концентрированную уксусную кислоту, доводя pH до 5,2, контролируя pH-метром. Раствор помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см3.
8.2.2 Приготовление раствора хлорной кислоты молярной концентрации c(HClO4) = 0,1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 50 см3 приливают 30 — 40 см3 дистиллированной воды и добавляют 0,43 см3 хлорной кислоты (c = 70%, \rho = 1,67\text{г}/\text{см}^{3} ), доводят объем до метки дистиллированной водой.
8.2.3 Приготовление раствора гидроксида натрия молярной концентрации c(NaOH) = 10,0 моль/дм3
Взвешивают 20,0 г гидрооксида натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до метки.
8.2.4 Приготовление раствора хлорида натрия молярной концентрации c(NaCl) = 3,0 моль/дм3
Взвешивают 17,53 г хлорида натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до метки.
8.2.5 Приготовление раствора изопропилового спирта с этилацетатом (60:40)
В коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см3 с помощью мерного цилиндра приливают 60 см3 изопропилового спирта и 40 см3 этилацетата.
8.2.6 Приготовление 2%-ного раствора муравьиной кислоты в дистиллированной воде
В мерную колбу вместимостью 50 см3 приливают 40 см3 дистиллированной воды, добавляют 1 см3 муравьиной кислоты, перемешивают и доводят объем до метки дистиллированной водой.
8.2.7 Приготовление 5%-ного раствора аммиака в метаноле
В мерную колбу вместимостью 100 см3 приливают 90 см3 метанола, добавляют 5 см3 аммиака, перемешивают и доводят объем до метки метанолом.
8.2.8 Приготовление 1%-ного раствора муравьиной кислоты с метанолом (90:10)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 приливают 60 — 70 см3 дистиллированной воды, добавляют 1 см3 муравьиной кислоты и 10 см3 метанола, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.
8.2.9 Приготовление подвижной фазы хроматографической системы
Для проведения хроматографического анализа используется двухкомпонентная подвижная фаза:
В мерную колбу вместимостью 500 см3 приливают 450 см3 дистиллированной воды и добавляют 5 см3 муравьиной кислоты, перемешивают и доводят объем до метки дистиллированной водой;
В мерную колбу вместимостью 500 см3 приливают по 250 см3 ацетонитрила и метанола, раствор перемешивают.
Перед проведением анализа элюенты дегазируют на ультразвуковой бане.
Готовые растворы хранят в конических колбах с притертыми пробками вместимостью 1000 см3, при температуре (4 +/- 2) °C не более месяца.
8.3 Подготовка пробы
8.3.1 Выделение бета-агонистов из продукта
Пробу массой 5 г, взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3. Добавляют 20 см3 раствора ацетата натрия активной кислотностью 5,2 ед. pH, и тщательно перемешивают. Добавляют 0,250 см3 бета-глюкорнидазы, перемешивают и ставят на водяную баню при температуре 37 °C на 16 ч.
Гидролизат центрифугируют 5 мин с центробежным ускорением 4000 g. Далее 4 см3 супернатанта отбирают в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, добавляют 5 см3 раствора хлорной кислоты, доводят pH концентрированной хлорной кислотой до (1 +/- 0,3) ед. pH. Затем пробу центрифугируют в течение 10 мин. Супернатант переносят в пробирку вместимостью 50 см3, доводя pH до 11 раствором гидроксида натрия. В пробирку добавляют 10 см3 раствора хлорида натрия и 10 см3 смеси изопропилового спирта с этилацетатом, перемешивают, центрифугируют 5 мин. Органический слой изопропилового спирта с этилацетатом переносят в круглодонную колбу. Экстракцию повторяют дважды, экстракты объединяют и упаривают на роторном испарителе при 40 °C. Сухой остаток растворяют в 5 см3 раствора ацетата натрия активной кислотностью 5,2 ед. pH, и проводят процедуру твердофазной экстракции (ТФЭ).
8.3.2 Очистка пробы методом ТФЭ
Картриджи ТФЭ предварительно активируют, пропуская 3 см3 метанола, затем 3 см3 дистиллированной воды. Анализируемый раствор наносят на картридж со скоростью 1 см3/мин. Картридж промывают, пропуская 2 см3 дистиллированной воды и 2 см3 раствора 2%-ной муравьиной кислоты, отбрасывая смывы. Аналиты элюируют 5 см3 5%-ного раствора аммиака в метаноле со скоростью 1 см3/мин и переносят в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °C. К сухому остатку приливают 1 см3 смеси 1%-ной муравьиной кислоты с метанолом. Ставят на 5 мин на ультразвуковую баню до полного растворения остатка. Раствор пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу вместимостью 2 см3 для ВЭЖХ-МС/МС анализа.
9 Проведение измерений
9.1 Хроматографические условия измерений
Условия проведения ВЭЖХ-МС/МС анализа подбираются в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа, масс-спектрометрического детектора и хроматографической колонки.
В качестве примера могут быть приведены следующие условия определения бета-агонистов, выполненные на системе ВЭЖХ-МС/МС с хроматографической колонкой C18, 4,6 x 50 мм, 1,8 мкм.
Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление растворов элюентов по 8.1.2). Объем вводимой пробы — 0,01 см3.
| Время, мин | Соотношение компонентов подвижной фазы | Скорость потока, см3/мин | Температура колонки, °C | |
| A, % | B, % | |||
| 0 | 98 | 2 | 0,4 | 40 |
| 0,5 | 98 | 2 | 0,4 | 40 |
| 4 | 65 | 35 | 0,4 | 40 |
| 5 | 20 | 80 | 0,4 | 40 |
| 7 | 10 | 90 | 0,4 | 40 |
| 7,5 | 98 | 2 | 0,4 | 40 |
| 12 | 98 | 2 | 0,4 | 40 |
9.2 Параметры настройки масс-спектрометрического детектора
Для анализа подобраны следующие параметры масс-спектрометрического детектирования:
Температура источника — 100 °C;
Температура газа десольвации — 350 °C;
Скорость потока газа десольвации — 5 дм3/мин;
Давление иглы распылителя — 45 psi (3,1 Бар).
Условия регистрации аналитических сигналов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) представлены в таблице 2.
Параметры воздействия на ионы в режиме MRM и условия ионизации распылением в электрическом поле (ESI) с регистрацией положительных ионов
Условия детектирования оптимизируют в ручном режиме. Для этого используются градуировочные растворы индивидуальных веществ концентрации 1000, 500, 100, 50 и 10 нг/см3, приготовленных по 8.1. При этом, соотношение сигнал/шум (S/N) молекулярного иона должно быть не менее 1:10. Напряжение на фрагменторе оптимизируют с шагом 10V по максимальному отклику протонированного молекулярного иона.
Энергию диссоциации (CE) оптимизируют с шагом 5V по максимальному отклику характерного дочернего иона.
9.3 Градуировка ВЭЖХ-МС/МС системы
Приготовленные по 8.1 градуировочные растворы подвергают ВЭЖХ-МС/МС анализу в условиях, выбранных в соответствии с 9.1 - 9.2. Проводят по три параллельных измерения для каждой концентрации градуировочных растворов. Полученные хроматограммы обрабатывают с использованием компьютерной системы обработки данных хроматографа. Определяют абсолютное время удерживания бета-агонистов. С использованием средств программного обеспечения строят градуировочную зависимость площади пика бета-агониста, определяемую по сумме двух дочерних ионов, от концентрации аналита в градуировочном растворе.
Коэффициент линейной корреляции полученной градуировочной зависимости должен быть не менее 0,99. При невыполнении этого условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
Проведение градуировки обязательно при замене хроматографической колонки, а также при систематическом получении неудовлетворительных результатов контроля, выполняемого по разделу 12.
9.4 Контроль аналитической системы
Контроль выполняют с использованием приготовленных по 8.1 градуировочных растворов. Полученный результат анализа не должен отличаться от действительного значения концентрации определяемых веществ в градуировочном растворе более чем на 3%, относительное стандартное отклонение времени удерживания аналитов — не более чем на 5%. В случае невыполнения указанного критерия стабильности градуировочной характеристики проводят новую градуировку.
Контроль аналитической системы осуществляется при условиях, указанных в 9.1, 9.2 перед началом проведения измерений, а также при смене хроматографической колонки, чистке блоков аналитического прибора и т.д.
9.5 Выполнение измерений
Для контроля фона прибора, перед началом серии измерений, между анализами проб в хроматограф вводят 2 мм3 подвижной фазы (A — 98%, B — 2%).
В виалы вместимостью 2 см3 вносят подготовленную пробу по 8.3 и анализируют на системе ВЭЖХ-МС/МС при условиях, указанных в 9.1, 9.2.
По значению площади хроматографического пика с использованием установленной градуировочной характеристики и программы обработки данных находят массовую концентрацию бета-агонистов в анализируемой пробе.
Вычисление массовой доли бета-агонистов в анализируемой пробе экстракта проводят для каждого из двух параллельных определений по формуле (1).
10 Обработка результатов
Идентификацию аналитов осуществляют по абсолютному времени удерживания хроматографических пиков бета-агонистов, регистрируемых в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Содержание бета-агонистов определяют по площади хроматографических пиков анализируемых проб.
В соответствие с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, создают таблицу пиков с использованием программного обеспечения. Расчеты содержания соединения и площади пика выполняются системой обработки данных в автоматическом режиме.
Вычисление площади пика проводят для двух дочерних ионов (см. таблицу 2) для каждого соединения.
Массовую долю бета-агонистов X, мкг/кг, вычисляют по формуле
X = \frac{C_{\text{ст}} \cdot \Sigma S_{x} \cdot V_{\text{р}}}{\Sigma S_{\text{ст}} \cdot m} , (1)
где Cст — массовая концентрация индивидуального бета-агониста в градуировочном растворе, нг/см3;
\Sigma S_{x} — сумма площадей пиков двух дочерних ионов индивидуального бета-агониста в анализируемой пробе, усл. ед.;
Vр — объем раствора для растворения бета-агонистов после ТФЭ, см3;
\Sigma S_{\text{ст}} — сумма площадей пиков двух дочерних ионов индивидуального бета-агониста в градуировочном растворе, усл. ед.;
m — масса анализируемой пробы, г.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных измерений, округленное до второго десятичного знака.
Примечание — Массовую долю бета-агонистов выражают в мкг/кг, что равнозначно получаемой по формуле (1) размерности нг/г.
11 Метрологические характеристики
11.1 Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности P = 0,95 приведены в таблице 3.
11.2 Расхождение между результатами двух параллельных измерений, выполненных одним оператором при анализе одной и той же пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) r, значения которого приведены в таблице 3.
Условия приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, при доверительной вероятности P = 0,95, должны удовлетворять условию
где x1 и x2 — результаты двух параллельных измерений, мкг/кг;
r — предел повторяемости, мкг/кг.
11.3 Расхождение между результатами двух измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости R, значения которого приведены в таблице 1.
Условия приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, при доверительной вероятности P = 0,95, должны удовлетворять условию
где X1 и X2 - результаты двух измерений, выполненных в разных лабораториях, мкг/кг;
R — предел воспроизводимости, мкг/кг.
11.4 Границы относительной погрешности, находящиеся с доверительной вероятностью P = 0,95, при соблюдении условий настоящего стандарта, не должны превышать значений, приведенных в таблице 3.
12 Контроль точности результатов измерений
12.1 Процедуру контроля стабильности показателей качества результатов измерений (повторяемости, промежуточной прецизионности и погрешности) проводят в соответствии с порядком, установленным в лаборатории, по ГОСТ ИСО 5725-6.
12.2 Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости), осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-2. Расхождение между результатами измерений не должно превышать предела повторяемости (r). Значения r приведены в таблице 3.
12.3 Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-2. Расхождение между результатами измерений, полученными двумя лабораториями, не должно превышать предела воспроизводимости (R). Значения R приведены в таблице 3.
ХРОМАТОГРАММА ГРАДУИРОВОЧНЫХ РАСТВОРОВ БЕТА-АГОНИСТОВ (ОБЩИЙ ИОННЫЙ ТОК И MRM ПЕРЕХОДЫ)
A.1 Хроматограмма градуировочных растворов бета-агонистов (общий ионный ток и MRM переходы) приведена на рисунке A.1.
1 — тербуталин; 2 — циматерол; 3 — сальбутамол; 4 — рактопамин; 5 — тулобутерол; 6 — кленбутерол; 7 — мабутерол; 8 — зилпатерол; 9 — мапентерол; 10 — сальметерол