ГОСТ 32365-2013. Межгосударственный стандарт. Ароматизаторы пищевые. Методы определения содержания этилового спирта
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 № 1709-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 07.02.2018 № 21). Документ введен в действие с 01.07.2015.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1709-ст
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЭТИЛОВОГО СПИРТА
Food flavorings. Methods for determination of ethanol content
Дата введения 1 июля 2015 года
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИИПАКК» Россельхозакадемии), Федеральным государственным бюджетным учреждением «Научно-исследовательский институт питания» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ питания» РАМН)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 154)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 18 октября 2013 г. № 60-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1709-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32365-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
Настоящий стандарт распространяется на пищевые ароматизаторы и устанавливает газохроматографический и ферментативный методы определения содержания этилового спирта.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.0.004 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.2.007.0 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности
ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 12.4.103 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация
ГОСТ 427 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2493 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия
ГОСТ 2603 Реактивы. Ацетон. Технические условия
ГОСТ 3022 Водород технический. Технические условия
ГОСТ 3639 Растворы водно-спиртовые. Методы определения концентрации этилового спирта
ГОСТ 3769 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия
ГОСТ 4204 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 5955 Реактивы. Бензол. Технические условия
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9293 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия
ГОСТ 14618.5-78 Масла эфирные, вещества душистые и полупродукты их синтеза. Газохроматографический метод анализа
ГОСТ 17433 Промышленная чистота. Сжатый воздух. Классы загрязненности
ГОСТ 18300 <1> Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
<1> Утратил силу. Действует ГОСТ Р 55878-2013.
ГОСТ 20015 Хлороформ. Технические условия
ГОСТ 25794.1 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 29169 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 32049 Ароматизаторы пищевые. Общие технические условия
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 и ГОСТ 12.4.103.
3.2 Помещение, в котором проводят анализы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021.
3.3 Электробезопасность при работе с электроустановками — по ГОСТ 12.2.007.0 и по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
3.4 Организация обучения работающих безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
3.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
3.6 Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
3.7 При работе на газовом хроматографе необходимо соблюдать требования охраны труда и правила безопасности в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
Отбор проб — по ГОСТ 32049.
При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия: - температура окружающего воздуха от 10 °C до 35 °C; - относительная влажность воздуха от 40% до 95%;
Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.
Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.
6 Определение содержания этилового спирта методом газовой хроматографии
Настоящий метод предназначен для определения массовой доли этилового спирта в жидких ароматизаторах. Диапазон измерения массовой доли этилового спирта от 1,0% до 90,0%.
6.1 Сущность метода
Метод основан на хроматографическом разделении компонентов ароматизатора и этилового спирта на сорбенте и последующем детектировании этилового спирта пламенно-ионизационным детектором.
6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы
Весы со значением среднего квадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,3 мг и погрешностью от нелинейности +/- 0,6 мг.
Линейка с диапазоном измерений от 0 до 300 мм, погрешностью +/- 0,5 мм по ГОСТ 427.
Секундомер 2-го класса точности с емкостью шкалы счетчика 30 мин, ценой деления 0,20 с, погрешностью +/- 0,60 с.
Газовый хроматограф, оснащенный пламенно-ионизационным детектором с чувствительностью по нонану не менее 1·10-11 г/см3.
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 3 м, внутренним диаметром 2 мм.
Сорбент — 10% Карбовакса 20 М (полиэтиленгликоля молекулярной массой от 15 000 до 20 000) на Хроматоне N-AW-HMDS (стандартном диатомитовом носителе, обработанном гексаметилдисилазаном (CH3)3SiNHSi(CH3)3) зернением от 0,20 до 0,25 мм.
Газ-носитель — азот особой чистоты по ГОСТ 9293.
Водород технический марки А по ГОСТ 3022. Допускается использовать генераторы водорода.
Воздух сжатый по ГОСТ 17433. Допускается использовать компрессоры любого типа, обеспечивающие необходимое давление и чистоту воздуха.
Микрошприц вместимостью 1,0 мм3 (1 мкл), ценой деления не более 0,02 мм3 (0,02 мкл).
Флаконы (микровиалы) вместимостью 5 см3 с завинчивающимися крышками и тефлонированной уплотнительной мембраной.
Интегратор цифровой автоматический для обработки хроматограмм или компьютер с программным обеспечением.
Спирт этиловый ректификованный высшей очистки по ГОСТ 18300.
Бензол по ГОСТ 5955.
Хлороформ технический по ГОСТ 20015.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.
6.3 Подготовка к анализу
6.3.1 Заполнение газохроматографических колонок
Колонки перед заполнением промывают последовательно бензолом, хлороформом, ацетоном, затем высушивают.
Заполнение газохроматографической колонки осуществляют по ГОСТ 14618.5-78 (раздел 2).
Количество сорбента, израсходованное на заполнение колонки, составляет (4,7 +/- 0,2) г.
6.3.2 Кондиционирование колонок
Заполненную колонку устанавливают в термостат хроматографа, подсоединяя один конец к испарителю хроматографа.
Колонку продувают газом-носителем в течение 24 ч, увеличивая температуру термостата колонок ступенчато до 150 °C со скоростью нагрева 5 °C/ч.
После кондиционирования колонку соединяют с детектором и продувают до установления стабильной нулевой линии. Для стабилизации работы хроматографической колонки в нее вводят 5 — 7 доз по 0,5 мм3 анализируемой пробы.
Монтаж, наладку и вывод хроматографа на рабочий режим проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
6.3.3 Режим работы хроматографа:
- <a id="p100127"></a>начальная температура термостата колонок, °C ............. 50 +/- 2;
- <a id="p100128"></a>конечная температура термостата колонок, °C .............. 150 +/- 2;
- <a id="p100129"></a>продолжительность выдержки при 50 °C, мин ................ 6;
- <a id="p100130"></a>температура термостата испарителя, °C .................... 190 +/- 2;
- <a id="p100131"></a>скорость нагрева термостата, °C/мин ...................... 20;
- <a id="p100132"></a>температура детектора, °C ................................ 200 +/- 2;
- <a id="p100133"></a>объемная скорость газа-носителя, см3/мин ................. 30 +/- 1;
- <a id="p100134"></a>объемная скорость подачи водорода в детектор, см3/мин .... 30 +/- 2;
- <a id="p100135"></a>объемная скорость воздуха, см3/мин ....................... 300 +/- 3;
- <a id="p100136"></a>газ-носитель ............................................. Азот;
- <a id="p100137"></a>объем пробы, мм3 ......................................... От 0,05
до 1,00;
- <a id="p100138"></a>эффективность хроматографической колонки, число
теоретических тарелок/мм, не менее ....................... 2.
6.4 Градуировка прибора
Для градуировки прибора готовят не менее семи градуировочных смесей этилового спирта в воде.
Градуировку прибора проводят в интервале измерения массовой доли этилового спирта от 1,0% до 90,0%.
6.4.1 Приготовление градуировочных смесей
Градуировочные смеси готовят из этилового спирта объемной долей основного вещества не менее 96,2%. Объемную долю этилового спирта определяют по ГОСТ 3639.
Во флакон (микровиалу) вносят дистиллированную воду в соответствии с таблицей 1 и взвешивают на лабораторных весах. Затем добавляют этиловый спирт и снова взвешивают.
| Номер градуировочной смеси | Масса, г | |
| этилового спирта | дистиллированной воды | |
| 1 | 5,000 | 0,000 |
| 2 | 4,000 | 1,000 |
| 3 | 3,000 | 2,000 |
| 4 | 2,000 | 3,000 |
| 5 | 1,000 | 4,000 |
| 6 | 0,500 | 4,500 |
| 7 | 0,005 | 4,995 |
Срок хранения градуировочных смесей в герметично закрытых флаконах (микровиалах) при температуре от 4 °C до 10 °C — не более 2 мес.
6.4.2 Массовую долю этилового спирта в градуировочной смеси Cгр, %, вычисляют по формуле
C_{\text{гр}} = \frac{m_{i}}{m_{\text{гр}i}} 100, (1)
где mi — масса безводного этилового спирта в i-той градуировочной смеси, г;
mгрi — масса i-той градуировочной смеси, г;
100 — коэффициент перевода в %.
6.5 Построение графика градуировочной зависимости
Для построения калибровочного графика градуировочной зависимости каждую градуировочную смесь хроматографируют не менее пяти раз в условиях, указанных в 6.3.3, вводя в колонку через испаритель один и тот же объем пробы каждого раствора.
Регистрируют время удерживания и площадь пика этилового спирта при помощи автоматического интегратора или программного обеспечения.
Строят график зависимости площади пика от массовой доли этилового спирта. Общий вид градуировочного графика приведен на рисунке 1.
Рисунок 1 — Зависимость площади пика от массовой доли этилового спирта
Процедуру градуировки проводят периодически не менее одного раза в неделю, при постановке методики на хроматограф, после ремонта хроматографа.
6.6 Проведение анализа
Анализируемую пробу ароматизатора помещают во флакон (микровиалу). Микрошприц промывают три раза анализируемой пробой. Помещают иглу шприца в испаритель на полную длину и быстро вводят пробу. Регистрируют время удерживания и площадь пика этилового спирта.
Обобщенная хроматограмма пищевого ароматизатора приведена на рисунке 2.
1 — этиловый спирт; 2 — 6 - вкусоароматические вещества
Рисунок 2 — Общий вид хроматограммы пищевого ароматизатора
Анализ проводят в условиях, регламентированных в 6.3.3, выполняя два параллельных определения в условиях повторяемости.
6.7 Обработка результатов
Обработку результатов измерений выполняют, используя программное обеспечение автоматического интегратора или персонального компьютера в соответствии с инструкциями по их эксплуатации.
Массовую долю этилового спирта в анализируемой пробе ароматизатора X1, %, определяют согласно графику градуировочной зависимости по 6.5 с точностью до первого десятичного знака.
6.8 Контроль точности результатов измерений
За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение X1ср, %, двух параллельных определений массовой доли этилового спирта, полученных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости
(X1макс — X1мин)100/X1ср <= r, (2)
где X1макс — максимальная массовая доля этилового спирта в пробе;
X1мин — минимальная массовая доля этилового спирта в пробе;
X1ср — среднее значение двух параллельных измерений массовой доли этилового спирта в пробе;
r — значение предела повторяемости, %, приведенное в таблице 2.
| Предел повторяемости r, % отн., при P = 0,95 | Предел воспроизводимости R, % отн., при P = 0,95 | Показатель точности (границы относительной погрешности) +/- \delta , %, при P = 0,95 |
|---|---|---|
| 10 | 12 | 15 |
Результат анализа представляют в виде
\text{Х}_{1\text{ср}} \pm 0,01\delta\text{Х}_{1\text{ср}}\text{при Р } = 0,95, (3)
где X1ср — среднеарифметическое значение результатов двух определений, признанных приемлемыми, %;
\delta — границы относительной погрешности измерений, %.
Пределы повторяемости r и воспроизводимости R, а также показатель точности \delta для диапазона измерений массовой доли этилового спирта от 1,0% до 90,0% представлены в таблице 2.
7 Определение содержания этилового спирта ферментативным методом
Метод предназначен для определения массовой доли этилового спирта в жидких и пастообразных ароматизаторах. Диапазон измерения массовой доли этилового спирта от 0,002% до 12,000%.
7.1 Сущность метода
Метод основан на окислении этилового спирта в присутствии никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и алкогольдегидрогеназы (АДГ), дальнейшем окислении образовавшегося ацетальдегида в присутствии альдегиддегидрогеназы (АЛДГ) до уксусной кислоты и фотометрическом измерении массовой доли образовавшегося никотинамидадениндинуклеотида (восстановленная форма) (НАДH), эквивалентного массовой доле этилового спирта в соответствии с уравнениями (4), (5).
\text{Этанол} + \text{НАД}^{+} \leftarrow ^{\text{АДГ}} \rightarrow \text{Ацетальдегид} + \text{НАДН } + \text{Н}^{+}; (4)
\text{Ацетальдегид} + \text{НАД}^{+} \leftarrow ^{\text{АЛДГ}} \rightarrow + \text{Н}_{2}\text{О Уксусная кислота} + \text{НАДН } + \text{Н}^{+}. (5)
7.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы
Весы со значением среднего квадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,3 мг, и погрешностью от нелинейности +/- 0,6 мг.
Спектрофотометр с диапазоном измерения длин волн от 210 до 700 нм, допустимой абсолютной погрешностью коэффициента пропускания не более 1%, спектральной шириной не более 1 нм.
Дозаторы пипеточные объемами 0,5; 0,1; 0,05 см3 и относительной погрешностью +/- 1%.
Секундомер 2-го класса точности с емкостью шкалы счетчика 30 мин, ценой деления 0,20 с, погрешностью +/- 0,60 с.
Пипетки 2-1-10; 2-1-15 по ГОСТ 29169.
Колбы 2-250-2; 2-500-2; 2-1000-2 по ГОСТ 1770.
Кюветы фотометрические из оптического стекла или полистирола (одноразовые) толщиной поглощающего слоя 1 см для измерений при длинах волн 334, 340 или 365 нм.
Шпатели пластиковые одноразовые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 10 до 15 см для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
Бумага индикаторная универсальная для интервала измерений активной кислотности от 1 до 10 ед. pH.
Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493, ч.д.а.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч.
Аммоний сернокислый по ГОСТ 3769, ч.д.а.
Алкогольдегидрогеназы ЕС1.1.1.1 лиофилизат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, активностью 4500 мкмоль·мин-1.
Альдегиддегидрогеназы ЕС1.2.1.5 лиофилизат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, активностью 5,6 мкмоль·мин-1.
Никотинамидадениндинуклеотид фосфат с содержанием основного вещества не менее 98%.
Спирт этиловый ректификованный высшей очистки по ГОСТ 18300.
Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.
7.3 Подготовка к анализу
7.3.1 Приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации c(1/2 H2SO4) = 2 моль/дм3
Раствор серной кислоты молярной концентрации c(1/2 H2SO4) = 2 моль/дм3 готовят по ГОСТ 25794.1 в колбе вместимостью 1000 см3 разбавлением 58,0 см3 серной кислоты плотностью 1,830 г/см3 или 57,2 см3 серной кислоты плотностью 1,835 г/см3 дистиллированной водой до объема 1000 см3 или из стандарт-титра молярной концентрации c(1/2 H2SO4) = 0,1 моль/дм3, переводя количественно содержимое двух ампул в мерную колбу вместимостью 100 см3 и добавляя дистиллированную воду до метки.
Срок хранения раствора при температуре (20 +/- 2) °C — не более 6 мес.
7.3.2 Приготовление раствора аммония сернокислого молярной концентрации c(1/2 (NH4)2SO4) = 2,2 моль/дм3
В мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 1000 см3 вносят 299,55 г аммония сернокислого, добавляют 300 см3 дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре (20 +/- 2) °C — не более 6 мес.
7.3.3 Приготовление буферного раствора
В мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 50 см3 вносят 8,3 г фосфорнокислого калия двузамещенного 3-водного, добавляют 40 см3 дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят значение pH раствора до 9,0 ед. pH раствором серной кислоты по 7.3.1. Доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Срок хранения буферного раствора при температуре (4 +/- 1) °C — не более 6 мес.
7.3.4 Приготовление суспензии АДГ
В мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 5 см3 вносят 0,125 г АДГ лиофилизата и добавляют до метки раствор аммония сернокислого по 7.3.2, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Срок хранения суспензии АДГ при температуре (4 +/- 1) °C — не более 2 мес.
7.3.5 Приготовление реакционной смеси
0,0028 г АЛДГ лиофилизата и 0,028 г НАД растворяют в 7 см3 буферного раствора по 7.3.3.
Срок хранения раствора при температуре (4 +/- 1) °C — не более 24 ч.
7.3.6 Приготовление раствора этилового спирта
0,060 г этилового ректификованного спирта высшей очистки вносят в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 1 дм3 и доводят объем до метки дистиллированной водой.
Срок хранения раствора при температуре (4 +/- 1) °C — не более 1 мес.
7.3.7 Проверка активности реактивов
7.3.7.1 Проверку активности ферментов проводят при приготовлении каждой новой порции реактивов, хранении готовых реактивов без использования более двух недель или нарушении условий хранения.
7.3.7.2 Для проверки активности ферментов в две фотометрические кюветы последовательно дозируют по 3,0 см3 реакционной смеси по 7.3.5. Затем в кювету № 1контр (А1контр) добавляют 0,1 см3 дистиллированной воды, а в кювету № 2пров (А1пров) — 0,1 см3 раствора этилового спирта по 7.3.6. Содержимое кювет перемешивают пластиковым шпателем и оставляют при температуре от 20 °C до 25 °C на 3 мин (по секундомеру). Измеряют оптическую плотность полученного раствора относительно оптической плотности воды.
Затем в обе кюветы добавляют по 0,05 см3 суспензии АДГ по 7.3.4. Содержимое кювет перемешивают пластиковыми шпателями и оставляют при температуре от 20 °C до 25 °C на 15 мин (по секундомеру). Измеряют оптическую плотность содержимого в кювете № 1контр (А1контр) и № 2пров (А2пров) относительно оптической плотности воды.
7.3.7.3 Обработка и оформление результатов измерений
Изменение оптических плотностей, которые вызваны окислением этилового спирта до ацетальдегида и уксусной кислоты, (\Delta\text{А}) вычисляют по формуле
\Delta\text{А } = (\text{А}_{2\text{пров}} - \text{А}_{1\text{пров}}) - (\text{А}_{2\text{контр}} - \text{А}_{1\text{контр}}), (6)
где А2пров — оптическая плотность реакционной смеси с АДГ в кювете № 2пров;
А1пров — оптическая плотность реакционной смеси в кювете № 1пров;
А2контр — оптическая плотность реакционной смеси с АДГ в кювете № 2контр;
А1контр — оптическая плотность реакционной смеси в кювете № 1контр.
Массовую концентрацию этилового спирта в растворе по 7.3.6 X3, г/дм3, вычисляют по формуле
X_{3} = \frac{V_{1}M}{\epsilon d \cdot 2 \cdot V_{2} \cdot 100} \Delta A, (7)
где V1 — общий объем раствора в кювете по 7.3.7.2, см3; V1 = 3,15 см3;
M — молярная масса этилового спирта, г/моль; M = 46,07 г/моль;
\epsilon — молярный коэффициент поглощения НАДH, дм3·см-1·ммоль-1; \epsilon = 6,30 при длине волны 340 нм; \epsilon = 3,40 при длине волны 334 нм; \epsilon = 6,18 при длине волны 360 нм;
d — толщина поглощающего слоя в кювете, см; d = 1 см;
2 — количество молекул НАДH, образующихся при окислении одной молекулы этилового спирта;
V2 — объем раствора этилового спирта в кювете по 7.3.7.2, см3; V2 = 0,1 см3;
1000 — коэффициент пересчета моль в ммоль;
\Delta A — изменение оптических плотностей, рассчитанное по формуле (6).
Вычисления проводят до третьего десятичного знака.
Измеренное содержание этилового спирта в растворе по 7.3.6 должно составлять (0,057 +/- 0,003) г/дм3. Если содержание этилового спирта составляет менее (0,057 +/- 0,003) г/дм3, то измерение следует повторить со свежеприготовленными растворами реактивов.
7.3.8 Приготовление раствора ароматизатора
Пробу жидкого или пастообразного ароматизатора, взвешенную с записью результата до четвертого десятичного знака, вносят в мерную колбу и доводят объем до метки дистиллированной водой. Массу пробы, вместимость колбы и коэффициент разбавления выбирают таким образом, чтобы массовая концентрация этилового спирта в анализируемом растворе была в интервале от 0,02 до 0,12 г/дм3 (см. таблицу 3).
Для предотвращения испарения этилового спирта при приготовлении растворов в мерную колбу сначала вносят дистиллированную воду в количестве, равном половине объема колбы, а затем вносят анализируемый раствор, помещая конец пипетки с анализируемым раствором ниже поверхности воды в колбе, после чего доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу притертой пробкой и тщательно перемешивают.
7.4 Проведение анализа
В две фотометрические кюветы последовательно дозируют по 3,0 см3 реакционной смеси по 7.3.5. Затем в кювету № 1 (А1контр) добавляют 0,1 см3 дистиллированной воды, а в кювету № 2 (А1опыт) — 0,1 см3 анализируемого раствора ароматизатора. Содержимое кювет перемешивают пластиковыми шпателями и оставляют при температуре от 20 °C до 25 °C на 3 мин (по секундомеру). Измеряют оптическую плотность растворов относительно оптической плотности воды.
Затем в обе кюветы добавляют по 0,05 см3 суспензии АДГ по 7.3.4. Содержимое кювет перемешивают пластиковыми шпателями и оставляют при температуре от 20 °C до 25 °C на 15 мин (по секундомеру). Измеряют оптическую плотность содержимого в кювете № 1 (А2контр) и № 2 (А2опыт) относительно оптической плотности воды.
7.5 Обработка и оформление результатов измерений
Изменение оптических плотностей, которые вызваны окислением этилового спирта до ацетальдегида и уксусной кислоты, (\Delta\text{А}) рассчитывают по формуле
\Delta\text{А } = (\text{А}_{2\text{опыт}} - \text{А}_{1\text{опыт}}) - (\text{А}_{2\text{контр}} - \text{А}_{1\text{контр}}), (8)
где А2опыт — оптическая плотность реакционной смеси с АДГ в опытной кювете;
А1опыт — оптическая плотность реакционной смеси в опытной кювете;
А2контр — оптическая плотность реакционной смеси с АДГ в контрольной кювете;
А1контр — оптическая плотность реакционной смеси в контрольной кювете.
Значение \Delta\text{А} не должно быть менее 0,1 ед. оптической плотности. Если значение \Delta\text{А} менее 0,1 ед. оптической плотности, необходимо повторить анализ, приготовив анализируемый раствор с меньшим разведением.
Массовую долю этилового спирта в пробе ароматизатора X4, %, вычисляют по формуле
X_{4} = \frac{V_{1}M_{n}}{\epsilon d \cdot 2 \cdot V_{2}m \cdot 100} \Delta A \cdot 100 (9)
X_{2} = 72,56 \frac{\Delta A \cdot n}{\epsilon \cdot m} , (10)
где V1 — общий объем раствора в кювете по 7.4, см3; V1 = 3,15 см3;
M — молярная масса этилового спирта, г/моль; M = 46,07 г/моль;
n — коэффициент разбавления пробы по 7.3.7 (см. таблицу 2);
\epsilon — молярный коэффициент поглощения НАДH, дм3·см-1·ммоль-1; \epsilon = 6,30 при длине волны 340 нм; \epsilon = 3,40 при длине волны 334 нм; \epsilon = 6,18 при длине волны 360 нм;
d — толщина поглощающего слоя в кювете, см; d = 1 см;
2 — количество молекул НАДH, образующихся при окислении одной молекулы этилового спирта;
V2 — объем пробы анализируемого раствора в кювете по 7.4, см3; V2 = 0,1 см3;
m — массовая концентрация ароматизатора в анализируемом растворе (см. 7.3.7), г;
1000 — коэффициент пересчета моль в ммоль;
100 — коэффициент пересчета в проценты.
Вычисления проводят до третьего десятичного знака.
7.6 Контроль точности результатов измерений
За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое значение X2ср, %, двух параллельных определений массовой доли этилового спирта, полученных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости
(X2макс — X2мин)100/X2ср <= r, (11)
где X2макс — максимальная массовая доля этилового спирта в пробе;
X2мин — минимальная массовая доля этилового спирта в пробе;
X2ср — среднее значение двух параллельных измерений массовой доли этилового спирта в пробе;
r — значение предела повторяемости, %, приведенное в таблице 2.
Результат анализа представляют в виде
\text{Х}_{2\text{ср}} \pm 0,01\delta\text{Х}_{2\text{ср}}\text{при Р } = 0,95, (12)
где X2ср — среднеарифметическое значение результатов двух определений, признанных приемлемыми, %;
\delta — границы относительной погрешности измерений, %.
Пределы повторяемости r и воспроизводимости R, а также показатель точности \delta для диапазона измерений массовой доли этилового спирта от 0,002% до 12,000% представлены в таблице 4.
| Предел повторяемости r, % отн., при P = 0,95 | Предел воспроизводимости R, % отн., при P = 0,95 | Показатель точности (границы относительной погрешности) +/- \delta , %, при P = 0,95 |
|---|---|---|
| 3 | 5 | 3 |
| УДК: 663.051:006.354 | МКС 67.220.20 |
| Ключевые слова: ароматизаторы пищевые, этиловый спирт, метод газовой хроматографии, ферментативный метод | |